Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie metod i technik powszechnie stosowanych do pobierania próbek z gleby i izolacji nicieni enteropatogennych. W tym celu najpierw pobiera się próbki gleby metodą transektu lub, jak wykazano, metodą losowego pobierania próbek. Następnie próbki gleby zostały poddane obróbce przez owady, aby selektywnie odzyskać nicienie chorobotwórcze dla jelit.

Ostatnim krokiem jest zebranie nicieni od zakażonych owadów za pomocą zmodyfikowanej białej pułapki. W ostatecznym rozrachunku techniki te stanowią kluczowe kroki na drodze do pomyślnego ustanowienia enteropatogennych kultur nicieni w laboratorium i stanowią podstawę dalszych testów biologicznych. Zaletą techniki pobierania próbek z gleby jest to, że możemy udać się w teren i zebrać dojrzałe stadia nicieni chorobotwórczych.

I zamiast pobierania próbek dla owadów zarażonych tym nicieniami, które są rzadko spotykane. Stosowana przez nas strategia losowego doboru próby jest powszechnie stosowana do oceny różnorodności nicieni chorobotwórczych z dużego regionu lub obszaru geograficznego. Technika ta została po raz pierwszy opisana przez zakłady w Accur w 1975 roku.

Jest to selektywna procedura oparta na założeniu, że stadia wolnego życia będą przyciągane do żywicieli owadów i pasożytować na nich. Demonstrację procedur zademonstruje studentka Rue Orozco, absolwentka i technik badawczy Ming Mingle w moim laboratorium. Laboratorium. Miejsce pobierania próbek powinno mieć powierzchnię co najmniej dwóch metrów kwadratowych, a jeśli to możliwe, powinno być większe niż cztery metry kwadratowe.

Dla każdej próbki gleby należy pobrać co najmniej trzy mniejsze podpróbki na obszarze próbki DM a C. Podpróby można łączyć, jeśli spełnia to cele badania. Zbierz próbki gleby na głębokości od zera do 15 centymetrów.

Każda próbka powinna mieć od 250 gramów do jednego kilograma. Używaj łopat do gleby, łopat ręcznych lub podobnych narzędzi i zbieraj próbki z co najmniej pięciu losowych miejsc w każdym wybranym obszarze pobierania próbek. Każda próbka powinna być podwójnie zapakowana i oznaczona wodoodpornym markerem.

Etykieta powinna zawierać informacje o obszarze, lokalizacji, wysokości, dacie i zmiennych środowiskowych, takich jak opis siedliska wraz z powiązaną roślinnością i temperaturą na miejscu. Zanotuj lokalne owady i inne gatunki bezkręgowców. Zbieraj gatunki, których nie można natychmiast zidentyfikować w celu późniejszej identyfikacji w laboratorium między miejscami pobrania, dokładnie umyj narzędzia do zbierania wodą, a następnie zdezynfekuj je za pomocą 70% etanolu lub 0,5% wybielacza.

Przechowuj próbki gleby w lodówce w temperaturze od ośmiu do 15 stopni Celsjusza na czas transportu. CES oddziela jedną część próbki, aby przeanalizować ogólne cechy gleby, takie jak jej skład, tekstura, przewodność i tak dalej. Z każdej próbki gleby usuń zanieczyszczenia, które mogą prowadzić do zanieczyszczenia mikroorganizmami sejkowymi.

Następnie zwilż glebę wodą, aby nicienie mogły się w niej łatwo poruszać. Załaduj od 200 do 250 gramów wilgotnej gleby do plastikowego pojemnika z pokrywką. Następnie dodaj przynęty na owady.

Wystarczy od pięciu do 10 owadów. Załóż pokrywkę, odwróć pojemnik i umieść go w ciemności. W temperaturze pokojowej co dwa do trzech dni usuwaj martwe owady i w razie potrzeby zastąp je zdrowymi owadami w celu dodatkowego obciążenia.

Jeśli zwłoki owadów są brązowe lub ochrowe, sugeruje to, że Stein i Nema pasożytują na parit. Natomiast jeśli zwłoki są ceglastoczerwone do ciemnofioletowych, spodziewaj się hetero. Użyj zmodyfikowanej białej pułapki, aby zebrać nicienie, które pasożytowały na przynętach na owady.

Najpierw umieść pokrywkę szalki Petriego o średnicy 50 lub 60 milimetrów w podstawie naczynia o średnicy 100 milimetrów. Następnie umieść arkusz okrągłego watmana. Bibuła filtracyjna numer jeden w mniejszym naczyniu.

Opłucz zwłoki owadów wysterylizowaną wodą i przenieś je na bibułę filtracyjną. Rozłóż się tak, aby nie stykały się ze sobą. Napełnij tylko większe naczynie około 20 mililitrami wody destylowanej i przykryj zespół większymi naczyniami. Wieko.

Oznacz potrawy nazwą nicienia, datą i datą przynęty na owady. Pułapka jest ustawiona. Utrzymuj pułapki w temperaturze pokojowej i monitoruj, czy ze zwłok owadów nie pojawiają się zakaźne, młodociane nicienie lub IJ.

Może to potrwać od 10 do 25 dni i zależy od temperatury i poziomu wilgotności w miejscu, w którym trzymana jest pułapka. Jeśli poziom wody w syfonce wyparował, należy ją ponownie napełnić na talerzach z IJ. Zbierz wodę z większego naczynia, które powinno zawierać nicienie.

Pozwól nicieniom zatonąć na kilka minut, a następnie powoli zdekantuj wodę. Gdy nicienie pozostaną w niewielkiej objętości wody, spłucz je jeszcze kilka razy, dodając z powrotem wodę, a następnie ostrożnie ją wylewając. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia, aby oszacować populację nicieni.

W kolbie hodowlanej o pojemności 250 mililitrów dostosuj stężenie nicieni do poziomu od jednego do 3000 nicieni na mililitr. Przechowywać tę zawiesinę w temperaturze od 10 do 20 stopni Celsjusza. Ogólnie rzecz biorąc, w naturze szanse na znalezienie owadów pasożytujących na nicieniach chorobotwórczych entero są bardzo niskie.

W związku z tym przedstawiony protokół wykorzystujący larwy czerniaka G jako przynętę został wykorzystany do izolowania takich nicieni w znacznie bardziej efektywnym tempie. Po pięciu dniach owady zostały zainfekowane i miały czerwone zabarwienie. Zmodyfikowane białe pułapki pokazywały ślady nicieni.

Po 15 dniach od tych pułapek nicienie zebrały się w wodzie, miały czysty wygląd i były wolne od tkanek owadów. Pojedynczy cykl ekstrakcji z wykorzystaniem larw galu Melania może być niewystarczający do odzyskania wszystkich nicieni chorobotwórczych Oma, które znajdują się w próbce gleby. Dlatego zalecamy zrobienie tego wiele razy.

Radzimy również, aby użytkownicy rozważyli inne owady, a nie Gallerię, co również zwiększy szanse na powrót do zdrowia. Omawianie próbek gleby z owadami jest techniką, którą można również rozważyć w przypadku izolacji innych patogenów owadzich, takich jak bakterie lub grzyby.