Biosensor do wykrywania bakterii gronkowca opornego na antybiotyki

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest rozróżnienie szczepów Staphylococcus aureus opornych na metycylinę lub MRSA i wrażliwych na metycylinę lub MSSA za pomocą specjalnie dobranego faga antymodyfikowanych bakterii litycznych. Gdy bakterie są przyczepione do długich, elastycznych ogonów faga litycznego, odległość między przyłączonymi komórkami a powierzchnią czujnika jest większa niż penetracja fali akustycznej QC m. W związku z tym sygnał zdarzenia wiążącego nie jest generowany.

Zastąpienie nienaruszonego faga sferoidą skutkuje w pełni funkcjonalnym fagiem o krótkich ogonach, które wiążą bakterie w obrębie głębokości penetracji fali akustycznej QC m, przyczyniając się w ten sposób do zmian częstotliwości i rozpraszania, gdy steroidy fagowe są osadzane na krysztale A-Q-C-M-D i wystawione na działanie mieszanej zawiesiny bakteryjnej, wiążą zarówno szczepy MRSA, jak i MSSA gronkowca złocistego, ale nie inne bakterie oddzielające Staphylococcus aureus od innych bakterii na powierzchni kryształu. Wreszcie, po dodaniu specyficznych dla PPP Mr.RSA dwóch kulek związanych z przeciwciałem A, generowany jest sygnał w obecności szczepów Mr.RSA gronkowca złocistego. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak PCR, polegają na tym, że metoda ta nie wymaga ekstrakcji DNA i nie jest wrażliwa na badania empiryczne.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w badania przesiewowe i dezynfekcję Staphylococcus orus, można ją również zastosować do innych bakterii opornych na antybiotyki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wytwarzanie bioczujników wymaga precyzji, dokładności i cierpliwości. Rozpocznij od oczyszczenia oznaczonych złotem kawałków kwarcu przez wytrawianie plazmowe w Argonne przez 10 minut, a następnie sterylizuj kawałki przez sześć godzin w świetle UV w sterylnej szafce po sterylizacji w 50 mikrolitrach zawiesiny fagowej do złotej powierzchni każdego kawałka na sterylnej szalce Petriego, a następnie inkubuj kawałki przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej następnego ranka, usunąć pozostałą zawiesinę fagową do titteringu, a następnie przemyć każdy kawałek kwarcu związanym fagiem pięć razy za pomocą PBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane fagi.

Aby przetestować zakaźność unieruchomionego faga na suchej powierzchni, najpierw rozprowadź nocną hodowlę gronkowca złocistego na NZY eRate i pozostaw zawiesinę do wyschnięcia. Następnie umieść pokryty złotem kawałek kwarcu z unieruchomionym fagiem twarzą do dołu na płytce. Po 12 godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza można zaobserwować strefę lizy wskazującą na zakaźność w celu zbadania aktywności litycznej wolnego faga w cieczy.

Najpierw dodaj nocną kulturę bakteryjną gronkowca złocistego do 10 mililitrów NZY w każdej z czterech 300-mililitrowych kolb bocznych. Następnie dodać dwa razy 10 do sześciu PFU na mililitr wolnego faga do dwóch kolb. Teraz monitoruj przebieg w czasie lizy komórek gronkowca przez 570 minut, mierząc gęstość optyczną w odstępach 30-minutowych dla każdej kolby, wykonując pomiar końcowy po 24 godzinach.

Aby przetestować aktywność lityczną związanego faga w cieczy, powtórz właśnie zademonstrowane kroki, ale dodaj kawałki złota ze związanym fagiem do eksperymentalnych kolb zamiast wolnego faga. Aby przygotować steroidy fagowe, najpierw połącz 400 mikrolitrów zawiesiny faga 1 2600 z równą objętością widm chloroformu klasy fotometrycznej w fiolce o pojemności jednego mililitra w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie zwiruj zawiesinę chloroformu fagowego pięć do sześciu razy w odstępach pięciosekundowych w ciągu jednej minuty.

Po ustabilizowaniu się zawiesiny przez 30 sekund, należy zebrać górną frakcję zawierającą zawiesinę steroidową. Przenieś kilka mikrolitrów zawiesiny steroidowej do fiolki o pojemności 500 mikrolitrów do transmisji i skaningowej mikroskopii elektronowej. Zapisz pozostałą zawiesinę steroidów w fiolce o pojemności jednego mililitra do produkcji bioczujników.

Aby przygotować bioczujnik, najpierw wyczyść czujniki QCMD poprzez wytrawianie plazmowe w argonie przez 10 minut w odkurzaczu plazmowym. Następnie przepłucz czujniki heksanem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia organiczne. Następnie wyczyść koryto równowagi folii, jak wcześniej opisał Olson Etal w Journal of Microbiological methods.

Wypełniając koryto LB roztworem podfazowym i czyszcząc je barierą korytową. Następnie ustabilizuj koryto w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 10 minut. Teraz utwórz monowarstwę fagową na roztworze podfazy LB, ostrożnie wlewając 300 mikrolitrów Eloqua zawiesiny wodnej faga 1 2600 za pomocą nachylonego pręta ze szkła jadalnego, który jest częściowo zanurzony w fazie SOPH Po pozostawieniu monowarstwy do ustabilizowania się przez 10 minut, ściskaj monowarstwę z prędkością 30 milimetrów na minutę, aż do osiągnięcia stałego ciśnienia 19 niutonów na metr.

Pionowe osadzanie filmu jest najtrudniejszą częścią tej procedury. Aby zapewnić sukces, należy upewnić się, że wszystkie elementy tej procedury są czyste, a także zoptymalizować parametry osadzania jednowarstwowego. Teraz zanurz czujnik w monowarstwie siedem razy z rzędu z prędkością 4,5 milimetra na minutę, aby wykonać pionowe osadzanie filmu.

Na prostopadle ustawiony czujnik QCMD. Pionowe osadzanie filmu wiąże nienaruszony z powierzchnią biosensora. Na koniec użyj sfabrykowanych bioczujników fagowych do wykrywania MRSA, mikroskopii elektronowej i optometrii el zarówno wolnego, jak i związanego faga.

Rozpocznij ten krok od ustalenia linii bazowych, częstotliwości rezonansowej i rozpraszania energii czujnika QCM w wodzie za pomocą oprogramowania qof T. Po około 30 minutach pobrać zawiesinę żywych komórek gronkowca złocistego wrażliwego na metycylinę lub komórek bakteryjnych MSSA w wodzie przez komórkę testową. Niebieska linia wyświetla wartość częstotliwości, podczas gdy czerwona linia pokazuje poziom rozpraszania energii.

Linie poziome pokazują ustanowienie linii bazowej. Cyfra dwa na środku ekranu oznacza, że zdarzenia są powiązane z czujnikiem. Numer dwa z czterech stale monitorują zmiany częstotliwości rezonansu i rozpraszania energii przez czujniki dla pierwszego pokazanego alikwotu.

Oto zmiany po tym, jak bakterie przejdą komórkę testową. Należy zauważyć, że wystarczy kilka sekund, aby częstotliwość zmniejszyła się, a rozpraszanie energii wzrosło, gdy zmiany częstotliwości rezonansu czujników i rozpraszania energii wewnętrznej osiągną poziomy nasycenia przy zawieszeniu prędkości lateksu sprzężonego z przeciwciałem PVP do przepływu i kontynuują ciągłe monitorowanie rozpraszania częstotliwości. Pokazany jest tutaj cały proces detekcji pokazujący ustalenie linii bazowych, kilkusekundową zmianę częstotliwości i rozpraszania energii po dodaniu bakterii, nasycenie, a na końcu zmiany po dodaniu kulek.

Poniższa tabela przedstawia wykazaną aktywność lityczną fagów wobec wszystkich badanych szczepów S reus, w tym szczepów MRSA, jak wskazano w teście plamkowym fagowym. Rozmiary blaszek na ogół wahały się od pięciu do 15 milimetrów. Nie stwierdzono żadnej aktywności w stosunku do innych badanych kultur.

Tutaj wykazano normalny wzrost gronkowca Urus A TCC 1 2600 w pożywce NZ Y na inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przy wzroście liczby bakterii od 3,2 razy 10 do sześciu do 4,0 razy 10 do ośmiu CFU na mililitr. W ciągu około 24 godzin unieruchomiony na złotej powierzchni wykazywał podobną aktywność lityczną do aktywności faga w zawiesinie. Unieruchomiony pozostał zakaźny w świeżej infekcji bakteryjnej nawet po użyciu w 24-godzinnym eksperymencie hodowlanym, kilku myciach i przechowywaniu w PBS przez sześć dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Na tym obrazie można zaobserwować lizosom wokół kawałka złota, co wskazuje, że unieruchomione fagi są zdolne do lizy komórek bakteryjnych. Dlatego, jak pokazano tutaj, efektywne zmniejszenie wzrostu bakterii stwierdzone w kokulturze bakterii i zdemobilizowanego faga jest wynikiem pierwotnej interakcji bakterii zawieszonych w wodzie i związanego faga. Tutaj transmisyjne i skaningowe mikrografie elektronowe nienaruszonego faga litycznego 1 2600 na powierzchni złotego podłoża są pokazane, gdy zawiesina faga jest poddawana działaniu chloroformu, ogon faga kurczy się i gęstnieje, a wielokątna głowa staje się zaokrąglona lub steroidowa.

Pomimo istotnych zmian strukturalnych. Aktywność lityczna steroidu mierzona liczbą blaszek nie zmieniła się w wyniku leczenia chloroformem. Czujniki QCM z unieruchomionymi fagami litycznymi nie wykazały znaczących zmian w częstotliwości rezonansowej lub rozpraszaniu energii, gdy były wystawione na działanie MRSA, co wskazuje, że interakcja faga MRSA spowodowała zmianę masy nom.

Jednak według QCM mikrofotografie elektronowe bioczujników po teście wykazały znaczne wiązanie bakterii na powierzchni czujnika. Gdy zawiesiny MRSA wstrzyknięto do komórki przepływowej za pomocą biosensorów steroidowych fagów, zaobserwowano znaczny spadek częstości występowania i wzrost dyssypacji. Po interakcjach wiążących MRSA z bakteriami fagowymi sphero, czujniki testowe wystawiono na działanie zawiesin lateksowych sprzężonych z przeciwciałem BBP two A.

Te bioczujniki do testów MRSA zareagowały na zawiesiny prędkości lateksu sprzężone z przeciwciałem BPP dwa A, ponieważ zaobserwowano dalszy spadek częstości i wzrost dyssypacji. Wiązanie MSA z sondami fagowymi i prędkościami lateksu sprzężonymi z przeciwciałem PPP dwa A potwierdzono za pomocą badań skaningowej mikroskopii elektronowej. Gdy bioczujnik steroidów fagowych był wystawiony na MSSA, zaobserwowano znaczny spadek częstości i wzrost dyssypacji po interakcjach wiążących MSSA steroidu fagowego, czujniki testowe poddano próbie zawiesin prędkości PPP dwóch przeciwciał A sprzężonych z lateksem.

Początkowo bioczujnik testowy MSSA wykazywał krótkie przejściowe wzrosty częstości i spadki dyssypacji po kilku minutach interakcji MSSA i PPP z dwoma przeciwciałami A sprzężonymi z lateksem. Jednak częstotliwość powróciła do dwóch poziomów wprowadzenia przeciwciał A po PVP, ale energia deci wzrosła. Wiązanie MSSA z sondami fagowymi analizowano następnie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, ale nie zaobserwowano tutaj wiązania między MSSA i PPP o dwóch prędkościach lateksu sprzężonych z przeciwciałem A, pokazano symetryczny profil grubości elipów i mapę grubości 3D faga litycznego.

W celu wygenerowania profilu grubości narysowano linię w poprzek mapy grubości. Te ostatnie obrazy pokazują reprezentatywne obrazy MRSA z kamery optycznej CCD uchwycone przez fagi związane ze złotą powierzchnią czujnika A-Q-C-M-D oraz profile intensywności 3D MRSA na unieruchomionych szklanych podłożach fagowych w stężeniu od 10 do ośmiu CFU na mililitr i od 10 do dziewięciu CFU na mililitr. Każdy okrągły okrąg reprezentuje pojedynczą bakterię.

Oczywiste jest, że wzrost stężenia bakterii w płynnej zawiesinie z 10 do ośmiu CFU na mililitr do 10 do 9 CFU na mililitr powoduje znaczny wzrost wychwyconych bakterii w profilach intensywności 3D. Liczba białych pików na górnej warstwie jest proporcjonalna do liczby wychwyconych bakterii i zgodnie z oczekiwaniami gęstość pików znacznie wzrasta, gdy ekspozycja na bakterie wzrasta z 10 do ośmiu do 10 do dziewięciu CFU na mililitr. Dolna ciemnoniebieska warstwa odpowiada warstwie fagowej stykającej się ze złotym podłożem.

W miarę wychwytywania większej liczby bakterii właściwości optyczne fagów zmieniają się, ponieważ wiążą one bakterie, co skutkuje ciemniejszym, bardziej intensywnym niebieskim kolorem. Postępując zgodnie z tą procedurą, możemy zdefiniować skuteczność wychwytywania bakterii, aby zrozumieć interakcje bakterii fagowych po opracowaniu. Technika ta wskazuje naukowcom zajmującym się terapią fagową bakterii drogę do zbadania hamowania patogenów u zwierząt i ludzi Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi w bakteriach chorobotwórczych może być niezwykle niebezpieczna, a przestrzeganie ścisłych przepisów jest bardzo ważne.