Elektroniczny język generujący ciągłe wzorce rozpoznawania do analizy białek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest skonstruowanie elektronicznego języka w oparciu o podejście kombinatoryczne i wykonanie obrazowania plazmy powierzchniowej i rezonansu w celu analizy białek. Osiąga się to poprzez użycie laktozy i siarczanowanej laktozy jako elementów budulcowych i osadzenie ich mieszanin na złotej powierzchni pryzmatu w celu samoorganizacji w celu stworzenia szeregu kombinatorycznych receptorów reagujących krzyżowo. Jako drugi etap powierzchni stosuje się obrazowanie plazmowe i rezonansowe, które monitoruje zdarzenia wiązania w czasie rzeczywistym i tworzy obrazy SPR oraz serię kinetycznych krzywych wiązania zwanych gramami czujników.

Następnie przetwarzanie danych odbywa się na podstawie gramów czujników przy użyciu oprogramowania do obliczeń matematycznych w celu stworzenia profilu ciągłej ewolucji 2D i krajobrazu ciągłej ewolucji 3D dla każdej próbki, wyniki pokazują, że język elektroniczny jest w stanie generować odrębne krajobrazy ciągłej ewolucji 3D dla powszechnych oczyszczonych białek i jest skuteczny w ich dyskryminacji na podstawie rozpoznawania wzorców. Ta technika ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczna, elektroniczna gnoza i języki. Po pierwsze, przygotowanie receptorów śpiewu jest w dużej mierze uproszczone.

Duża różnorodność receptorów reagujących krzyżowo może być wybierana przez mieszanie niewielkiej liczby cząsteczek. Po drugie, dzięki podejściu kombinatoryjnemu, wzorce rozpoznawania generowane przez nasz elektroniczny język można uznać za ciągłe, dzięki czemu można łatwiej zidentyfikować nieprawidłowe sygnały. W związku z tym można uzyskać bardziej wiarygodną analizę w celu przygotowania kombinatorycznej macierzy receptorów reagujących krzyżowo.

Najpierw wyczyść złotą powierzchnię pryzmatu na 48 godzin przed użyciem za pomocą środka do czyszczenia plazmowego przez trzy minuty pod 75% tlenu, 25% argonu, 0,6 milibara i 40 watów mocy. Następnie przygotuj 100 mililitrów roztworu buforu fosforanowego zawierającego 10% glicerolu lub PBSG. Dodanie glicerolu do PBS jest bardzo ważne w celu zmniejszenia parowania rozpuszczalnika i zmian w stężeniu bloku budulcowego lub BBB po osadzaniu.

Następnie przygotuj roztwory podstawowe laktozy lub pierwszego bloku budulcowego i siarczanowanej laktozy lub drugiego bloku budulcowego z roztworów podstawowych. Przygotuj 11 czystych i mieszanych roztworów o proporcjach od zera do 100% w krokach co 10% i całkowitym stężeniu bloku budulcowego 0,1 milimola w PBSG, umieść osiem nanolitrowych kropelek tych czystych i mieszanych roztworów na powierzchni pryzmatu za pomocą bezkontaktowego obserwatora w poczwórnym duplikacie dla każdego stosunku z 44 plamkami w sumie umieść pryzmat na szalce Petriego zawierającej jeden mililitr ultra czystej wody i pozostaw na noc w temperaturze Temperatura pokojowa do samodzielnego montażu BB one i BB 2 na złotej powierzchni w niniejszym dokumencie. Zakłada się, że średni skład powierzchni w mieszanych samoorganizujących się monowarstwach odzwierciedla skład mieszanego roztworu do osadzania.

Następnego dnia dokładnie umyj pryzmat ultraczystą wodą przed wysuszeniem go pod strumieniem argonu. Ustaw inkubator, w którym plazma powierzchniowa i aparaty do obrazowania rezonansowego są umieszczone w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby uniknąć zmian współczynnika załamania światła wywołanych zmianami temperatury podczas wykrywania białek. Włożyć niefunkcjonalizowany pryzmat płuczący do 10-mikrolitrowej celi przepływowej z polieteroeteroeteroketonu podłączonej do sterowanej komputerowo pompy strzykawkowej, dessera i sześcioportowego zaworu wtryskowego średniego ciśnienia.

Napełnij system przepływowy świeżo przefiltrowanym i działającym buforem z hałd Degas. Usuń pryzmat płuczący i włóż pryzmat zawierający kombinacyjny układ receptorów reaktywnych krzyżowo do hałd przepływowych z natężeniem przepływu 100 mikrolitrów na minutę. Za pomocą kamery CCD usuń wszelkie pęcherzyki powietrza obecne na powierzchni pryzmatu, przepuszczając działający bufor.

Szybko zdefiniuj obszar badania dla każdego punktu, rysując okrąg o tej samej średnicy dla obszaru zainteresowania na podstawie dobrze skontrastowanego obrazu matrycy oraz, za pomocą zintegrowanego oprogramowania w systemie obrazowania plazmy powierzchniowej i rezonansu, śledź krzywe plazmy, które reprezentują krzywe odbicia w funkcji kąta padania dla wszystkich punktów. Wybierz kąt roboczy, czyli pozycję, w której będą rejestrowane krzywe kinetyczne przy najwyższym nachyleniu krzywych odbicia. Obróć lustro skanujące, aby ustalić wybrany kąt roboczy dla pomiarów kinetycznych.

Kontynuuj przepuszczanie hałd przez system przepływu, aż sygnał odbicia dla wszystkich punktów będzie stabilny i stały. Następnie za pomocą strzykawki wstrzyknąć jeden mililitr lektyny z orzeszków ziemnych lub roztworu HL do pętli próbki o pojemności 500 mikrolitrów z zaworem wtryskowym w pozycji obciążenia z natężeniem przepływu ustawionym na 100 mikrolitrów na minutę, ustawić zawór wtryskowy w pozycji wtrysku. Rozpocznij pomiary kinetyczne od monitorowania zmian współczynnika odbicia w czasie jednocześnie we wszystkich miejscach na końcu wstrzykiwania białka.

Przepłukać macierz działającym buforem przez osiem minut. Na koniec wstrzyknij jeden mililitr 1%DS, aby zregenerować tablicę. Powtórzyć tę samą procedurę dla innych białek po wprowadzeniu roztworu białkowego do komory przepływowej.

Wiąże się molekularnie i indukuje przesunięcie krzywych plazmy oraz zmianę refleksyjności. Oprogramowanie do akwizycji obrazu konwertuje zmierzone wartości natężenia światła na poziomy skali szarości, uzyskując obrazy SPR i generując zmiany współczynnika odbicia w funkcji czasu podawanego w gramach czujnika. Następnie użyj oprogramowania do obliczeń matematycznych, aby wykreślić współczynnik odbicia na końcu każdego wstrzyknięcia białka w stosunku do współczynnika bloków budulcowych, aby wygenerować profil ciągłej ewolucji 2D dla każdej próbki.

Na koniec dodaj współczynnik bloków budulcowych do gramów czujnika, aby wygenerować zależny od czasu ciągły wzorzec rozpoznawania zwany krajobrazem ciągłej ewolucji 3D dla każdego białka, aby zbadać zdolność elektronicznego języka do wspólnej analizy białek, użyto trzech białek, mioglobiny HL i lizozymu dla każdego białka. Wyraźny profil ciągłej ewolucji 2D został wygenerowany przez język elektroniczny, jak pokazano w 3D. Wygenerowano również krajobrazy ciągłej ewolucji dla mioglobiny HL i lizozymu.

Elektroniczny język jest wrażliwy na cechy powierzchni białek, takie jak rozkład hydrofobowych, obojętnych i naładowanych reszt aminokwasowych. Uzyskane profile ciągłej ewolucji krajobrazów mogą być wykorzystane jako odciski palców do skutecznej dyskryminacji białek i prospektywnej identyfikacji w oparciu o rozpoznawanie wzorców. Próbując tego podejścia, należy pamiętać o przestrzeganiu zoptymalizowanych i ustandaryzowanych procedur eksperymentalnych, aby zapewnić dobrą odtwarzalność elektronicznego języka.

Procedury te obejmują czystą i dobrą powierzchnię pryzmatu, wybór kąta roboczego dla obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmowego oraz zastosowanie odpowiedniego roztworu w celu całkowitej regeneracji systemu do ponownego użycia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonstruować elektroniczny język w oparciu o podejście COMBINATOR i obrazowanie rezonansu plazmowego SOFA do analizy białek. Powodzenia w eksperymentach.