Name: Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj metody pobierania próbek gleby i izolacji nicieni entomopatogenicznych z rodzin Steinernematidae i Heterorhabditidae. Techniki te umożliwiają skuteczne uzyskanie kultur laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować byłym członkom laboratorium Stock: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta i Victorii Miranda-Thompson za ich wkład w ulepszenie wielu z tych protokołów. Dziękujemy za wsparcie Narodowej Fundacji Nauki (granty IOS-0840932 i IOS-0724978) dla S. P. Stock.

1. Pobieranie próbek gleby
<ol>
	<li>Należy rozważyć pokrycie minimalnej powierzchni 2–4m2 dla każdego miejsca pobierania próbek.</li>
	<li>Próbki gleby należy pobrać na głębokości co najmniej 15 cm (rysunek 4).</li>
	<li>Pobrać co najmniej 5 losowych próbek w tym obszarze.</li>
	<li>Pobrać 3 podpróbki na próbkę. W zależności od celu badania, należy połączyć podpróbki lub zachować je oddzielnie.</li>
	<li>Umieść każdą próbkę w plastikowej torbie. Rozważ podwójne pakowanie, aby uniknąć wycieku próbek (rysunek 4).</li>
	<li>Oznacz próbki wodoodpornym markerem. Należy uwzględnić następujące informacje z każdego miejsca pobierania próbek: informacje o miejscu (w tym miejscowość/obszar/nazwę miejsca i informacje o współrzędnych GPS), datę, siedlisko, powiązaną roślinność, temperaturę, wysokość nad poziomem morza itp. 
	UWAGA: W stosownych przypadkach należy pobrać i/lub zarejestrować obecność owadów lub innych bezkręgowców pobranych wraz z próbką w celu późniejszej identyfikacji. Mogą one reprezentować potencjalnych naturalnych gospodarzy EPN.</li>
	<li>Narzędzia do pobierania próbek należy czyścić między próbkami, dokładnie myjąc je wodą i/lub dezynfekując 70% etanolem lub 0,5% roztworem wybielacza.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w chłodni (8–15 °C) podczas transportu do laboratorium.</li>
	<li>Pobrać część próbki gleby do analizy, aby uzyskać informacje na temat składu gleby, tekstury, wilgotności, przewodności elektrycznej lub innych pożądanych parametrów gleby.</li>
</ol>
2. Izolacja nicieni z próbek gleby: technika przynęty na owady
<ol>
	<li>Usuń wszelkie zanieczyszczenia (tj. kamienie, kawałki drewna lub kory, liście itp.) zebrane wraz z próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia mikroorganizmami sapamicznymi.</li>
	<li>Dodaj wodę, aby zwilżyć glebę i ułatwić przemieszczanie się nicieni. 
	UWAGA: Użyj butelki z rozpylaczem, aby powoli zwiększać poziom wilgotności gleby.</li>
	<li>Umieść około 200 do 250 ml wilgotnej gleby w czystym plastikowym pojemniku z pokrywką.</li>
	<li>Dodaj przynęty na owady. Rozważ od 5 do 10 owadów na powierzchni gleby w każdej próbce (ryc. 5).</li>
	<li>Przykryj pojemnik pokrywką i odwróć pojemniki do góry nogami.</li>
	<li>Pojemniki należy przechowywać w ciemności i w temperaturze pokojowej (zwykle 22 - 25 °C).</li>
	<li>Sprawdzaj pojemniki co 2-3 dni i usuwaj martwe owady. 
	UWAGA: dodaj dodatkowe zdrowe owady do każdego pojemnika w celu dalszego nęcenia próbki gleby.</li>
	<li>Usuń martwe owady z pojemników. UWAGA: Zwłoki o brązowym lub ochrowym zabarwieniu są zwykle pasożytowane przez steinernematydy, podczas gdy zwłoki od ceglastoczerwonych do ciemnofioletowych są pasożytowane przez heterorhabditidae.</li>
	<li>Opłucz zwłoki w sterylnej wodzie.</li>
	<li>Umieścić zwłoki w zmodyfikowanej białej pułapce w celu odzyskania potomstwa nicieni (patrz procedura poniżej).</li>
</ol>
3. Odzyskiwanie nicieni z zainfekowanych zwłok: Zmodyfikowana biała pułapka
<ol>
	<li>Umieść górną część szalki Petriego o średnicy 50 (lub 60) mm w większym naczyniu (100 mm).</li>
	<li>Umieść jedną pojedynczą okrągłą bibułę filtracyjną (Whatman #1) w mniejszym naczyniu.</li>
	<li>Umieść zwłoki na bibule filtracyjnej mniejszego naczynia, upewniając się, że zwłoki nie stykają się ze sobą, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Zewnętrzną (większą) szalkę Petriego napełnić ok. 20 ml sterylnej wody destylowanej. Nie dolewaj wody do naczynia, w którym znajdują się zwłoki.</li>
	<li>Przykryj dużą szalkę Petriego i jej zawartość pokrywką (Rysunek 6).</li>
	<li>Odpowiednio oznacz potrawy. Dodać następujące informacje: nazwę nicienia (gatunek/izolat), datę zakażenia (datę ustaloną infekcję) i datę pułapki (jest to data założenia pułapki).</li>
	<li>Trzymaj pułapkę w RT do momentu pojawienia się zakaźnych stadiów młodocianych (IJ). Proces ten może trwać od 10 do 25 dni, w zależności od rozważanego gatunku i/lub szczepu nicieni.</li>
	<li>Zbieraj wodę za pomocą IJ, wyjmując większe naczynie z pułapki i wlewając wodę z nicieniami do zlewki.</li>
	<li>Pozwól nicieniom zdekantować się na dno zlewki. Ten proces może potrwać kilka minut.</li>
	<li>Ostrożnie zalej wodą, upewniając się, że nicienie pozostały na dnie zlewki.</li>
	<li>Opłucz nicienie, dodając więcej wody i pozwalając nicieniom zdekantować. Ten krok można powtórzyć 2-3 razy, aż woda będzie czysta.</li>
	<li>Umieścić zawiesinę nicieni w kolbie do hodowli tkankowej (250 ml). Stężenie zawiesiny należy utrzymać na poziomie 1 000 - 3 000 nicieni/ml.</li>
	<li>Kolbę z zawiesiną nicieni przechowywać w chłodni lub w inkubatorze w temperaturze 10 - 20 °C. 
	UWAGA: Przechowywać kolby należy okresowo sprawdzać, ponieważ okres trwałości EPN jest zmienny. Zwykle steinernematydy mogą być przechowywane przez 6 - 12 miesięcy bez konieczności hodowli, podczas gdy heterorhabditidae mogą wymagać bardziej okresowych badań kontrolnych.</li>
</ol>

<ol><li>Bedding, R. A., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+the+detection+of+insect+parasitic+rhabditid+nematodes+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil.</a> Nematologica. 21, 109-110 (1975).</li>
<li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+NE+%22The+Genera+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.+In+The+Prokaryotes%22">The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes</a>. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).</li>
<li>Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematology%22">Entomopathogenic Nematology</a>. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).</li>
<li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematode+s+in+Biological+Control%22">Entomopathogenic Nematode s in Biological Control</a>. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).</li>
<li>Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+entomopathogenic+nematodes+%28Rhabditida%3A+Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29+in+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Biodiversit.%2C+%26+Conservation%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey.</a> Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Kaya, H. K., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaya%2C+HK+%22Techniques+in+insect+nematology.+In+Manual+of+techniques+in+insect+pathology%22">Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology</a>. , Academic Press. London. 281-324 (1997).</li>
<li>Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLacey%2C+LA+%22Manual+of+techniques+in+invertebrate+pathology%22">Manual of techniques in invertebrate pathology</a>. , Academic Press. London. (2012).</li>
<li>McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+other+natural+enemies+as+mortality+factors+for+larvae+of+Diaprepes+abbreviatus+%28Coleoptera%3A+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae).</a> Biological Control. 19, 182-190 (2000).</li>
<li>Meyling, N. V., Eilenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+and+distribution+of+soil+borne+entomopathogenic+fungi+within+a+single+organic+agroecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%2C+ecosystem.%2C+%26+environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem.</a> Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).</li>
<li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoinar%2C+GO+%22Taxonomy+and+biology+of+Steinernematidae+and+Heterorhabditidae.+In%3A+Entomopathogenic+Nemtaodes+in+Biological%22">Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological</a>. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).</li>
<li>Stock, S. P., Gress, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+phylogenetic+relationships+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29+from+the+Sky+Islands+of+southern+Arizona%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona.</a> Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).</li>
<li>Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Nematodes+as+biological+control+agents.+CAB+International+Publishing%22">Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing</a>. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Stuart, R. J., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patchiness+in+populations+of+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Ta demonstracja jest pierwszą z dwóch prezentacji, które opisują szereg technik, które są powszechnie stosowane do badania EPN i ich symbiotycznych bakterii. Techniki te stanowią kluczowe kroki na drodze do pomyślnego ustanowienia kultur EPN w laboratorium, a także stanowią podstawę dla innych testów biologicznych, które wykorzystują EPN jako organizmy modelowe do badań.
Różne badania glebowe EPN wykazały, że ich obfitość i rozmieszczenie mogą się różnić w zależności od pory roku, siedlisk i r...

Wiele nicieni jest związanych z owadami, a ich interakcje z gospodarzami wahają się od korzystnych do szkodliwych. W tym miejscu skupimy się na grupie nicieni, które są patogenami owadów, znanych również jako nicienie entomopatogeniczne (lub EPN). Do tej grupy nicieni należą dwie rodziny nicieni: Steinernematidae i Heterorhabditidae11,13. Ich działanie chorobotwórcze jest w rzeczywistości zapewnione przez interakcję z fakultatywnymi beztlenowymi bakteriami jelitowymi (bakterie Xenorhabdus wiążą się ze steinernematidami, a bakterie Photorhabdus z heterorhabditidami)2. Bakterie są przenoszone z jednego żywiciela owada na drugiego przez jedyne wolno żyjące stadium nicienia, zakaźny młodociany trzeci stopień (znany również jako młody dauer, młodociany zakaźny lub IJ), który żyje w glebie. Po dostaniu się do owada nicienie uwalniają bakterie do hemolimfy owada, które zabijają owada gospodarza przez masywną posocznicę. Bakterie degradują również tkanki owadów i stają się źródłem pożywienia nicieni, umożliwiając im dojrzewanie i rozmnażanie się. Zwykle w zwłokach owadów wytwarza się jedno lub dwa pokolenia dorosłych nicieni. Potomstwo ostatniego dorosłego pokolenia ponownie kojarzy się z kilkoma komórkami bakteryjnymi w bardziej wyspecjalizowany sposób niż ich poprzedni związek żywieniowy i pielęgnuje te komórki w swoich jelitach, gdy przemieszczają się z tuszy owada do gleby, gdzie będą czekać na innego owada, który zaaplikuje się6,11,14 (ryc. 1).
Od czasu ich odkrycia w 1927 roku, EPN są uważane za wartościową alternatywę dla chemicznych pestycydów, ponieważ mogą pasożytować na szerokiej gamie owadów, które są szkodnikami rolniczymi3,4,5. Jednak w ciągu ostatnich dwóch dekad nicienie te i ich symbiotyczne bakterie zostały uznane za plastyczny system modelowy do badania biologicznych, ekologicznych i ewolucyjnych aspektów interakcji gospodarz-mikroorganizm.
Celem tej prezentacji jest pokazanie metod i technik najczęściej używanych do pobierania próbek gleby i izolowania EPN. Dostępnych jest wiele narzędzi, które mogą być używane do pobierania próbek gleby, w tym między innymi: rdzenie glebowe, kielnie, koparki do otworów po słupach, świdry, rurki do pobierania próbek, łopaty ręczne (rysunek 2).
W zależności od celu badania, można rozważyć dwie strategie doboru próby: a) warstwowe, b) losowe próbkowanie (Rysunek 3). Próbkowanie warstwowe jest zwykle stosowane jako część intensywnego badania na określonym lub oznaczonym obszarze w danym okresie czasu. Ogólnie rzecz biorąc, transekt jest oznaczany, a próbki gleby są pobierane w określonych odstępach czasu w transekcie przez pewien okres czasu (rysunek 3A)15. Losowe pobieranie próbek jest zwykle stosowane, gdy skupiamy się na rozległym obszarze. Ta strategia pobierania próbek została wykorzystana do zbadania różnorodności EPN z dużego obszaru geograficznego lub regionu (rysunek 3B)12. W zależności od przedmiotu badania można wziąć pod uwagę szereg czynników, w tym zróżnicowany zakres wysokości, teksturę gleby i siedliska (np. pola uprawne, lasy, pastwiska, parki, wybrzeża morskie, obszary nadbrzeżne itp.).
Pokazujemy technikę nęcenia owadów, która została pierwotnie opisana przez Beddinga i Akhursta1 i stanowi prostą i selektywną alternatywę dla odzyskiwania EPN z próbek gleby. Jest to selektywna procedura, która opiera się na założeniu, że nicienie (stadium IJ) zostaną przyciągnięte do owada żywiciela i pasożytują na nim. Technika ta może być również brana pod uwagę w przypadku izolacji innych patogenów owadzich, takich jak grzyby i bakterie8,10.
Pokazujemy również zmodyfikowaną technikę białej pułapki, która jest używana do pobierania potomstwa nicieni od zakażonych gospodarzyowadów 7,14. Jest to bezproblemowa metoda, która ma tę zaletę, że pozwala na odzyskanie "czystego" potomstwa nicieni wolnego od szczątków z rozkładających się zwłok owadów.
Na koniec, techniki opisane i pokazane w tym artykule odpowiadają tym wymyślonym i/lub wykonanym w naszym laboratorium, jak również tym opisanym przez różnych kolegów i współpracowników.

<table><tbody><tr><td>Galleria mellonella</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>Do techniki nęcenia owadów</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna, 55 mm Celuloza klasy 1</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-048</td><td>Komora infekcyjna i zespół białej pułapki</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>Zespół komory infekcyjnej i białej pułapki</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 100 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Komora infekcyjna i zespół białej pułapki</td></tr><tr><td>Worki plastikowe ZIPloc</td><td>Ace Hardware lub lokalny sklep</td><td></td> z narzędziami <td>Pobieranie próbek gleby</td></tr><tr><td>Pipeta mechaniczna P1000, P200 ml</td><td>VWR</td><td>89130-562; 89130-566&nbsp;</td><td>Zespół komory infekcyjnej i białej pułapki</td></tr><tr><td>Końcówki do pipetorów 1000ml, 200 ml</td><td>VWR</td><td>16466-004 ; 53510</td><td>Komora infekcyjna i zespół białej pułapki</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Ace Hardware lub lokalny sklep</td><td></td> z narzędziami <td>Pobieranie próbek gleby, dezynfekcja</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Ace Hardware lub lokalny sklep</td><td></td> z narzędziami <td>Pobieranie próbek gleby, dezynfekcja</td></tr><tr><td>70% alochol etylowy</td><td>AAPER</td><td>17212945</td><td>Pobieranie próbek gleby, dezynfekcja</td></tr><tr><td>Łopaty</td><td>Ace Hardware lub lokalny sklep z narzędziami</td><td>Nie dotyczy</td><td>Pobieranie próbek gleby</td></tr><tr><td>Próbnik rurowy</td><td>Accuproducts</td><td></td><td>Pobieranie próbek gleby</td></tr><tr><td>Sonda gleby, długa rękojeść</td><td>Nupla&nbsp;</td><td>PRB4T 69401 Klasyczny</td><td>Pobieranie próbek gleby</td></tr><tr><td>Taśma miernicza</td><td>Ace Hardware lub lokalny sklep</td><td></td> z narzędziami <td>Pobieranie próbek gleby</td></tr><tr><td>Taśma flagująca, różne kolory</td><td>Ace Hardware lub lokalny sklep</td><td></td> z narzędziami <td>Pobieranie próbek gleby</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych</td><td>VWR</td><td>Falcon, 29185-304&nbsp;</td><td>Biała pułapka, kolekcja EPN</td></tr><tr><td>Butelki do mycia, polietylenowe, szerokie otwory</td><td>VWR</td><td>16650-107</td><td>Biała syfon, kolekcja EPN</td></tr></tbody></table>

pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (steinernematidae, heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Nicienie entomopatogeniczne (znane również jako EPN) reprezentują grupę nicieni zamieszkujących glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów. Nicienie te należą do dwóch rodzin: Steinernematidae i Heterorhabditidae. Do tej pory w Steinernematidae opisano ponad 70 gatunków, a w Heterorhabditidae jest około 20 gatunków. Nicienie mają wzajemne partnerstwo z bakteriami Enterobacteriaceae i razem działają jako silny kompleks owadobójczy, który zabija szeroką gamę gatunków owadów.
Tutaj skupiamy się na najczęstszych technikach branych pod uwagę przy zbieraniu EPN z gleby. Druga część tej prezentacji skupia się na technice nęcenia owadów, szeroko stosowanym podejściu do izolacji EPN z próbek gleby, oraz na zmodyfikowanej technice białej pułapki, która jest stosowana do odzyskiwania tych nicieni od zakażonych owadów. Te metody i techniki są kluczowymi krokami do pomyślnego ustanowienia kultur EPN w laboratorium, a także stanowią podstawę dla innych testów biologicznych, które traktują te nicienie jako organizmy modelowe do badań w innych dyscyplinach biologicznych. Techniki przedstawione w tej prezentacji odpowiadają technikom wykonywanym i/lub zaprojektowanym przez członków laboratorium S. P. Stock, jak również tym opisanym przez różnych autorów.

Pobieranie próbek gleby
Zakaźne młodzieńce trzeciego stadium (IJ) EPN są jedynymi wolnożyjącymi stadiami w cyklu życiowym tych nicieni, które bytują w glebie (Rysunek 1). W związku z tym pobieranie próbek gleby jest bardzo wydajną metodą izolacji tych nicieni. Rysunek 4 przedstawia profil gleby ze wskazaniem głębokości, z której należy pobierać próbki. Zachowanie wilgotności próbki jest kluczowym czynnikiem dla przetrwania nicieni. W konsekwencji ważne jest pr...

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów. Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie metod i technik powszechnie stosowanych do pobierania próbek z gleby i izolacji nicieni enteropatogennych. W tym celu najpierw pobiera się próbki gleby metodą transektu lub, jak wykazano, metodą losowego pobierania próbek. Następnie próbki gleby zostały poddane obróbce przez owady, aby selektywnie odzyskać nicienie chorobotwórcze dla jelit.Ostatnim krokiem jest zebranie nicieni od zakażonych owadów za pomocą zmodyfikowanej białej pułapki. W ostatecznym rozrachunku techniki te stanowią kluczowe kroki na drodze do pomyślnego ustanowienia enteropatogennych kultur nicieni w laboratorium i stanowią podstawę dalszych testów biologicznych. Zaletą techniki pobierania próbek z gleby jest to, że możemy udać się w teren i zebrać dojrzałe stadia nicieni chorobotwórczych.I zamiast pobierania próbek dla owadów zarażonych tym nicieniami, które są rzadko spotykane. Stosowana przez nas strategia losowego doboru próby jest powszechnie stosowana do oceny różnorodności nicieni chorobotwórczych z dużego regionu lub obszaru geograficznego. Technika ta została po raz pierwszy opisana przez zakłady w Accur w 1975 roku.Jest to selektywna procedura oparta na założeniu, że stadia wolnego życia będą przyciągane do żywicieli owadów i pasożytować na nich. Demonstrację procedur zademonstruje studentka Rue Orozco, absolwentka i technik badawczy Ming Mingle w moim laboratorium. Laboratorium. Miejsce pobierania próbek powinno mieć powierzchnię co najmniej dwóch metrów kwadratowych, a jeśli to możliwe, powinno być większe niż cztery metry kwadratowe.Dla każdej próbki gleby należy pobrać co najmniej trzy mniejsze podpróbki na obszarze próbki DM a C. Podpróby można łączyć, jeśli spełnia to cele badania. Zbierz próbki gleby na głębokości od zera do 15 centymetrów.Każda próbka powinna mieć od 250 gramów do jednego kilograma. Używaj łopat do gleby, łopat ręcznych lub podobnych narzędzi i zbieraj próbki z co najmniej pięciu losowych miejsc w każdym wybranym obszarze pobierania próbek. Każda próbka powinna być podwójnie zapakowana i oznaczona wodoodpornym markerem.Etykieta powinna zawierać informacje o obszarze, lokalizacji, wysokości, dacie i zmiennych środowiskowych, takich jak opis siedliska wraz z powiązaną roślinnością i temperaturą na miejscu. Zanotuj lokalne owady i inne gatunki bezkręgowców. Zbieraj gatunki, których nie można natychmiast zidentyfikować w celu późniejszej identyfikacji w laboratorium między miejscami pobrania, dokładnie umyj narzędzia do zbierania wodą, a następnie zdezynfekuj je za pomocą 70% etanolu lub 0,5% wybielacza.Przechowuj próbki gleby w lodówce w temperaturze od ośmiu do 15 stopni Celsjusza na czas transportu. CES oddziela jedną część próbki, aby przeanalizować ogólne cechy gleby, takie jak jej skład, tekstura, przewodność i tak dalej. Z każdej próbki gleby usuń zanieczyszczenia, które mogą prowadzić do zanieczyszczenia mikroorganizmami sejkowymi.Następnie zwilż glebę wodą, aby nicienie mogły się w niej łatwo poruszać. Załaduj od 200 do 250 gramów wilgotnej gleby do plastikowego pojemnika z pokrywką. Następnie dodaj przynęty na owady.Wystarczy od pięciu do 10 owadów. Załóż pokrywkę, odwróć pojemnik i umieść go w ciemności. W temperaturze pokojowej co dwa do trzech dni usuwaj martwe owady i w razie potrzeby zastąp je zdrowymi owadami w celu dodatkowego obciążenia.Jeśli zwłoki owadów są brązowe lub ochrowe, sugeruje to, że Stein i Nema pasożytują na parit. Natomiast jeśli zwłoki są ceglastoczerwone do ciemnofioletowych, spodziewaj się hetero. Użyj zmodyfikowanej białej pułapki, aby zebrać nicienie, które pasożytowały na przynętach na owady.Najpierw umieść pokrywkę szalki Petriego o średnicy 50 lub 60 milimetrów w podstawie naczynia o średnicy 100 milimetrów. Następnie umieść arkusz okrągłego watmana. Bibuła filtracyjna numer jeden w mniejszym naczyniu.Opłucz zwłoki owadów wysterylizowaną wodą i przenieś je na bibułę filtracyjną. Rozłóż się tak, aby nie stykały się ze sobą. Napełnij tylko większe naczynie około 20 mililitrami wody destylowanej i przykryj zespół większymi naczyniami. Wieko.Oznacz potrawy nazwą nicienia, datą i datą przynęty na owady. Pułapka jest ustawiona. Utrzymuj pułapki w temperaturze pokojowej i monitoruj, czy ze zwłok owadów nie pojawiają się zakaźne, młodociane nicienie lub IJ.Może to potrwać od 10 do 25 dni i zależy od temperatury i poziomu wilgotności w miejscu, w którym trzymana jest pułapka. Jeśli poziom wody w syfonce wyparował, należy ją ponownie napełnić na talerzach z IJ. Zbierz wodę z większego naczynia, które powinno zawierać nicienie.Pozwól nicieniom zatonąć na kilka minut, a następnie powoli zdekantuj wodę. Gdy nicienie pozostaną w niewielkiej objętości wody, spłucz je jeszcze kilka razy, dodając z powrotem wodę, a następnie ostrożnie ją wylewając. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia, aby oszacować populację nicieni.W kolbie hodowlanej o pojemności 250 mililitrów dostosuj stężenie nicieni do poziomu od jednego do 3000 nicieni na mililitr. Przechowywać tę zawiesinę w temperaturze od 10 do 20 stopni Celsjusza. Ogólnie rzecz biorąc, w naturze szanse na znalezienie owadów pasożytujących na nicieniach chorobotwórczych entero są bardzo niskie.W związku z tym przedstawiony protokół wykorzystujący larwy czerniaka G jako przynętę został wykorzystany do izolowania takich nicieni w znacznie bardziej efektywnym tempie. Po pięciu dniach owady zostały zainfekowane i miały czerwone zabarwienie. Zmodyfikowane białe pułapki pokazywały ślady nicieni.Po 15 dniach od tych pułapek nicienie zebrały się w wodzie, miały czysty wygląd i były wolne od tkanek owadów. Pojedynczy cykl ekstrakcji z wykorzystaniem larw galu Melania może być niewystarczający do odzyskania wszystkich nicieni chorobotwórczych Oma, które znajdują się w próbce gleby. Dlatego zalecamy zrobienie tego wiele razy.Radzimy również, aby użytkownicy rozważyli inne owady, a nie Gallerię, co również zwiększy szanse na powrót do zdrowia. Omawianie próbek gleby z owadami jest techniką, którą można również rozważyć w przypadku izolacji innych patogenów owadzich, takich jak bakterie lub grzyby.

soil-sampling-isolation-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Celem tej prezentacji jest zademonstrowanie in vivo i in vitro technik hodowli nicieni entomopatogenicznych. Metody in vivo uwzględniają hodowlę tych nicieni z owadem żywicielem, podczas gdy metody in vitro wykorzystują bogate podłoża agarowe.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Ten protokół przedstawia metodę efektywnego wydobywania żywych nicieni z naturalnych substratów w terenie.

Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Przedstawiamy dwie metody masowego rozmnażania nicieni entomopatogenicznych jako bioinsektycydów dla rolników. Pierwsza metoda wykorzystuje żel poliakrylamidu jako podłoże do hodowli nicieni, podczas gdy druga metoda wykorzystuje bawełnę polimerową jako podłoże do hodowli. Obie metody opierają się na in vivo rozmnażaniu nicieni wewnątrz padlin owadów.

Uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych

Ta metoda wyjaśnia, jak zbudować i obsługiwać ciągłą komorę do znakowania izotopów 13C i 15N do jednolitego lub zróżnicowanego etykietowania tkanek roślinnych. Omówiono reprezentatywne wyniki znakowania metabolicznego i strukturalnego Andropogon gerardii.

Konstrukcja i działanie komory do ciągłego znakowania izotopami 13C i 15N do jednorodnego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania izotopów roślinnych

Lizymetria terenowa i pobieranie próbek wody porowej pozwalają badaczom ocenić los substancji chemicznych stosowanych w glebach i ustalonej roślinności. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie, w jaki sposób zainstalować wymagane oprzyrządowanie i pobrać próbki do analizy chemicznej podczas zintegrowanych eksperymentów z lizymetrią polową i pobieraniem próbek wody porowej.

Zintegrowana lizymetria polowa i pobieranie próbek wody porowej w celu oceny mobilności chemicznej w glebach i zastanej roślinności

Poznaj metody pobierania próbek gleby i izolacji nicieni entomopatogenicznych z rodzin Steinernematidae i Heterorhabditidae. Techniki te umożliwiają skuteczne uzyskanie kultur laboratoryjnych.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Przeglądaj więcej filmów