Biosensor do wykrywania bakterii gronkowca opornego na antybiotyki

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest rozróżnienie szczepów Staphylococcus aureus opornych na metycylinę (MRSA) oraz wrażliwych na metycylinę (MSSA) za pomocą specjalnie wybranych zmodyfikowanych litycznych bakteriofagów. Gdy bakterie przyłączają się do długich, elastycznych ogonków faga litycznego, odległość między przyłączonymi komórkami a powierzchnią czujnika jest większa niż głębokość penetracji fali akustycznej QC m. W związku z tym sygnał zdarzenia wiązania nie jest generowany.

Zastąpienie nienaruszonego faga sferoidem prowadzi do powstania w pełni funkcjonalnego faga o krótkich ogonkach, które wiążą bakterie w obrębie głębokości penetracji fali akustycznej QCM, przyczyniając się tym samym do zmian częstotliwości i dyssypacji. Gdy fagi sferoidalne są osadzane na krysztale A-Q-C-M-D i wystawione na działanie mieszanej zawiesiny bakteryjnej, wiążą one szczepy MRSA i MSSA Staphylococcus aureus, ale nie inne bakterie, co pozwala na oddzielenie Staphylococcus aureus od pozostałych bakterii na powierzchni kryształu. W końcowym etapie, po dodaniu kulek związanych z przeciwciałem PPP two A specyficznym dla MRSA, generowany jest sygnał w obecności szczepów MRSA Staphylococcus aureus. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak PCR, jest brak konieczności ekstrakcji DNA oraz brak wrażliwości na empiryki.

Choć metoda ta pozwala na analizę przesiewową i dezynfekcję Staphylococcus aureus, może być ona również zastosowana do innych bakterii opornych na antybiotyki. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ wytwarzanie biosensorów wymaga precyzji, dokładności i cierpliwości. Pracę należy rozpocząć od oczyszczenia kawałków kwarcu pokrytych złotem poprzez trawienie plazmowe w Argonie przez 10 minut, a następnie sterylizacji elementów przez sześć godzin pod światłem UV w komorze sterylnej; po sterylizacji należy nanieść 50 µL zawiesiny fagowej na złotą powierzchnię każdego elementu w sterylnym szalce Petriego, a następnie inkubować elementy przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej. Następnego ranka należy zebrać pozostałą zawiesinę fagową do miareczkowania, a następnie pięciokrotnie przemyć każdy kawałek kwarcu z przywiązanymi fagami za pomocą PBS, aby usunąć wszystkie nieprzywiązane fagi.

Aby przetestować zakaźność unieruchomionych fagów na suchej powierzchni, należy najpierw wysiać nocną kulturę staphylococcus aureus na agar NZY eRate i pozwolić zawiesinie wyschnąć. Następnie należy położyć kawałek kwarcu pokryty złotem z unieruchomionymi fagami stroną aktywną do dołu na płytkę. Po 12 godzinach w temperaturze 37 °C można zaobserwować strefę lizy świadczącą o zakaźności, aby przetestować aktywność lityczną wolnych fagów w cieczy.

Najpierw do każdej z czterech kolb z bocznym wlotem o pojemności 300 ml dodaj 10 ml pożywki NZY i nocną kulturę bakteryjną staphylococcus aureus. Następnie do dwóch z kolb dodaj wolne fagi w stężeniu 2 × 10⁶ PFU/ml. Monitoruj następnie przebieg lizy komórek staphylococcus przez 570 minut, mierząc gęstość optyczną w odstępach 30-minutowych dla każdej kolby, wykonując pomiar końcowy po 24 godzinach.

Aby przetestować aktywność lityczną związanych fagów w cieczy, należy powtórzyć przedstawione kroki, dodając do kolb eksperymentalnych cząsteczki złota z związanymi fagami zamiast wolnych fagów. W celu przygotowania sterylizowanych fagów, najpierw należy połączyć 400 µL zawiesiny stockowej faga 1 2600 z równą objętością chloroformu klasy spektrofotometrycznej w fiolce o pojemności 1 mL w temperaturze pokojowej. Następnie należy delikatnie wymieszać zawiesinę fagi i chloroformu na wirówce typu vortex pięć do sześciu razy w odstępach pięciosekundowych przez jedną minutę.

Po odczekaniu 30 sekund w celu ustabilizowania zawiesiny, należy zebrać górną frakcję zawierającą zawiesinę steroidową. Przenieść kilka mikrolitrów zawiesiny steroidowej do fiolki o pojemności 500 µL w celu wykonania transmisyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Pozostałą zawiesinę steroidową należy przechować w fiolce o pojemności 1 mL do produkcji biosensorów.

Aby przygotować biosensor, najpierw oczyść sensory QCMD poprzez trawienie plazmowe w argonie przez 10 minut w czyszczarce plazmowej. Następnie wypłucz sensory heksanem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia organiczne. W kolejnym kroku oczyść korytko wagi filmowej zgodnie z wcześniejszym opisem Olson Etal w Journal of Microbiological methods.

Napełnij koryto LB roztworem podłoża i oczyść je za pomocą zapory koryta. Następnie stabilizuj koryto w temperaturze 20 °C przez 10 minut. Utwórz monowarstwę fagów na roztworze podłoża LB, ostrożnie nakraplając 300 µL wodnej zawiesiny faga 1 2600 za pomocą nachylonej szklanej rurki, która jest częściowo zanurzona w fazie podłoża. Po ustabilizowaniu monowarstwy przez 10 minut, ściśnij ją z prędkością 30 mm/min, aż do osiągnięcia stałego ciśnienia rzędu 19 N/m.

Pionowe nanoszenie warstwy jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Aby zapewnić sukces, należy upewnić się, że wszystkie komponenty wykorzystywane w tej procedurze są czyste, a parametry nanoszenia monowarstwy zostały zoptymalizowane. Następnie zanurzaj i wyjmuj sensor z monowarstwy siedem razy pod rząd z prędkością 4,5 mm/min, aby przeprowadzić pionowe nanoszenie warstwy.

Na prostopadle ustawiony sensor QCMD. Pionowe osadzanie filmu wiąże nienaruszone fagi z powierzchnią biosensora. Na koniec należy wykorzystać wykonane biosensory fagowe do detekcji MRSA, mikroskopii elektronowej oraz el-optometrii zarówno wolnych, jak i związanych fagów.

Krok ten należy rozpocząć od ustalenia linii bazowych, częstotliwości rezonansowej oraz dyssypacji energii czujnika QCM w wodzie przy użyciu oprogramowania qof T. Po około 30 minutach należy przepuścić przez komorę pomiarową zawiesinę żywych komórek bakterii gronkowca złocistego wrażliwego na metycylinę (MSSA) w wodzie. Niebieska linia reprezentuje wartość częstotliwości, natomiast czerwona linia obrazuje poziom dyssypacji energii.

Linie poziome wskazują na ustanowienie linii bazowej. Cyfra dwa w środku ekranu oznacza, że zdarzenia odnoszą się do sensora. Dwa z czterech sensorów stale monitorują zmiany częstotliwości rezonansowej i rozpraszania energii dla pokazanego pierwszego tonu harmonicznego.

Oto zmiany po przejściu bakterii przez komórkę testową. Należy zauważyć, że spadek częstotliwości i wzrost rozpraszania energii następują w ciągu zaledwie kilku sekund, gdy zmiany częstotliwości rezonansowej i wewnętrznego rozpraszania energii czujników osiągają poziomy nasycenia w zawiesinie lateksu sprzężonego z przeciwciałem PVP, która płynie w strumieniu, podczas ciągłego monitorowania częstotliwości i rozpraszania. Przedstawiony tutaj cały proces detekcji pokazuje ustanowienie linii bazowych, kilkusekundową zmianę częstotliwości i rozpraszania energii po dodaniu bakterii, nasycenie, a na koniec zmiany po dodaniu kulek.

Tabela ta przedstawia wykazaną aktywność lityczną fagów przeciwko wszystkim badanym szczepom S reus, w tym szczepom MRSA, co zostało wykazane w teście plamkowym fagów. Wielkość placków mieściła się zazwyczaj w przedziale od 5 do 15 mm. Nie stwierdzono aktywności wobec pozostałych kultur testowych.

W niniejszym doświadczeniu zaprezentowano prawidłowy wzrost szczepu staphylococcus Urus A TCC 1 2600 w pożywce NZ Y w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C, przy czym liczba bakterii wzrosła z 3,2 × 10⁶ do 4,0 × 10⁸ CFU/mL. W ciągu około 24 godzin fagi unieruchomione na złotej powierzchni wykazały aktywność lityczną podobną do aktywności fagów w zawiesinie. Unieruchomione fagi zachowały zdolność do infekcji świeżej hodowli bakteryjnej nawet po zastosowaniu w 24-godzinnym eksperymencie wzrostu, kilkukrotnym przemyciu i przechowywaniu w PBS przez sześć dni w temperaturze 4 °C.

Na tym obrazie można zaobserwować lizosom wokół fragmentu złota, co wskazuje, że unieruchomione fagi są zdolne do lizy komórek bakteryjnych. Zatem, jak tu zilustrowano, efektywny spadek wzrostu bakterii stwierdzony w ko-kulturze bakterii i unieruchomionego faga jest wynikiem pierwotnej interakcji bakterii zawieszonych w wodzie i związanego faga. Przedstawiono tutaj mikrografie transmisyjne i skaningowe nienaruszonego faga litycznego 1 2600 na powierzchni podłoża złota; gdy zawiesina fagów zostaje poddana działaniu chloroformu, ogon faga skraca się i pogrubia, a wieloboczna głowa staje się zaokrąglona lub steroidowa.

Pomimo znaczących zmian strukturalnych, aktywność lityczna steroidu, mierzona liczbą placków, nie uległa zmianie w wyniku traktowania chloroformem. Czujniki QCM z unieruchomionymi fagami litycznymi nie wykazały istotnych zmian częstotliwości rezonansowej ani dyssypacji energii po wystawieniu ich na działanie MRSA, co wskazuje, że interakcja faga z MRSA nie spowodowała zmiany masy.

Zgodnie z danymi z QCM, mikrografie elektronowe biosensorów po przeprowadzeniu analizy wykazały jednak znaczną liczbę bakterii związanych z powierzchnią sensora. Po wstrzyknięciu zawiesin MRSA do komory przepływowej z biosensorami opartymi na fagach steroidowych zaobserwowano znaczny spadek częstotliwości oraz wzrost dysypacji. Po interakcjach wiązania bakterii MRSA z fagami sferoidalnymi, sensory analityczne poddano działaniu zawiesin lateksowych z koniugatem przeciwciała BBP two A.

Te biosensory do analizy MRSA zareagowały na zawiesiny kulek lateksowych sprzężonych z przeciwciałem BPP two A, co objawiło się dalszym spadkiem częstotliwości oraz wzrostem dyssypacji. Wiązanie MSA z sondami fagowymi i kulkami lateksowymi sprzężonymi z przeciwciałem PPP two A zostało potwierdzone za pomocą badań z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej. Po wystawieniu biosensora fagowego na działanie MSSA zaobserwowano znaczny spadek częstotliwości oraz wzrost dyssypacji wynikający z oddziaływań wiążących faga z MSSA; następnie biosensory poddano działaniu zawiesin kulek lateksowych sprzężonych z przeciwciałem PPP two A.

Początkowo biosensor w teście MSSA wykazał krótkotrwałe zwiększenie częstotliwości oraz zmniejszenie dyssypacji po kilku minutach oddziaływań kulek lateksowych sprzężonych z przeciwciałem PPP two A oraz MSSA. Jednakże częstotliwość powróciła do poziomu z momentu po wprowadzeniu przeciwciała PVP two A, natomiast energia dyssypacji wzrosła. Następnie wiązanie MSSA z sondami fagowymi przeanalizowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, jednak nie zaobserwowano wiązania między MSSA a kuleczkami lateksowymi sprzężonymi z przeciwciałem PPP two A; przedstawiono profil grubości ellipsometrycznej oraz trójwymiarową mapę grubości faga litycznego.

W celu wygenerowania profilu grubości na mapie grubości wykreślono linię. Ostatnie obrazy przedstawiają reprezentatywne zdjęcia z optycznej kamery CCD dla MRSA wychwyconego przez fagi związane ze złotą powierzchnią czujnika A-Q-C-M-D oraz trójwymiarowe profile intensywności MRSA na szklanych podłożach z unieruchomionymi fagami przy stężeniu 10⁸ CFU/ml oraz 10⁹ CFU/ml. Każde okrągłe koło reprezentuje pojedynczą bakterię.

Jasno widać, że zwiększenie stężenia bakterii w zawiesinie płynnej z 10⁸ CFU/ml do 10⁹ CFU/ml skutkuje znacznym wzrostem liczby wychwyconych bakterii w trójwymiarowych profilach intensywności. Liczba białych pików na górnej warstwie jest proporcjonalna do liczby wychwyconych bakterii i, zgodnie z oczekiwaniami, gęstość pików wzrasta znacząco, gdy ekspozycja na bakterie zostaje zwiększona z 10⁸ do 10⁹ CFU/ml. Dolna, ciemnoniebieska warstwa odpowiada warstwie fagów w kontakcie z podłożem ze złota.

W miarę wychwytywania kolejnych bakterii właściwości optyczne fagów ulegają zmianie w wyniku wiązania się z nimi, co skutkuje ciemniejszą i bardziej intensywną niebieską barwą. Po przeprowadzeniu tej procedury możemy określić wydajność wychwytywania bakterii, aby zrozumieć interakcje fag-bakteria po etapie rozwoju. Technika ta wskazuje badaczom w dziedzinie terapii fagowej drogę do eksploracji inhibicji patogenów u zwierząt i ludzi. Należy pamiętać, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi w przypadku bakterii patogennych może być niezwykle niebezpieczna, dlatego bardzo ważne jest przestrzeganie surowych przepisów.