Wyznaczanie płaszczyzn wiązania lodu przez białka zapobiegające zamarzaniu za pomocą powinowactwa do płaszczyzny lodu opartej na fluorescencji

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja płaszczyzn lodu związanych przez znakowane fluorescencyjnie białka zapobiegające zamarzaniu. Osiąga się to poprzez hodowlę pojedynczych kryształków lodu, z którymi w drugim etapie mogą wiązać się białka zapobiegające zamarzaniu. Każdy kryształ jest oglądany przez skrzyżowane polaryzatory, aby ustalić jego osobliwość i orientację.

Następnie kryształ lodu jest montowany na zimnym palcu o kontrolowanej temperaturze i formowany w półkulę. Następnie zanurza się go w roztworze znakowanych fluorescencyjnie białek przeciw zamarzaniu w celu wchłonięcia białka zapobiegającego zamarzaniu na określone płaszczyzny wiązania rosnącej półkuli. Wyniki badania lodu uzyskuje się poprzez wizualizację i obrazowanie lodu związanego przez znakowane fluorescencyjnie białko zapobiegające zamarzaniu, przy użyciu światła specyficznego dla długości fali i filtrów w zaciemnionym zimnym pomieszczeniu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak trawienie lodem, jest to, że białka zapobiegające zamarzaniu są znakowane fluorescencyjnie, aby umożliwić natychmiastową wizualizację płaszczyzn lodu związanych z białkami Rozpocznij hodowlę kryształów, przygotowując kąpiel z glikolem etylenowym o kontrolowanej temperaturze w temperaturze minus 0,5 stopnia Celsjusza i znajdując czystą metalową patelnię, która pasuje do niej i może na niej unosić się. Kryształy powstają w formach. Użyj cylindrycznych form o wysokości od trzech do czterech centymetrów wyciętych z rury z polichlorku winylu.

Każda forma powinna mieć z jednej strony wcięcie o szerokości jednego milimetra i wysokości dwóch milimetrów. Nałóż cienką warstwę smaru próżniowego na stronę pierścienia, z której wycięto nacięcie. Uszczelnij tę natłuszczoną, karbowaną powierzchnię na metalowej patelni z nacięciem skierowanym od środka patelni.

Pamiętaj, aby nie wypełniać ani nie zasłaniać nacięć smarem. Przygotuj tyle foremek, ile zmieści się na patelni. Następnie dodaj przefiltrowane Degas i dejonizowaną wodę do środka patelni na zewnątrz foremek.

Uważaj, aby nie wprowadzić żadnych bąbelków. Gdy warstwa wody zostanie podniesiona do pięciu milimetrów, woda powinna powoli wchodzić do form przez nacięcia. Po zakończeniu umieść patelnię idealnie poziomo w kąpieli z glikolem etylenowym.

Gdy patelnia i woda osiągną minus 0,5 stopnia Celsjusza, dodaj mały kawałek lodu na środek patelni na zewnątrz foremek. Inkubuj przez noc, aby uformować warstwę lodu w ciągu następnych trzech dni. Wróć do kąpieli, aby dodać wodę do foremek.

Umieść 13 mililitrów czterech stopni Celsjusza, Degas i dejonizowaną wodę do każdej formy. Raz dziennie po dodaniu wody należy obniżyć temperaturę kąpieli z glikolem etylenowym. Czwartego dnia foremki powinny być całkowicie wypełnione lodem.

Wyjmij foremki i przygotuj czystą powierzchnię na lód. Zdejmij każdą foremkę z patelni i wypchnij kryształki lodu. Umieść czystą powierzchnię z foremkami w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na godzinę.

Przed użyciem. Gdy lód będzie gotowy, zabierz go do zamrażarki lub chłodni, aby ustalić, czy jest to pojedynczy kryształ. Umieść lód między dwoma skrzyżowanymi polaryzatorami.

Jeśli lód jest pojedynczym kryształem, nie powinny być widoczne żadne pęknięcia ani nieciągłości, a kierunek światła w krysztale nie powinien się zmieniać. Gdy polaryzator jest nadal na miejscu, określ orientację osi C, obserwując światło przechodzące, gdy lód jest obracany. Aby określić orientację AE A, owiń lód szczelnie folią aluminiową.

Ustaw igłę prostopadle do osi morza i zrób mały otwór przez folię i w lodzie. Następnie umieść lód w próżni o ciśnieniu 0,5 milibara na 20 minut. Po odzyskaniu kryształu odkryj go w chłodni.

Obserwuj sześciokątne wytrawienie na płaszczyźnie podstawy. AE A przebiegają przez wierzchołki sześcioramiennej gwiazdy. Kryształ ten zostanie przecięty na pół wzdłuż linii równoległej do przeciwległych punktów gwiazdy.

Aby odsłonić pierwotną płaszczyznę pryzmatu, trzymaj kryształ bezpiecznie na ławce. Użyj piły do metalu, aby przeciąć kryształ na pół. Zbierz kawałki do montażu na zimnym palcu.

Kryształ lodu należy dodatkowo przygotować do montażu na zimnym palcu, znaleźć dwa aluminiowe pręty o nieco różnych średnicach, ale porównywalnych wielkością do zimnego palca. Naprzemiennie używaj prętów do stopienia wgłębienia wgłębienia w górnej części kryształowego ogranicznika, gdy istnieje wnęka, w której może zmieścić się zimny palec. Ostudzić zimny palec do minus 0,5 stopnia Celsjusza i umieścić go w jamie lodowej.

Przytrzymaj kryształ na miejscu, aż przymarznie do metalu. Następnie napełnij półkulisty kubek o średnicy około dwukrotnie większej od kryształu lodu przefiltrowaną wodą dejonizowaną schłodzoną do czterech stopni Celsjusza. Zanurz zimny kryształek lodu związany palcami w kubku, usuń nadmiar wody, tak aby górna część kryształu lodu znajdowała się mniej więcej na poziomie cieczy, a lód nie dotykał.

Ścianki kubka pokrywają kubek izolacją i obniżają temperaturę do minus pięciu stopni Celsjusza. Pozwól, aby lód utworzył półkulę przez około godzinę. Przygotuj się do dodania białka fluorescencyjnego.

Kiedy półkula jest gotowa. Usuń kryształki lodu z kubka, usuń wodę z kubka. Następnie dodaj 25 do 30 mililitrów wstępnie schłodzonego, znakowanego fluorescencyjnie roztworu białkowego o pożądanym stężeniu.

Utrzymując całkowitą objętość płynu na niezmienionym poziomie, zanurz kryształki lodu w kubku. Znów. Upewnij się, że górna część kryształu znajduje się na poziomie płynu i nie dotyka ścianek kubka. Obniż temperaturę zimnego palca do minus ośmiu stopni Celsjusza i pozwól roztworowi białka zamarznąć w krysztale na dwie do trzech godzin.

Zatrzymaj wzrost lodu, gdy z roztworu białka utworzy się co najmniej pięć milimetrów lodu. Trzymając zimny palec nadal założony, wyjmij kryształki lodu z kubka. Odłącz zimny palec, podgrzewając płyn chłodzący do temperatury nieco powyżej zera stopni Celsjusza.

Poczekaj, aż kryształek lodu się rozpuści. Gdy kryształ stopi się z zimnego palca, połóż go płaską stroną do dołu na czystej powierzchni. Uważaj, aby nie dotknąć nowo powstałego lodu.

Przechowuj kryształ w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut Przed przystąpieniem do wizualizacji pracy fluorescencji w zimnym pomieszczeniu, które można zaciemnić. Przygotuj lampy z filtrami wzbudzenia specyficznymi dla długości fali do wzbudzenia etykiety fluorescencyjnej i filtrów emisyjnych kamery. Aby zablokować niespecyficzne światło, umieść lód płaską stroną do dołu pod lampami, zaciemnij pomieszczenie i obserwuj wzory w oświetlonym lodzie.

Aby oszacować płaszczyzny lodu, które są związane przez białka zapobiegające zamarzaniu, porównaj tradycyjny obraz trawienia lodu z odpowiednim obrazem powinowactwa płaszczyzny lodu opartej na fluorescencji Analiza powinowactwa przy użyciu trixy pokazuje białka przeciw zamarzaniu typu pierwszego wytwarzane przez flądrę zimową pseudo pectus americana. Technika ta może być wykorzystana do jednoczesnego porównywania wzorców wiązania lodu różnych białek zapobiegających zamarzaniu. W tym przypadku białko niezamarzające typu trzeciego NFEA FP osiem znakowane Pacific Blue i trixy typu pierwszego.

Jest to wynik wizualizacji tylko typu trzeciego N-F-E-A-F-P ósmego, tutaj na tym obrazie wizualizowane jest tylko białko przeciw zamarzaniu typu pierwszego. Oba są wizualizowane razem. Zwróć uwagę, że oś C jest taka sama dla każdego obrazu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i orientować pojedyncze kryształy lodu oraz korzystać z analizy powinowactwa na podstawie fluorescencji równiny lodowej do oceny wzorców wiązania włókien lodowych znakowanych fluorescencyjnie.