Name: Elektroniczny język generujący ciągłe wzorce rozpoznawania do analizy białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę konstrukcji elektronicznego języka do analizy białek z wykorzystaniem obrazowania plazmonowego. Technika ta generuje ciągłe profile ewolucyjne 3D dla skutecznej dyskryminacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować za doktorat z LANEF w Grenoble za wsparcie dla Laurie-Amandine Garçon. Prace te były wspierane finansowo przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-grant 06-NANO-045).

1. Przygotowanie różnych roztworów i próbek białek
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml buforu fosforanowego (PBS-G) zawierającego 50 mM NaH2PO4, 50 mM NaCl i 10% glicerolu o pH 6,8.</li>
	<li>Przygotować 250 ml roztworu buforowego HEPES zawierającego 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20 przy pH 7,4.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy laktozy z bloku budulcowego 1 (BB1) i laktozy siarczanowanej z bloku budulcowego 2 (BB2) (ryc. 1) w stężeniu 0,2 mM w PBS-G.</li>
	<li>Przygotować 1 ml roztworów białkowych w HEPES:lektyna A rachis hypogaea (AHL) przy 500 nM, mioglobina przy 1 μM i lizozym przy 500 nM.</li>
	<li>Przygotuj 20 ml 1% SDS w ultraczystej wodzie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tablicy CoCRR
<ol>
	<li>Oczyść złotą powierzchnię pryzmatu 48 godzin przed użyciem za pomocą myjki plazmowej przez 3 minuty w następujących warunkach: 75% tlenu, 25% argonu, 0,6 mbar, moc 40 W.</li>
	<li>Przygotować jedenaście czystych i zmieszanych roztworów BB1 i BB2 o proporcjach [BB1]/([BB1]+[BB2]) między 0 a 100% w krokach co 10% przy całkowitym stężeniu BB 0,1 mM w PBS-G.</li>
	<li>Umieść 8 nl kropelek tych czystych i zmieszanych roztworów na powierzchni pryzmatu za pomocą bezkontaktowego obserwatora w poczwórnym powiększeniu dla każdego stosunku, w sumie 44 plamki (Rysunek 2). 
	UWAGA: 10% glicerolu dodane do PBS-G jest bardzo ważne dla zmniejszenia parowania rozpuszczalnika i zmiany stężenia BB po osadzaniu.</li>
	<li>Umieść pryzmat wewnątrz szalki Petriego zawierającej 1 ml ultraczystej wody i pozostaw go O/N w temperaturze RT do samodzielnego montażu BB1 i BB2 na złotej powierzchni. W tym miejscu zakłada się, że średni skład powierzchni w zmieszanych SAM odzwierciedla skład mieszanego roztworu do osadzania (rysunek 3)11.</li>
	<li>Dokładnie umyj pryzmat ultraczystą wodą, a następnie wysusz go pod strumieniem argonu.</li>
</ol>
3. Wykrywanie białek przez SPRi
<ol>
	<li>Ustawić inkubator, w którym umieszczony jest aparat SPRi, na temperaturę 25 °C, aby uniknąć zmian współczynnika załamania światła wywołanych zmianami temperatury podczas wykrywania białka.</li>
	<li>Włożyć niefunkcjonalizowany pryzmat płuczący do 10 μl polieteroeteroketonu (PEEK) komory przepływowej podłączonej do sterowanej komputerowo pompy strzykawkowej, odgazowywacza i 6-portowego zaworu wtryskowego średniego ciśnienia (rysunek 4). Napełnić układ przepływowy świeżo przefiltrowanym i odgazowanym buforem biegowym HEPES.</li>
	<li>Wyjmij pryzmat płuczący i włóż pryzmat zawierający matrycę CoCRR do komory przepływowej. Uruchom HEPES z natężeniem przepływu 100 μl/min. Za pomocą kamery CCD usuń wszelkie pęcherzyki powietrza obecne na powierzchni pryzmatu, szybko przechodząc przez działający bufor.</li>
	<li>Zdefiniuj obszar badania dla każdego punktu, rysując okrąg o tej samej średnicy dla obszaru zainteresowania na podstawie dobrze skontrastowanego obrazu tablicy i za pomocą zintegrowanego oprogramowania w systemie SPRi.</li>
	<li>Śledź krzywe plazmonowe, które reprezentują krzywe odbicia w funkcji kąta padania, dla wszystkich plamek.</li>
	<li>Wybierz kąt roboczy (pozycję, w której będą rejestrowane krzywe kinetyczne) na najwyższym nachyleniu krzywych odbicia. Obróć lustro skanujące, aby ustalić wybrany kąt roboczy dla pomiarów kinetycznych.</li>
	<li>Kontynuuj przepuszczanie HEPES przez system przepływu, aż sygnał odbicia dla wszystkich punktów będzie stabilny i stały.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 ml roztworu AHL za pomocą strzykawki do pętli próbki (500 μl) z zaworem iniekcyjnym w pozycji "obciążenie". Następnie ustaw zawór wtryskowy w pozycji "wtrysk". Natężenie przepływu stosowane do wstrzykiwania wszystkich białek wynosiło 100 μl/min.</li>
	<li>Rozpocznij pomiary kinetyczne od monitorowania zmian współczynnika odbicia w czasie jednocześnie we wszystkich miejscach.</li>
	<li>Pod koniec wstrzykiwania białka przepłukać macierz działającym buforem przez 8 minut. Na koniec wstrzyknij 1 ml 1% SDS, aby go zregenerować.</li>
	<li>Powtórz tę samą procedurę dla innych białek.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i analiza danych
<ol>
	<li>Po wprowadzeniu roztworu białkowego do komórki przepływowej dochodzi do wiązania molekularnego, które indukuje przesunięcie krzywych plazmonów i zmianę współczynnika odbicia. Oprogramowanie do akwizycji obrazu konwertuje zmierzone wartości natężenia światła na poziomy skali szarości, uzyskując obrazy SPR na rysunku 5A i generuje zmiany współczynnika odbicia w funkcji czasu, podając sensorgramy (rysunek 5B).</li>
	<li>Użyj oprogramowania do obliczeń matematycznych, aby wykreślić współczynnik odbicia (R%) na końcu każdego wstrzyknięcia białka w porównaniu ze stosunkiem [BB1]/([BB1]+[BB2]), aby wygenerować profil ciągłej ewolucji 2D () dla każdej próbki (rysunek 5C).</li>
	<li>Dodaj stosunek [BB1]/([BB1]+[BB2]) w sensorgramach (rysunek 5B), aby wygenerować krajobraz ciągłej ewolucji 3D (CEL) dla każdego białka (rysunek 5D).</li>
</ol>

<ol><li>Margulies, D., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+protein+recognition+as+an+alternative+approach+to+antibody-mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).</li>
<li>Umali, A. P., Anslyn, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+approach+to+differential+sensing+using+synthetic+molecular+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).</li>
<li>Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-based+detection+of+different+proteins+using+an+array+of+fluorescent+protein+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).</li>
<li>Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+of+proteins+based+on+an+array+of+functionalized+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).</li>
<li>Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+receptors+create+patterns+that+distinguish+various+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Differential receptors create patterns that distinguish various proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).</li>
<li>Wright, A. T., Anslyn, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+receptor+arrays+and+assays+for+solution-based+molecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition.</a> Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).</li>
<li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle%E2%80%93fluorescent+polymer+%E2%80%98chemical+nose%E2%80%99+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).</li>
<li>De, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+proteins+in+human+serum+using+conjugates+of+nanoparticles+and+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein.</a> Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+evolution+profiles+for+electronic-tongue-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).</li>
<li>Campbell, C. T., Kim, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPR+microscopy+and+its+applications+to+high-throughput+analyses+of+biomolecular+binding+events+and+their+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics.</a> Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).</li>
<li>Stranick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer-scale+phase+separation+in+mixed+composition+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers.</a> Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Najbardziej krytyczne etapy budowy tego eT są poświęcone zapewnieniu dobrej odtwarzalności systemu. Na przykład, czyszczenie złotej powierzchni pryzmatu za pomocą znormalizowanej procedury przed użyciem, dodanie 10% glicerolu do jedenastu czystych i zmieszanych roztworów BB1 i BB2 w celu wyeliminowania parowania rozpuszczalnika podczas samoorganizacji kulek na złotej powierzchni pryzmatu, osadzanie wielu powtórzeń dla każdego stosunku [BB1]/([BB1]+[BB2]) itp. Jeśli chodzi o wykrywanie białek przez SPRi, wybór ką...

Precyzyjne i szybkie metody wykrywania białek są bardzo ważne w diagnostyce medycznej i proteomice. Klasyczne macierze wykrywające białka, takie jak biochipy, opierają się na zasadzie rozpoznawania "zamknij i klucz" i wymagają specyficznych receptorów, takich jak aptamery, przeciwciała lub mimetyki.
W ostatnich latachjako alternatywa pojawiła się percepcja różnicowa inspirowana ludzkim węchem i smakiem. To elektroniczne podejście nos/język (eN/eT) opiera się na zróżnicowanym wiązaniu analitów z szeregiem receptorów reagujących krzyżowo (CRR), które nie muszą być wysoce specyficzne lub selektywne dla cząsteczek docelowych, co pozwala przezwyciężyć pracochłonny proces opracowywania wysoce selektywnych receptorów. Jest to połączona odpowiedź wszystkich receptorów, która tworzy odrębny wzór dla każdej próbki, jak odcisk palca, umożliwiając jej identyfikację.
Dwa kluczowe wyzwania dla rozwoju elektronicznego nosa/języka do skutecznego wykrywania białek to produkcja elementów detekcyjnych, które mają zdolność rozróżniania strukturalnie podobnych analitów i odpowiedniego systemu transdukcji dla zdarzenia wiązania. Do tej pory badania opisywały różne podejścia do tworzenia macierzy2. Na przykład w jednym z badań opracowano identyfikację białek opartą na macierzy przy użyciu CRR przygotowanych z pochodnych tetra-karboksyfenyloporfiryny poprzez sprzężenie grup karboksylowych z różnymi aminokwasami lub dipeptydami w celu uzyskania zróżnicowanych receptorów posiadających hydrofobowy rdzeń zapewniający powinowactwo do białek i wyraźne naładowane peryferie do nadawania różnicowego wiązania. Korzystając z tego systemu, zidentyfikowano różne białka i mieszaniny białek, mierząc wygaszanie fluorescencji receptorów po interakcji z analitami3,4. W innym badaniu opracowano bibliotekę 29 CRR zawierających ugrupowania tripeptydu i kwasu borowego zsyntetyzowane w sposób kombinatoryczny na rusztowaniu benzenowym z heksapodstawionym heksapodstawieniem do wykrywania białek z detekcją kolorymetryczną wychwytu wskaźnika5,6. Dzięki takiej konstrukcji każdy receptor wykazywał zróżnicowaną zdolność wiązania z białkami w oparciu o wariancję ramion peptydów, a kwasy boronowe pomagały w różnicowaniu białek od glikoprotein. Niedawno stworzono macierz złożoną z różnych kationowo funkcjonalizowanych nanocząstek złota sprzężonych z anionowym fluorescencyjnym polimerem poli(p-fenyleneethynylenem) (PPE) w celu wykrywania i identyfikacji białek7. Konkurencyjne wiązanie między analitami białkowymi a wygaszonymi kompleksami nanocząstek PPE/złota zregenerowało fluorescencję, tworząc wyraźne wzorce rozpoznawania białek. W tym badaniu funkcjonalizowane interakcje nanocząstka-białko zostały dostrojone przez różne właściwości fizykochemiczne grup końcowych nanocząstek. Ponadto wykazano, że podejście to jest skuteczne w analizie białek w złożonych i bogatych w białko podłożach, takich jak surowica ludzka, w fizjologicznie istotnych stężeniach, pokazując w ten sposób potencjał eT w profilowaniu rzeczywistych próbek do diagnozowania stanów chorobowych8.
Chociaż bardzo obiecujące, te systemy mają pewne nieodłączne ograniczenia. Wymagają one zaprojektowania i zsyntetyzowania od 5 do 29 CRR o dość skomplikowanych strukturach. Ponadto, w przeciwieństwie do układu węchowego, który jest resetowany po każdym pomiarze, wykrywanie białek wymaga przygotowania matrycy dla każdej próbki. Wreszcie, monitorowanie zdarzeń wiązania w czasie rzeczywistym jest niezwykle trudne.
W tym kontekście, zaproponowano podejście kombinatoryczne polegające na użyciu niewielkiej liczby prostych i łatwo dostępnych cząsteczek o różnych właściwościach fizykochemicznych (hydrofilowe, hydrofobowe, dodatnio naładowane, ujemnie naładowane, neutralne, itp.) jako elementy budulcowe (BBs)9. Mieszając kulki w różnych i kontrolowanych proporcjach i pozwalając mieszaninom na samoorganizację na złotej powierzchni pryzmatu, stworzono szereg powierzchni kombinatorycznych o odpowiednich właściwościach wiązania białka. Warto zauważyć, że samoorganizujące się monowarstwy w tym systemie umożliwiają łatwe dostrajanie szeregu właściwości powierzchni w bardzo rozbieżny sposób, umożliwiając szybkie i wydajne wytwarzanie różnorodnych kombinatorycznych receptorów reakcji krzyżowej (CoCRR). Wykrywanie białek przeprowadzono za pomocą optycznego systemu detekcji, obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPRi). Krótko mówiąc, monochromatyczne światło spolaryzowane o szerokiej wiązce z diody LED oświetla cały obszar matrycy CoCRR na powierzchni pryzmatu. Kamera wideo CCD o wysokiej rozdzielczości zapewnia obrazy różnicowe w czasie rzeczywistym we wszystkich miejscach matrycy CoCRR. Rejestruje wszystkie lokalne zmiany na powierzchni macierzy CoCRR, dostarczając szczegółowych informacji na temat zdarzeń wiązania i procesów kinetycznych10. Tymczasem, za pomocą oprogramowania do obrazowania, obrazy SPR odpowiadające plamkom są automatycznie konwertowane na zmiany współczynnika odbicia w funkcji czasu, generując serię krzywych wiązania kinetycznego zwanych sensorgramami. W ten sposób SPRi umożliwia bezetykietową, synchroniczną, równoległą obserwację zdarzeń wiązania w czasie rzeczywistym. Dodatkowo uzyskana macierz CoCRR jest regenerowalna i nadaje się do wielokrotnego wykorzystania do analizy białek.
Ten protokół opisuje budowę elektronicznego języka przy użyciu tylko dwóch małych molekuł jako elementów budulcowych i ilustruje jego zastosowanie do analizy popularnych białek na podstawie ciągłych wzorców rozpoznawania uzyskanych za pomocą SPRi.

<table><tbody><tr><td>Aparatura SPRi&nbsp;</td><td>Aparat Horiba Scientific-GenOptics</td><td></td><td>SPRi umieszcza się w inkubatorze o regulowanej temperaturze w temperaturze 25 °C.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa&nbsp;</td><td>Instrumenty naukowe</td><td>Cavro XLP 6000</td><td></td></tr><tr><td>Micro Elite Degazser&nbsp;</td><td>Alltech</td><td>AT590507</td><td></td></tr><tr><td>6-portowy średniociśnieniowy zawór wtryskowy</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>Objętość zastosowanej pętli wtryskowej wynosi 500 &mikrolitrów.</td></tr><tr><td>Myjka plazmowa Femto (wersja 7)</td><td>Diener Elektroniczny</td><td></td><td>system odgazowywania on-line z 2 kanałami.</td></tr><tr><td>Spotter</td><td>Siliflow</td><td></td><td>Jest to bezkontaktowy obserwator piezoelektryczny.</td></tr><tr><td>SPRi-Biochip</td><td>Horiba Scientific-GenOptics</td><td>36000067</td><td>Pryzmat wykonany jest ze szklanego pryzmatu o wysokim współczynniku załamania światła pokrytego cienką złotą folią (45 nm) i specjalnie opracowanego do celów obrazowania.</td></tr><tr><td>Erythrina cristagalli lectin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5390</td><td></td></tr><tr><td>Lektyna Arachis hypogaea&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881</td><td></td></tr><tr><td>Mioglobina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>CXCL12&alfa;</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Dr. Hugues Lortat-Jacob; Szczegółowe informacje na temat przygotowania znajdują się w informacjach uzupełniających w numerze referencyjnym</td></tr><tr><td>9 CXCL12&gamma; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Dr. Hugues Lortat-Jacob; aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące przygotowania, patrz informacje uzupełniające w pozycji 9</td></tr><tr><td>Laktoza</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez prof. Davida Bonnaffa; w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania, patrz informacje uzupełniające w pozycji 9</td></tr><tr><td>Laktoza</td><td></td><td></td> siarczanowana <td>Dostarczone przez prof. Davida Bonnaffa; w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania, patrz informacje uzupełniające w pozycji 9</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroniczny język generujący ciągłe wzorce rozpoznawania do analizy białek

Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis

W obecnym protokole opracowano podejście kombinatoryczne, aby uprościć projektowanie i produkcję materiałów detekcyjnych do budowy języków elektronicznych (eT) do analizy białek. Mieszając niewielką liczbę prostych i łatwo dostępnych cząsteczek o różnych właściwościach fizykochemicznych, wykorzystywanych jako bloki budulcowe (BB), w różnych i kontrolowanych proporcjach oraz pozwalając mieszaninom na samoorganizację na złotej powierzchni pryzmatu, stworzono szereg powierzchni kombinatorycznych o odpowiednich właściwościach do wykrywania białek. W ten sposób można szybko i skutecznie uzyskać dużą liczbę receptorów reagujących krzyżowo. Łącząc taki układ kombinatorycznych receptorów reakcji krzyżowej (CoCRR) z optycznym systemem detekcji, takim jak obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPRi), uzyskany eT może monitorować zdarzenia wiązania w czasie rzeczywistym i generować ciągłe wzorce rozpoznawania, w tym profil ciągłej ewolucji 2D () i krajobraz ciągłej ewolucji 3D (CEL) dla próbek w cieczy. Taki system eT jest skuteczny w rozróżnianiu powszechnie stosowanych oczyszczonych białek.

Aby zbadać zdolność języka elektronicznego do analizy powszechnie stosowanych białek, wykorzystano trzy białka: AHL, mioglobinę oraz lizozym. Dla każdego białka eT wygenerował odrębny dwuwymiarowy ciągły profil ewolucji (CEP), jak pokazano na Rysunku 6.
Ponadto, dzięki zastosowaniu SPRi, która umożliwia monitorowanie kinetyki adsorpcji i desorpcji w czasie rzeczywistym, dla każdego białka wygenerowano zależny od czasu ciągły wzór rozpoznawania, nazywany trójwymiarowym krajobra...

Opisano nowatorskie podejście do budowy elektronicznego języka (eT), które znacznie upraszcza projektowanie i produkcję materiałów detekcyjnych, a także pozwala eT generować ciągłe profile ewolucji i krajobrazy dla próbek w cieczy. Uzyskany eT jest skuteczny w powszechnej analizie białek, takiej jak dyskryminacja.

Elektroniczny język generujący ciągłe wzorce rozpoznawania do analizy białek

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest skonstruowanie elektronicznego języka w oparciu o podejście kombinatoryczne i wykonanie obrazowania plazmy powierzchniowej i rezonansu w celu analizy białek. Osiąga się to poprzez użycie laktozy i siarczanowanej laktozy jako elementów budulcowych i osadzenie ich mieszanin na złotej powierzchni pryzmatu w celu samoorganizacji w celu stworzenia szeregu kombinatorycznych receptorów reagujących krzyżowo. Jako drugi etap powierzchni stosuje się obrazowanie plazmowe i rezonansowe, które monitoruje zdarzenia wiązania w czasie rzeczywistym i tworzy obrazy SPR oraz serię kinetycznych krzywych wiązania zwanych gramami czujników.Następnie przetwarzanie danych odbywa się na podstawie gramów czujników przy użyciu oprogramowania do obliczeń matematycznych w celu stworzenia profilu ciągłej ewolucji 2D i krajobrazu ciągłej ewolucji 3D dla każdej próbki, wyniki pokazują, że język elektroniczny jest w stanie generować odrębne krajobrazy ciągłej ewolucji 3D dla powszechnych oczyszczonych białek i jest skuteczny w ich dyskryminacji na podstawie rozpoznawania wzorców. Ta technika ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczna, elektr

electronic-tongue-generating-continuous-recognition-patterns-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Ten film demonstruje protokół testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkera białkowego związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) z płytek krwi ludzkiej. Potwierdzenie obecności białka biomarkerowego ALS uzyskuje się poprzez rozdzielenie białek płytek krwi na podstawie wielkości, a następnie detekcję chemiluminescencyjną.

Test immunologiczny elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkerów białkowych

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Ten protokół pokazuje, jak osiągnąć czułość wykrywania femtomolowych białek w 10 μL pełnej krwi w ciągu 30 minut. Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu elektroprzędzonych mat nanowłóknistych zintegrowanych w lab-on-a-disc, który oferuje dużą powierzchnię, a także skuteczne mieszanie i mycie w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu.

W pełni zautomatyzowane odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

System do automatycznej i szybkiej analizy glikanów na białkach został wcześniej opracowany. W artykule przedstawiono protokół "analizy glikojakościowej", zoptymalizowany dla szerokiego spektrum użytkowników, takich jak osoby zajmujące się analizą struktur glikanów w biofarmaceutykach i innych materiałach glikokoniugatowych.

Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

W niniejszej pracy omawiano protokół projektowania i opracowania urządzenia E-Eye-Enable POCT do wykrywania Fe, Cr, As i F w próbkach środowiskowych, próbkach biologicznych oraz żywności i napojach. Przetestowano prawie 2000 próbek, a wyniki odpowiadają standardowej technice.

TD-DFT Guided Advanced E-Eye Sensing Technique do kwantyfikacji na miejscu Fe, Cr, F oraz As w próbkach środowiskowych, biologicznych i spożywczych

Poznaj metodę konstrukcji elektronicznego języka do analizy białek z wykorzystaniem obrazowania plazmonowego. Technika ta generuje ciągłe profile ewolucyjne 3D dla skutecznej dyskryminacji białek.

Elektroniczny język generujący ciągłe wzorce rozpoznawania do analizy białek

Przeglądaj więcej filmów