Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie unikalnej transformacji mikrogleju w komórki GLO w obecności cykliny toksyny. Osiąga się to poprzez pierwsze pokrycie szkiełek nakrywkowych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. W drugim etapie komórki glejowe są posiewane na szkiełkach nakrywkowych, a następnie do kultur podaje się kulki cykliny i lateksu.

W ostatnim etapie komórki są barwione przez immunochemię. Ostatecznie wpływ cykliny na zarodkowanie i zdolność fagocytarną komórek mikrogleju można ocenić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie linii komórkowych mikrogleju, jest to, że zastosowanie pierwotnych kultur glejowych naśladuje hipotetyczne interakcje między astrocytami I a mikroglejem w mózgach osób z leukodystrofią komórek pustki GLO lub GLD, demonstrując procedurę KO Claycomb, doktorant z mojego laboratorium.

Aby przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte matrycą zewnątrzkomórkową lub ECM, należy najpierw namoczyć okrągłe szkiełka nakrywkowe sterylnym kwasem solnym na sterylnej szalce Petriego. Po 30 minutach umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie sterylną wodą, a następnie namocz je w 95% etanolu przez co najmniej 20 minut. Po pozostawieniu szkiełek nakrywkowych do wyschnięcia na powietrzu, dodać od 150 do 250 mikrolitrów kropelek rozcieńczonych materiałów powlekających białko ECM na arkusz paraformu, rozprowadzając kropelki tak, aby szkiełka nakrywkowe nie zachodziły na siebie po umieszczeniu.

Następnie za pomocą kleszczyków delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na każdej kropli, a następnie umieść paraformę w kapturze do hodowli komórkowej z zamkniętym skrzydłem po czterech do sześciu godzinach, umieść szkiełka nakrywkowe stroną pokrytą ECM do góry w indywidualnych dołkach płytki 24-dołkowej. Następnie umyj każdą studzienkę sterylnym PB S3 razy i przechowuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować komórki glejowe do posiewu na szkiełkach nakrywkowych, należy odessać pożywkę z kultur komórek glejowych, a następnie delikatnie przemyć monowarstwy trzykrotnie 10 mililitrami sterylnego PBS.

Odłącz komórki od ośmiu do 10 mililitrów trypsyny EDTA po pięciu do 10 minutach. W temperaturze 37 stopni Celsjusza dodać 20 mililitrów kompletnej pożywki do kolby, aby zatrzymać reakcję. Następnie przenieś zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i wiruj komórki przez 10 minut.

W temperaturze 300 g i pokojowej użyj P 1000, aby delikatnie zawiesić podniebienie w dwóch mililitrach świeżego, kompletnego podłoża. Po policzeniu rozcieńczyć komórki do około 10 do piątych komórek na mililitr. Teraz nałóż 500 mikrolitrów komórek na każde z szkiełek nakrywkowych pokrytych ECM.

Dodaj dodatkowe świeże, kompletne podłoża do każdej studzienki, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu dni. Gdy komórki osiągną pożądaną zbieżność, dodaj świeżo przygotowaną cyklinę do każdej studzienki i delikatnie zakręć płytką hodowlaną, aby wymieszać. Po tygodniu leczenia cykliną zbierz pożywkę i utrwal komórki w 500 mikrolitrach zimnego, 4% para formaldehydu na studzienkę w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj każdą studzienkę trzy razy PBS i przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby uwidocznić komórki GLO za pomocą chemii immunocytologicznej, najpierw zastąp PBS buforem blokującym i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej. Po godzinie inkubować komórki w pierwotnych surowicach odpornościowych przeciwko markerowi mikrogleju IO jeden przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie myć każdą studzienkę trzy razy w PBS przez pięć minut.

Po inkubacji komórek z odpowiednim fluorescencyjnym sprzężonym przeciwciałem wtórnym, przeciwbarwić komórki DAPI w celu identyfikacji jąder. Następnie, po umyciu komórek, jak pokazano, użyj podłoża montażowego, aby zamontować każde szkiełko nakrywkowe na poszczególnych szkiełkach mikroskopowych i view szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu analizy wizualnej i ilościowej. Aby ocenić aktywność fagocytarną mikrogleju poddanego działaniu cykliny po leczeniu cykliną, ale przed utrwaleniem, należy dodać kulki lateksowe znakowane FITC do każdej hodowli komórek G OID zgodnie z instrukcjami producenta.

Po 48 godzinach utrwal komórki w PFA, jak właśnie pokazano, a następnie przetwórz komórki pod kątem immunochemicznym, jak pokazano. Na koniec oceń liczbę IBO one dodatnich mikroglejów, które lokalizują się z fluorescencyjnie znakowanymi kulkami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej immunochemicznej. Barwienie mikrogleju za pomocą IO one w połączeniu z jądrowym barwieniem przeciwjądrowym umożliwia identyfikację dużych, zaokrąglonych komórek wielojądrowych.

Należy zauważyć, że w wielu przypadkach znaczne powiększenie rozmiaru jądra odzwierciedla wielojądrowy status tych komórek, jak zaobserwowano na tym obrazie, leczenie cykliną wywołuje również uogólnioną aktywację mikrogleju, którą można zmierzyć przez wzrost kwaśnej aktywności PHA jednojądrowego mikrogleju, a także wielojądrowych komórek GLO. Jak zaobserwowano na tym reprezentatywnym obrazie, kwasowo aktywne profile PHA mikrogleju IBO one dodatniego można łatwo zidentyfikować podczas kohodowli z komórkami progenitorowymi oligodendrocytów. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii GLD, ponieważ tworzenie tych komórek wielojądrowych w odpowiedzi na leczenie cykliną jest cechą definiującą neuropatologię GLD, a udział tych komórek w tej patologii nie był wcześniej badany w ten sposób.