Wyznaczanie płaszczyzn wiązania lodu przez białka zapobiegające zamarzaniu za pomocą powinowactwa do płaszczyzny lodu opartej na fluorescencji

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wizualizacja płaszczyzn lodu związanych przez znakowane fluorescencyjnie białka przeciwzamrażające. Osiąga się to poprzez hodowlę pojedynczych kryształów lodu, do których w drugim etapie mogą przyłączyć się białka przeciwzamrażające. Każdy kryształ jest oglądany przez skrzyżowane polaryzatory w celu potwierdzenia jego jednorodności i orientacji.

Następnie kryształ lodu zostaje zamocowany na kontrolowanym temperaturowo chłodzącym palcu i uformowany w półkulę. Następnie jest on zanurzony w roztworze znakowanych fluorescencyjnie białek przeciwzamarzających, aby zaabsorbować białka przeciwzamarzające na specyficznych płaszczyznach wiązania rosnącej półkuli. Wyniki badania lodu uzyskuje się poprzez wizualizację i obrazowanie lodu związanego z fluorescencyjnie znakowanym białkiem przeciwzamarzającym, przy użyciu światła o specyficznej długości fali oraz filtrów w zaciemnionym pomieszczeniu chłodniczym.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak trawienie lodowe, jest to, że białka przeciwzamrażające są znakowane fluorescencyjnie, co umożliwia natychmiastową wizualizację płaszczyzn lodu związanych z białkiem. Rozpocznij wzrost kryształów, przygotowując kąpiel z glikolu etylenowego o kontrolowanej temperaturze minus 0.5 °C i znajdując czystą metalową kuwetę, która pasuje do kąpieli i może w niej pływać. Kryształy są formowane w formach. Użyj form cylindrycznych o wysokości od trzech do czterech centymetrów, wyciętych z rury z polichlorku winylu.

Każda forma powinna posiadać z jednej strony wycięcie o szerokości 1 mm i wysokości 2 mm. Nanieść cienką warstwę smaru próżniowego na ściankę pierścienia, w której wykonano wycięcie. Przykleić tak nasmarowaną powierzchnię z wycięciem do metalnej tacy, kierując wycięcie w stronę przeciwną do centrum tacy.

Należy dopilnować, aby nie wypełniać ani nie blokować nacięć smarem. Przygotować tyle form, ile zmieści się w kuwecie. Następnie do środka kuwety, poza obręb form, dodać przefiltrowany Degas oraz wodę dejonizowaną.

Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. W miarę podnoszenia warstwy wody do wysokości 5 mm, woda powinna powoli wpływać do form przez wycięcia. Po zakończeniu tej czynności należy umieścić kuwetę całkowicie poziomo w kąpieli z glikolem etylenowym.

Po osiągnięciu temperatury minus 0,5 °C w naczyniu i wodzie, dodaj mały kawałek lodu na środek naczynia, poza formy. Inkubuj przez noc, aby w ciągu kolejnych trzech dni wytworzyła się warstwa lodu. Przenieś naczynie z powrotem do kąpieli, aby dolać wodę do form.

Do każdej formy wlej 13 ml odgazowanej i dejonizowanej wody o temperaturze 4 °C. Raz dziennie po dodaniu wody obniżaj temperaturę kąpieli z glikolem etylenowym. Do czwartego dnia formy powinny zostać całkowicie wypełnione lodem.

Wyjmij formy i przygotuj czystą powierzchnię dla lodu. Zdejmij każdą formę z tacy i wypchnij kryształ lodu. Umieść czystą powierzchnię wraz z formami w zamrażarce w temperaturze -20 °C na jedną godzinę.

Przed przystąpieniem do manipulacji. Gdy lód będzie gotowy, należy przenieść go do pomieszczenia z zamrażarką lub chłodni, aby ustalić, czy jest to monokryształ. Umieść lód pomiędzy dwoma skrzyżowanymi polaryzatorami.

Jeśli lód jest monokryształem, nie powinny być widoczne żadne pęknięcia ani nieciągłości, a kierunek światła nie powinien ulegać zmianie w obrębie kryształu. Przy wciąż zamontowanym polaryzatorze należy wyznaczyć orientację osi C, obserwując światło przechodzące podczas obracania lodu. Aby wyznaczyć orientację osi A, lód należy szczelnie zawinąć w folię aluminiową.

Ustaw igłę prostopadle do osi bphosphorylu i wykonaj niewielki otwór przez folię w głąb lodu. Następnie umieść lód w próżni o ciśnieniu 0,5 millibar przez 20 minut. Po wyjęciu kryształu odsłoń go w pomieszczeniu chłodniczym.

Zaobserwuj sześciokątny trawienie na płaszczyźnie podstawowej. A AE przebiegają przez wierzchołki sześcioramiennej gwiazdy. Kryształ ten zostanie przecięty na pół wzdłuż linii równoległej do przeciwległych punktów gwiazdy.

Aby odsłonić główną płaszczyznę pryzmatu, należy stabilnie przymocować kryształ do stołu laboratoryjnego. Za pomocą brzeszczotu przeciąć kryształ na pół. Zebrane fragmenty przeznaczyć do montażu na chłodzaku.

Kryształ lodu musi zostać dalej przygotowany do zamocowania na palcu chłodzącym; należy znaleźć dwa aluminiowe pręty o nieco różnych średnicach, ale o rozmiarach porównywalnych z palcem chłodzącym. Należy naprzemiennie używać prętów do wytopienia otworu w górnej części kryształu, przerywając czynność, gdy powstanie otwór, w którym zmieści się palec chłodzący. Schłodzić palec chłodzący do -0.5 °C i umieścić go w otworze w lodzie.

Przytrzymaj kryształ na miejscu, aż zamarznie i przywrze do metalu. Następnie napełnij półkolisty naczynkę o średnicy około dwa razy większej od średnicy kryształu lodu filtrowaną wodą dejonizowaną schłodzoną do 4 °C. Zanurz zimny palec z przymocowanym kryształem lodu w naczynce, a następnie usuń nadmiar wody tak, aby góra kryształu lodu znajdowała się mniej więcej na poziomie cieczy i lód nie dotykał ścianek.

Ścianki naczynia izolują je, co obniża temperaturę do -5 °C. Pozostaw lód na około godzinę, aż utworzy się półkula. Przygotuj się do dodania białka fluorescencyjnego.

Gdy półsfera będzie gotowa, należy wyjąć kryształ lodu z kubka i usunąć z niego wodę. Następnie dodaje się od 25 do 30 mililitrów schłodzonego roztworu białka znakowanego fluorescencyjnie o pożądanym stężeniu.

Zachowując całkowitą objętość cieczy bez zmian, zanurz kryształ lodu w kubku. Upewnij się, że góra kryształu znajduje się na poziomie cieczy i nie dotyka ścianek kubka. Obniż temperaturę palca chłodzącego do -8 °C i pozostaw roztwór białka, aby zamarzł w krysztale przez dwie do trzech godzin.

Przerwij wzrost lodu, gdy z roztworu białka utworzy się co najmniej 5 mm lodu. Nie odłączając chłodnika, wyjmij kryształ lodu z naczynia. Odłącz chłodnik, podgrzewając chłodziwo do temperatury nieco powyżej 0 °C.

Należy odczekać, aż kryształ lodu się stopi. Gdy kryształ odłączy się od palca chłodzącego, należy położyć go płaską stroną do dołu na czystej powierzchni. Należy uważać, aby nie dotknąć nowo powstałego lodu.

Przechowywać kryształ w temperaturze -20 °C przez co najmniej 20 minut. Przed przystąpieniem do wizualizacji fluorescencji należy pracować w chłodni, którą można zaciemnić. Przygotować lampy z filtrami wzbudzenia o specyficznej długości fali w celu wzbudzenia znacznika fluorescencyjnego oraz filtry emisyjne do kamery. Aby zablokować niespecyficzne światło, należy położyć lód płaską stroną do dołu pod lampami, zaciemnić pomieszczenie i obserwować wzory w oświetlonym lodzie.

Aby oszacować płaszczyzny lodu związane przez białka przeciwzamrożeniowe, należy porównać tradycyjny obraz trawienia lodem z odpowiadającym mu obrazem analizy powinowactwa płaszczyzn lodu opartej na fluorescencji przy użyciu trixy; oba pokazują białka przeciwzamrożeniowe typu 1 produkowane przez flądrę zimową pseudo pectus Americana. Technika ta może być wykorzystana do jednoczesnego porównania wzorców wiązania lodu przez różne białka przeciwzamrożeniowe. W tym przypadku zastosowano białko NFEA FP 8 typu 3 znakowane Pacific Blue oraz białko przeciwzamrożeniowe typu 1 znakowane trixy.

To jest wynik wizualizacji wyłącznie typu trzy N-F-E-A-F-P; tutaj na obrazie zwizualizowano jedynie białko przeciwzamrażające typu jeden. Oba są zwizualizowane razem. Należy zauważyć, że oś C jest taka sama dla każdego obrazu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak hodować i orientować pojedyncze kryształy lodu oraz jak wykorzystać analizę powinowactwa do płaszczyzn lodu opartą na fluorescencji do oceny wzorców wiązania fluorescencyjnie znakowanych białek przeciwzamarzających do płaszczyzn lodu.