Name: Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj transformację mikroglii w komórki globoidalne w chorobie Krabbego przy użyciu modelu in vitro z cykliną. Ta metoda umożliwia badanie patofizjologii leukodystrofii i ocenę aktywności fagocytarnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 dla S.J.C.), National Institutes of Health (NS065808 dla E.R.B.; NS078392 do S.J.C.), fundusze na rozpoczęcie działalności z UConn Health Center (do SJC) oraz Kim Family Fund (UCHC na rzecz K.I.C.).

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Polityką Humanitarnej Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych określonymi przez Biuro Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych (NIH) i tylko za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Zdrowia Uniwersytetu Connecticut.
1. Przygotowanie mieszanych kultur glejowych
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed użyciem. Dodaj 3 ml lodowatego sterylnego zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) niezawierającego kationów (Mg2+ lub Ca2+) do trzech sterylnych 60 mm szalek Petriego utrzymywanych na lodzie, aby utrzymać niską temperaturę.</li>
	<li>Wyizoluj korę od pourodzeniowych szczeniąt myszy P0-P2, jak opisano wcześniej17,18. 
	UWAGA: Struktury podkorowe, takie jak hipokampy, nie są uwzględnione w tych kulturach.</li>
	<li>Ostrożnie usuń opony mózgowe, a następnie przenieś izolowaną korę do świeżego HBSS i zdysocjuj tkanki enzymatycznie, używając zestawu do preparowania tkanek nerwowych zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Umieść komórki w sterylnych kolbach T-175 i inkubuj przez noc w pożywce [zmodyfikowana pożywka orła (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) zawierającą 1x penicylinę/streptomycynę].</li>
	<li>Wymień wszystkie nośniki następnego dnia na świeże. Kontynuuj inkubację kultur, z regularną zmianą pożywki, przez około 3 tygodnie lub do momentu powstania monowarstwy komórkowej. 
	UWAGA: Ta monowarstwa będzie składać się z astrocytów i mikrogleju w stosunku około 10:119.</li>
</ol>
2. Indukcja komórek globoidalnych w mieszanych kulturach glejowych
<ol>
	<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe z powłoką ECM.
	<ol>
		<li>Okrągłe szkiełka nakrywkowe namoczyć sterylnym 1 N kwasem solnym (HCl) na sterylnej szalce Petriego przez 30 minut. Umyć szkiełka nakrywkowe sterylną wodą 3x, a następnie namoczyć w 95% EtOH przez co najmniej 20 minut, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Umieścić kropelki rozcieńczonych materiałów powlekających białko macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na arkuszu Parafilmu (np. 150-250 μl/kroplę lamininy 10 μg/ml rozpuszczoną w sterylnym roztworze buforu fosforanowego [PBS]). Rozprowadzić kropelki tak, aby szkiełka nakrywkowe nie stykały się po umieszczeniu na tych kropelkach. Delikatnie umieść każde wysuszone szkiełko nakrywkowe na kropli za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe pozostawić na kropelkach na ok. 4-6 godzin w kapturze hodowlanym przy zamkniętym skrzydle.</li>
		<li>Umieść szkiełka nakrywkowe z powłoką ECM (stroną z powłoką ECM do góry) w każdym z dołków płytki 24-dołkowej. Umyć każdą studzienkę sterylnym PBS 3x i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek glejowych do posiewu na szkiełkach nakrywkowych.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę z kultur glejowych i delikatnie przemyć monowarstwę glejową 3x 10 ml sterylnego PBS. Następnie dodać 8-10 ml roztworu trypsyny-EDTA do T-175 i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Gdy większość monowarstwy zostanie oderwana, dodać 20 ml kompletnej pożywki do kolby, aby zatrzymać trypsynizację. Zebrać pożywkę zawierającą oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze pokojowej o wymiarach 300 x g.</li>
		<li>Odessać supernatant bez naruszania osadu, a następnie ponownie zawiesić komórki w 2 ml świeżej, kompletnej pożywki, delikatnie pipetując roztwór za pomocą pipety P1000.</li>
		<li>Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru, a następnie ponownie zawieś komórki w kompletnym podłożu o pożądanej gęstości (np. 10,5 komórek/ml). Umieścić komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych ECM (np. 500 μl w każdym dołku płytki 24-dołkowej). Dodać dodatkowe świeże, kompletne podłoża do każdego dołka przez 3-5 dni inkubacji w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy komórki osiągną pożądaną wizualną zbieżność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie psychozyną.
	<ol>
		<li>Rozpuść psychozynę do stężenia podstawowego (108,3 mM) w dimetylosulfotlenku (DMSO). Rozcieńczyć ten materiał w 100% EtOH, aby uzyskać materiał roboczy, który można następnie dodać do każdego dołka na płytce 24-dołkowej, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 μM.</li>
		<li>W momencie dodawania psychozyny delikatnie zakręć płytką hodowlaną, aby wymieszać psychozynę z pożywką hodowlaną. Uzupełnij psychozynę, dodając równowartość 10 μM co drugi dzień przez jeden tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 7 dniach leczenia psychozyną zebrać pożywkę i odpipetować 500 μl zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utrwalić komórki. Następnie przemyć każdą studzienkę 3x PBS, a następnie utrzymać płytki w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia do immunocytochemii (patrz poniżej). 
	UWAGA: W tym momencie można pobrać pożywkę do hodowli komórkowych do testu enzymatycznego lub ELISA, jeśli jest to pożądane.</li>
</ol>
3. Immunocytochemia (ICC) do wizualizacji komórek globoidalnych
<ol>
	<li>Zastąp PBS buforem blokującym [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% normalna surowica kozia (NGS)] i inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować utrwalone komórki w pierwszorzędowych surowicach odpornościowych przeciwko Iba-1 [(1:1,000) rozcieńczony w PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć każdą studzienkę PBS 3x 5 min/pranie.</li>
	<li>Dodać odpowiednie wtórne przeciwciało sprzężone z fluorescencją w celu identyfikacji znakowania przeciwciała pierwszorzędowego i przeciwbarwienia za pomocą 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI, 1:1,000) w celu identyfikacji jąder. Inkubować w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemywać PBS 3x 5 min.</li>
	<li>Zamontuj każde szkiełko nakrywkowe do szkiełek mikroskopowych za pomocą medium montażowego. Wyświetlanie preparatów pod mikroskopem fluorescencyjnym do analiz wizualnych i ilościowych.</li>
</ol>
4. Analiza i charakterystyka komórek globoidowych w hodowli pierwotnej
<ol>
	<li>Użyj następujących trzech kryteriów morfologicznych, aby zidentyfikować komórkę globoidalną w hodowli:
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj komórki globoidalne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez immunopozytywne znakowanie markera mikrogleju, Iba-1+.</li>
		<li>Zidentyfikuj komórki globoidalne jako wielojądrowe (tj. zawierające dwa lub więcej jąder dodatnich DAPI).</li>
		<li>Identyfikuj komórki globoidalne na podstawie zaokrąglonej morfologii, różniącej się od silnie rozgałęzionego wyglądu spoczynkowych komórek mikrogleju. 
		UWAGA: Z tych hodowli można również pobierać komórki do analizy markerów powierzchniowych komórek i oznaczania ilościowego za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar aktywacji fagocytarnej komórek mikrogleju i globoidalnych
	<ol>
		<li>Aby ocenić aktywność fagocytarną mikrogleju traktowanego psychozyną, dodaj do studzienek kulki lateksowe z oznaczeniem FITC zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj fluorescencyjne kulki lateksowe sprzężone 48 godzin przed utrwaleniem za pomocą PFA. Utrwalić komórki potraktowane kulkami (jak wspomniano w sekcji 2.4) i przeprowadzić proces immunocytochemiczny (zgodnie z opisem w punkcie 3).</li>
		<li>Wybierz przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, tak aby nie nakładały się na fluorescencyjne widma emisyjne kulek znakowanych fluoroforem.</li>
		<li>Przeanalizuj profile fagocytotyczne mikrogleju Iba-1+, identyfikując te komórki, które kolokalizują się z fluorescencyjnie znakowanymi kulkami. 
		UWAGA: Psychozyna aktywuje mikroglej. Kulki fagocytozy zostaną zidentyfikowane w jednojądrowych i wielojądrowych komórkach Iba-1+ w tych warunkach hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Indukcja komórek globoidalnych z oczyszczonych kultur mikrogleju
UWAGA: Alternatywne podejście do rozszyfrowania sygnalizacji międzykomórkowej między astrocytem a mikroglejem to kolejna zaleta tego modelu komórek globoidalnych in vitro. Oczyszczanie pierwotnych komórek mikrogleju do ponownego posiewu lub kohodowli można osiągnąć dzięki ich niższej przyczepności w hodowli, jak opisano w poniższych krokach (patrz sekcja 5.2).
<ol>
	<li>Zebrać pożywkę z przenikających się mieszanych kultur glejowych do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i utrzymywać w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Izolacja mikrogleju z pierwotnych mieszanych kultur glejowych.
	<ol>
		<li>Po usunięciu pożywki z kolby T175 z mieszaną kulturą glejową, dodać ciepłą pożywkę do wytrząsania [składającą się z kompletnych pożywek + 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) + 25 mM wodorowęglanu sodu (Sigma)]. Potrząsać kolbami przez 3-4 godziny w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min (37 °C). Zebrać pożywkę z tak wstrząśniętych kolb do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Pożywka ta będzie zawierać mniej przylegający mikroglej z kolb.</li>
		<li>Wirować podłoże o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki kondycjonowanej przez astrocyty (zebranej w kroku 5.1).</li>
		<li>Ustalić liczbę komórek pobranych za pomocą hemocytometru, a następnie umieścić komórki mikrogleju na szkiełkach nakrywkowych pokrytych substratem (patrz sekcja 2.1) do celów immunocytochemicznych lub na płytkach dołkowych o bardzo niskiej przyczepności w celu przyszłego pobrania komórek globoidalnych do kohodowli z innymi typami komórek, takimi jak oligodendrocyty (jak opisano w następnej sekcji). 
		UWAGA: Po posianiu mikrogleju można leczyć psychozyną (10 μM), jak opisano powyżej (patrz punkt 2.3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Współhodowla z pierwotnymi oligodendrocytami w celu analizy cytotoksyczności. 
	UWAGA: Pobranie mikrogleju poddanego działaniu psychozyny z płytek o niskiej przyczepności w celu późniejszej kohodowli na pierwotne kultury oligodendrocytów lub komórek progenitorowych oligodendrocytów może być wykorzystane do zbadania potencjalnej funkcji cytotoksycznej tych komórek globoidalnych in vitro.
	<ol>
		<li>Opracowanie kultur pierwotnych oligodendrocytów przy użyciu ustalonych metod18,20. Aby zebrać mikroglej potraktowany psychozyną, delikatnie pipetuj, aby oderwać luźno przylegające komórki od dna studzienek. Zebrać komórki, odwirować przy 300 x g przez 10 minut, a następnie ostrożnie ponownie zawiesić w pożywce różnicującej oligodendrocyty [składającej się z pożywki neurobazalnej, L-glutaminy (1x), suplementu B-27 (1x) i trójjodotyroniny (T3, 10 ng/ml)].</li>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru, a następnie zasiej mikroglej w kulturze oligodendrocytów o stężeniu 1 x 105 komórek/ml, co daje przybliżony stosunek mikrogleju/oligodendrocytów 1:2. Inkubuj jako kokulturę do 3 dni.</li>
		<li>Ustalić komórki do immunocytochemii (patrz punkt 2.4). W razie potrzeby należy pobrać pożywki do hodowli komórkowych do testu ELISA lub analiz chemicznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li>
<li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease%3A+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).</li>
<li>Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hunter%27s+Hope+Krabbe+family+database%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">The Hunter's Hope Krabbe family database.</a> Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).</li>
<li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+screening+for+Krabbe+disease%3A+the+New+York+State+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model.</a> Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).</li>
<li>Krabbe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+familial%2C+infantile+form+of+brain+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new familial, infantile form of brain sclerosis.</a> Brain. 39, 74-114 (1916).</li>
<li>Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globoid+cell+leukodystrophy%3A+comparison+of+neuropathology+with+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging.</a> Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).</li>
<li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+study+of+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy.</a> Brain Dev. 24, 284-290 (2002).</li>
<li>Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+pathology+progresses+independently+of+KC+and+CXCR2+in+globoid-cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+fusion+and+multinucleated+giant+cells+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation.</a> Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).</li>
<li>Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+immunohistochemistry+as+a+marker+for+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia.</a> Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).</li>
<li>Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglial+cytoskeleton%3A+vimentin+is+localized+within+activated+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ.</a> J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).</li>
<li>Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+counteract+demyelination+in+a+mouse+model+of+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy.</a> J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).</li>
<li>Pollanen, M. S., Brody, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Fetal globoid cell leukodystrophy.</a> Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).</li>
<li>Martin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Krabbe+leukodystrophy.+A+morphologic+study+of+two+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases.</a> Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).</li>
<li>Ijichi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-3+mediates+psychosine-induced+globoid+cell+formation%3A+Implications+for+leukodystrophy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology.</a> Glia. , (2013).</li>
<li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+in+murine+globoid+cell+leukodystrophy+is+conditioned+by+macrophage%2Fmicroglia+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation.</a> Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).</li>
<li>Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+agonist-specific+regulation+of+genes+for+matrix+metalloproteinases+and+their+tissue+inhibitors+by+primary+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56, 1187-1198 (2008).</li>
<li>Moore, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Tissue+Inhibitor+of+Metalloproteinase-1+%28TIMP-1%29+Promotes+Oligodendrocyte+Differentiation+and+Enhances+CNS+Myelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination.</a> J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).</li>
<li>Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+molecular+target+of+psychosine+and+its+role+in+globoid+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation.</a> J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół zapewnia nowy system modelowy, w którym można badać rozwój i charakterystykę funkcjonalną aktywowanych komórek mikrogleju i globoidalnych. Wcześniejsza praca Im et al. wykorzystanie linii komórkowej HEK293 dostarczyło szablonu do opracowania obecnego protokołu do badania tworzenia komórek globoidalnych21. Należy również podkreślić, że komórki globoidalne uzyskane w modelu różnią się od natywnych komórek globoidalnych identyfikowalnych w GLD. Na przykład rutynow...

Leukodystrofia globoidalnokomórkowa (GLD), znana również jako choroba Krabbego, jest śmiertelną chorobą demielinizacyjną wynikającą z mutacji powodujących utratę funkcji w genie1 galatocerebrozydazy (galc). Najbardziej rozpowszechnioną postacią GLD jest wariant dziecięcy, który charakteryzuje się początkiem we wczesnym dzieciństwie i charakteryzuje się agresywnym klinicznym przebiegiem pogorszenia funkcji motorycznych i poznawczych, prowadzącym do przedwczesnej śmierci, często przed piątymrokiem życia. Badania genetyczne służą do weryfikacji diagnozy GLD4. Neuropatologia GLD ujawnia rozległą demielinizację, atrofię neuronów, astroglejozę i obecność nabrzmiałych wielojądrzastych mikrogleju zwanych komórkami globoidalnymi5-7. Identyfikacja komórek globoidalnych, często zawierających kanalikowe inkluzje w swojej cytoplazmie, była cechą definiującą GLD przez ostatnie 97 lat, chociaż specyficzna funkcja tych rzucających się w oczy komórek pozostawała nieuchwytna.
Udział niemielinizującego gleju (mikrogleju i astrocytów) w patogenezie GLD od dawna uważany jest za wtórną odpowiedź na głęboką demielinizację w tej chorobie8. Co ciekawe, pierwszy opis tej choroby, dokonany przez Knuda Krabbego w 1916roku5, donosił o tworzeniu się wielojądrowych fagocytów zawierających resztki lipidów, które zostały nazwane "komórkami globoidalnymi" i są cechą charakterystyczną tej choroby.
Komórki globoidalne są cechą charakterystyczną patologii GLD, chociaż ich rola w GLD jest od dawna ignorowana. Co ciekawe, komórki te są jednymi z najwcześniejszych charakterystycznych zmian w tkance OUN GLD. Ten brak wiedzy mógł wynikać z założenia, że tworzenie się wielojądrowych fagocytów, zwanych w innych chorobach komórkami olbrzymimi, jest zwykle uważane za konsekwencję patologii, a nie początkową patogenną siłę napędową9. Dlatego przeprowadzono niewiele badań badających mechanizm, w wyniku którego komórki globoidalne są tworzone z fagocytów, szczególnie w OUN GLD. Procedura opisana w tym raporcie koncentruje się na znaczeniu tworzenia komórek globoidalnych w OUN i naszym poprzednim wykazaniu, że indukowana psychozyną wielojądrowość mikrogleju in vitro i te komórki wykazywały wyższy poziom aktywności fagocytarnej. Zgodnie z tymi obserwacjami, komórki globoidalne w mózgach drgających często zawierają PAS-dodatnie szczątki, co sugeruje wysoki poziom aktywności fagocytarnej. Stwierdzono również, że komórki globoidalne są immunododatnie pod względem ferrytyny (markera mikrogleju)10, KP-1/CD68 (markera monocytów), a niektóre są również dodatnie pod względem wimentyny (pośredniego białka filamentu i markera astrocytów i aktywowanego mikrogleju)11, HLA-DRa (receptor powierzchniowy MHCII) oraz TNF-α7 i Iba-1 (białko wiążące wapń używane do identyfikacji mikrogleju)12. Opierając się na tym zbiorze markerów, komórki globoidalne pochodzą z mikrogleju, który rozwija unikalny fenotyp.
Pomimo ich unikalności, specyficzna funkcja i wkład GC w patogenezę GLD zostały w dużej mierze przeoczone. Uważa się, że komórki globoidalne są wtórną konsekwencją przewlekłej demielinizacji. Jednak wcześniejsze badania badające czasowy związek komórek globoidalnych z patologią istoty białej GLD zidentyfikowały obecność komórek globoidalnych w późnym okresie embrionalnym do wczesnego okresu posturodzeniowego; czasy poprzedzające apoptozę oligodendrocytów i jawną demielinizację13. Tak więc sekwencja czasowa rozwoju neuropatologii w GLD sugeruje, że komórki globoidalne powstają przed demielinizacją w tej chorobie14. Doprowadziło to do naszej hipotezy, że wczesne tworzenie się komórek globoidalnych w GLD może reprezentować definiujące zdarzenie patogenne, a nie wtórną, reaktywną odpowiedź na uszkodzenie oligodendrocytów15. Ponadto rozregulowanie aktywności mikrogleju w GLD zostało uznane za czynnik ograniczający długoterminową skuteczność terapii hematopeotycznych komórkami macierzystymi w leczeniu tej choroby16. W związku z tym oczekuje się, że badanie funkcji komórkowych i regulacji mikrogleju i komórek globoidalnych w odpowiedzi na psychozynę dostarczy nowych informacji na temat patogenezy GLD.
Do niedawna brak odpowiedniego modelu, w którym można by badać powstawanie komórek globoidalnych, ograniczał zrozumienie dokładnej funkcji i udziału tych komórek w patologii GLD. W ostatnich badaniach ustalono, że komórki podobne do globoidalnych mogą powstawać w bezpośredniej odpowiedzi na psychozynę, patogenną toksynę lipidową, która gromadzi się w GLD. Odkryliśmy, że mikroglej, ale nie makrofagi, są aktywowane i przekształcane w komórki globoidalne w pierwotnych hodowlach gleju w odpowiedzi na psychozynę15. Stwierdzono, że w tej transformacji w komórki globoidalne pośredniczy proteaza zewnątrzkomórkowa, metaloproteinaza macierzy (MMP)-315. Niedawno rozszerzyliśmy te odkrycia i ustaliliśmy, że aktywowane psychozyną komórki mikrogleju i globoidalne rozwinięte w tym systemie modelowym in vitro są silnie toksyczne dla oligodendrocytów i komórek progenitorowych oligodendrocytów. W związku z tym, rozważając w kontekście GLD, wczesna akumulacja psychozyny i tworzenie komórek globoidalnych przed demielinizacją potwierdzałoby wyłaniającą się pierwotną i prawdopodobnie patogenną rolę mikrogleju w tej chorobie.
Proponujemy, że badanie tworzenia komórek globoidalnych ujawni nowe informacje na temat patogenezy GLD, które przyczynią się do naszego zrozumienia tej choroby. Co więcej, ten nowy model komórkowy GLD może zapewnić nowy format, na podstawie którego można testować nowatorskie podejścia terapeutyczne w celu przeciwdziałania patologicznym zmianom w tej chorobie. W związku z tym w niniejszym raporcie przedstawiamy szczegółowy protokół rozwoju in vitro komórek globoidalnych indukowanych psychozyną z pierwotnych kultur gleju niemielinizacyjnego.

<table><tbody><tr><td>Hank' s zrównoważony roztwór soli (HBSS) niezawierający kationów (Mg2+ i Ca2+).</td><td>Technologie życiowe</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji tkanek nerwowych</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &#956; m sitko do komórek</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s zrównoważony roztwór soli (HBSS) zawierający kationy (Mg2+ i Ca2+).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycyna</td><td>Technologie życia</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyna-EDTA</td><td>Technologie życiowe</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychozyna</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor sprzężony surowice</td><td>odpornościowe Technologie życia</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>podłoża montażowe</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów fagocytarnych</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Dokładna funkcja wielojądrowego mikrogleju, zwanego komórkami globoidalnymi, które są wyjątkowo obfite w ośrodkowym układzie nerwowym leukodystrofii komórek globoidalnych (GLD), jest niejasna. Ta luka w wiedzy została utrudniona przez brak odpowiedniego modelu badań in vitro. W niniejszym artykule opisujemy pierwotny mysi system hodowli glejowej, w którym leczenie psychozyną powoduje wielojądrowość mikrogleju przypominającą charakterystyczne komórki globoidalne występujące w GLD. Korzystając z tego nowatorskiego systemu, określiliśmy warunki i tryby analizy do badania komórek globoidalnych. Potencjalne zastosowanie tego systemu modelowego zostało potwierdzone w naszym poprzednim badaniu, w którym zidentyfikowano potencjalną rolę metaloproteinazy macierzy (MMP)-3 w GLD. Ten nowatorski system in vitro może być użytecznym modelem do badania powstawania i funkcjonowania, ale także potencjalnej manipulacji terapeutycznej tych unikalnych komórek.

Przewiduje się, że wykonanie niniejszego protokołu w opisanej formie zajmie około 36 dni od początku do końca (patrz Rycina 1: Schemat przebiegu doświadczenia). Nasze doświadczenia wskazują, że rozwój komórek „podobnych do globoidów” w tym pierwotnym systemie hodowli jest wiarygodny i powtarzalny: tworzenie komórek wielojądrowych w odpowiedzi na psychosynę jest konsekwentnie obserwowane po 7 dniach traktowania.
Barwienie immunocytochemiczne mikrogleju z użyciem Iba-1 w połącze...

Komórki globoidalne są charakterystyczną cechą patologiczną choroby Krabbego, leukodystrofii, która obecnie nie ma skutecznej długoterminowej terapii. Opracowaliśmy model hodowli komórkowej w celu zbadania wrodzonej biologii i potencjału chorobotwórczego aktywowanego mikrogleju oraz jego transformacji w komórki globoidalne.

Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie unikalnej transformacji mikrogleju w komórki GLO w obecności cykliny toksyny. Osiąga się to poprzez pierwsze pokrycie szkiełek nakrywkowych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. W drugim etapie komórki glejowe są posiewane na szkiełkach nakrywkowych, a następnie do kultur podaje się kulki cykliny i lateksu.W ostatnim etapie komórki są barwione przez immunochemię. Ostatecznie wpływ cykliny na zarodkowanie i zdolność fagocytarną komórek mikrogleju można ocenić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie linii komórkowych mikrogleju, jest to, że zastosowanie pierwotnych kultur glejowych naśladuje hipotetyczne interakcje między astrocytami I a mikroglejem w mózgach osób z leukodystrofią komórek pustki GLO lub GLD, demonstrując procedurę KO Claycomb, doktorant z mojego laboratorium.Aby przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte matrycą zewnątrzkomórkową lub ECM, należy najpierw namoczyć okrągłe szkiełka nakrywkowe sterylnym kwasem solnym na sterylnej szalce Petriego. Po 30 minutach umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie sterylną wodą, a następnie namocz je w 95% etano

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania prekursorów ograniczeń glejowych (Glial Restricted Precursors) z płodowych rdzeni kręgowych oraz ich utrzymywanie in vitro w celu transplantacji lub badania linii oligodendrocytów.

Wyizolowanie prekursorów ograniczonych do linii glejowej (GRP) od myszy w 13. dniu embrionalnym (E13)

Film demonstruje protokół różnicowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) na oligodendrocyty i indukowania mielinizacji w kokulturze z neuronami zwoju korzenia grzbietowego (DRG). OPC są transdukowane za pomocą wektorów lentiwirusowych kodujących białko sygnałowe, które reguluje mielinizację. Transdukowane OPC są hodowane wspólnie z neuronami DRG w celu oceny różnicowania w oligodendrocyty i mielinizacji indukowanej białkiem sygnałowym.

Test mielinizacji indukowanej transdukcją in vitro dla komórek prekursorowych oligodendrocytów

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Tutaj prezentujemy protokoły, które oferują elastyczną i strategiczną podstawę do wirusowego manipulowania komórkami prekursorowymi oligodendrocytów w celu nadekspresji interesujących białek w celu specyficznego zbadania ich roli w oligodendrocytach za pomocą modelu mielinizacji ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Aby zająć się mechanizmami demielinizacji i apoptozy neuronów w uszkodzeniach korowych zapalnych zaburzeń demielinizacyjnych, używane są różne modele zwierzęce. Opisujemy tutaj podejście ex vivo polegające na użyciu limfocytów T CD8 + specyficznych dla oligodendrocytów na wycinkach mózgu, co powoduje śmierć oligodendroglialną i neuronalną. Omówiono potencjalne zastosowania i ograniczenia modelu.

Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu

Tutaj opisujemy model ludzkiej bariery krew-mózg, umożliwiający badanie transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Organoidy mózgowe stanowią cenny model dla badań nad encefalomiopatią mitochondrialną, kwasicą mlekową oraz epizodami podobnymi do udaru (MELAS), oferując wgląd w ich podstawową patofizjologię i stanowiąc platformę do badań przesiewowych leków. Organoidy pochodzące z linii komórkowych o różnym poziomie heteroplazmy genów wywołujących chorobę wykazują istotne różnice fenotypowe.

Modelowanie chorób mitochondrialnych za pomocą organoidów mózgowych: Skupienie się na encefalomiopatii mitochondrialnej, kwasicy mlekowej oraz epizodach podobnych do udaru

Poznaj transformację mikroglii w komórki globoidalne w chorobie Krabbego przy użyciu modelu in vitro z cykliną. Ta metoda umożliwia badanie patofizjologii leukodystrofii i ocenę aktywności fagocytarnej.

Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

Przeglądaj więcej filmów