Kwantyfikacja mutacji komórek macierzystych okrężnicy
25 września 2015
Zgłaszamy znaczące ulepszenia w zakresie powtarzalnego pomiaru mutacji somatycznych komórek macierzystych okrężnicy po ekspozycji myszy na potencjalne czynniki uszkadzające DNA.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie fenotypowych mutacji somatycznych w dehydrogenazie glukozy sześciofosforanowej lub genie G6 PD w komórkach macierzystych okrężnicy. Po leczeniu zwierząt przypuszczalnymi czynnikami genotoksycznymi, osiąga się to poprzez najpierw traktowanie zwierząt środkiem odczekającym odpowiednią ilość czasu, aby umożliwić potomstwu komórki macierzystej niosącej mutację G6 PD pełne zasiedlenie krypty, poświęcenie zwierzęcia, usunięcie okrężnicy i uformowanie jej w szwajcarską bułkę oraz zamrożenie tkanki w ciekłym azocie. Drugim krokiem jest przygotowanie zamrożonych skrawków o grubości siedmiu mikronów na szkiełkach z jelita grubego za pomocą kriostatu.
Tkanka jest podgrzewana do 37 stopni Celsjusza, a następnie wokół skrawków tkanki budowane są studzienki na barwienie tkanki. Ostatnim krokiem jest inkubacja skrawków tkanek z mieszaniną barwiącą G six PD, a następnie analiza skrawków pod mikroskopem świetlnym: komórki z aktywnością G 6 PD zabarwiają się na niebiesko, podczas gdy te z mutacjami fenotypowymi wydają się białawe. Ostatecznie do określenia częstości mutacji stosuje się kwantyfikację zmutowanych cripów.
Technika ta mierzy mutacje somatyczne dehydrogenazy fosforanowej glukozy w komórkach macierzystych i jest to krytyczna populacja komórek w kancerogenezie jelita grubego. Identyfikując mutacje somatycznych komórek macierzystych, możliwe jest powiązanie częstości mutacji z incydentami raka jelita grubego u leczonych zwierząt. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat mutacji komórek macierzystych w okrężnicy, może być również stosowana do innych organizmów modelowych lub układów narządów.
Jeśli można zidentyfikować niszę komórek macierzystych, Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z przygotowaniem roztworu MBT. Solubilizacja. Rozwiązanie MBT wymaga starannego zwrócenia uwagi na szczegółowe instrukcje. Aby rozpocząć przygotowywanie histologicznego roztworu barwiącego o wartości dwóch mililitrów pH 7,4 buforu fosforanowego do 35 mililitrów optymalnej temperatury cięcia lub pożywki OCT w probówce o pojemności 50 mililitrów i energicznie wstrząsnąć, aby połączyć za pomocą bibuły pH.
Potwierdzono, że roztwór ma pH około 7,4. Następnie w glukozie sześć fosforanów i DP oraz roztwór chlorku magnezu rozpuszczono w buforze fosforanowym, jak wskazano w protokole tekstowym, i ponownie potwierdzono, że pH roztworu pozostaje około 7,4. Dodaj roztwór M-M-P-M-S i energicznie wymieszaj.
Powinno to spowodować uzyskanie klarownego, ciemnoczerwonego homogenatu, owiń roztwór w folię, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Jeśli roztwór stanie się mętny, należy go wyrzucić podczas podgrzewania kąpieli olejowej. Oddzielnie przygotuj pięciomilimolowy roztwór błękitu nitro do teraz oleum lub MBT, mieszając 0,4 mililitra dimetyloformamidu, 0,4 mililitra bezwodnego etanolu i MBT w dwumililitrowej probówce z pokrywką typu O-ring, luźno zamknij probówkę i doprowadź do energicznego wrzenia w kąpieli olejowej, aż MBT się rozpuści.
Następnie pozwól roztworowi MBT ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie dodaj go do mieszaniny reakcyjnej OCT. Roztwór może z czasem zmienić kolor z początkowego pomarańczowo-czerwonego na ciemnoczerwony lub fioletowy. Po leczeniu zwierząt i przygotowaniu zamrożonych skrawków zgodnie ze wskazaniami w protokole tekstowym, zbuduj studzienki do barwienia tkanek za pomocą dwóch stalowych podkładek połączonych ze sobą smarem silikonowym, dopasuj perfumy do podstawy myjki i wytnij środek, w którym zostanie umieszczony roztwór zastąpiony.
Przed wojną zamrożona tkanka ślizga się w wilgotnym pomieszczeniu o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie umieścić studzienki na szkiełku, aby otoczyć skrawki tkanek około pół mililitra wcześniej przygotowanej mieszaniny barwiącej G 6 PD do każdej studzienki z wycinkiem tkanki i inkubować przez 45 do 50 minut. Wyjmij szkiełka z ciepłego pomieszczenia i ostrożnie wyjmij ze szkiełek ze stali nierdzewnej ze szkiełek.
Umieść szkiełka na dłuższej krawędzi i odcedź mieszaninę mieszaniny reakcyjnej, a następnie przepłucz przez 30 do 60 minut i przygotuj 100-milimolowy bufor fosforanowy. Aby usunąć ostatnie ślady roztworu barwiącego G six PD, płucz szkiełka i dejonizowaną wodę przez pięć do 10 minut, aby usunąć resztki buforu fosforanowego. Na koniec uszczelnij tkankę, dodając kroplami żel fluorowy do szkiełka i susz przez 30 minut, aby uzyskać obrazy do późniejszej analizy.
Umieść szkiełko w mikroskopie świetlnym i ustaw na cztery powiększenia DX. Następnie zrób zdjęcia wybarwionej tkanki za pomocą kamery o rozdzielczości 5,0 megapikseli, aby oszacować całkowitą liczbę badanych krypt. Dla każdej myszy wybierz sekcję z poziomu o najmniejszej powierzchni i zobrazuj ją w powiększeniu 10x.
Policz liczbę zmutowanych cripów. Zgodnie z poniższymi kryteriami cała krypta pozbawiona jest koloru niebieskiego. Zewnętrzna struktura krypty jest nienaruszona.
Mutant jest obserwowany na sąsiednich odcinkach o siedmiu mikronach i dwóch obserwatorach Identyfikuj tę samą kryptę jako mutanta. Wizualnie policz liczbę krypt w tej sekcji i pomnóż przez liczbę poziomów przesiewanych dla każdego dwukropka. Przykłady zmutowanych Crips zaobserwowanych u myszy leczonych czynnikiem uszkadzającym DNA, azoksymetanem, można zobaczyć tutaj po lewej stronie, widać pionowy lub odgórny widok zmutowanej krypty.
Podczas gdy po prawej stronie znajduje się widok poziomy lub boczny, aby krypta została uznana za zmutowaną, wszystkie komórki w krypcie muszą pozostać. Białe krypty z niewielką ilością bieli są spowodowane produkcją śluzu z komórek kubkowych. Częstotliwość mutacji jest obliczana jako liczba zaobserwowanych mutantów podzielona przez całkowitą liczbę krypt, w których nie przebadano żadnego mutanta.
Krępy zaobserwowano w okrężnicy u myszy kontrolnych reprezentujących częstość mutacji mniejszą niż jeden razy 10 do minus piątej, podczas gdy myszy leczone azoksymetanem wykazywały częstość mutacji komórek macierzystych 4,44 razy 10 do minus czterech. Inne metody, takie jak analiza genetyczna rodzaju mutacji dehydrogenazy glukozy x fosforanu, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób czynnik chemiczny błędnie koduje mutację. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć mutacje somatycznych komórek macierzystych u myszy leczonych potencjalnymi związkami mutagennymi i rakotwórczymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia metodę ilościowego określania mutacji somatycznych w komórkach macierzystych jelita grubego po wystawieniu na potencjalne czynniki uszkadzające DNA. Skupia się na genie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD) oraz procesie pomiaru częstości mutacji u myszy po leczeniu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Biologia komórek macierzystych
Tło
- Mutacje somatyczne mogą wpływać na funkcjonowanie komórek i przyczyniać się do chorób.
- G6PD jest krytycznym genem dla metabolizmu komórkowego.
- Zrozumienie częstości mutacji pomaga w ocenie efektów genotoksycznych.
- Komórki macierzyste jelita grubego są niezbędne do regeneracji i homeostazy tkanki.
Cel badania
- Rozwój metody do ilościowego określania mutacji somatycznych.
- Ocenienie wpływu czynników genotoksycznych na komórki macierzyste jelita grubego.
- Ilościowe określenie częstości mutacji genu G6PD.
Stosowane metody
- Leczenie myszy potencjalnymi czynnikami uszkadzającymi DNA.
- Czas na pozwolenie potomstwu komórek macierzystych na zasiedlenie krypt jelita grubego.
- Przygotowanie zamrożonych sekcji tkanki z jelita grubego.
- Barwienie i analiza sekcji pod mikroskopem świetlnym.
Główne wyniki
- Udana ilościowa ocena mutowanych krypt u myszy po leczeniu.
- Identyfikacja mutacji fenotypowych poprzez barwienie.
- Ustawienie niezawodnej metody pomiaru mutacji.
- Znaczące ulepszenia w powtarzalności wyników.
Wnioski
- Metoda dostarcza cennego narzędzia do badań nad mutacjami somatycznymi.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia efektów czynników genotoksycznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii dla dalszych wnikliwości.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying somatic mutations in colonic stem cells enables early detection of genotoxic effects from candidate compounds, directly informing risk assessment in oncology drug discovery. This phenotypic assay provides predictive confidence for mechanistic de-risking at the target validation stage, supporting portfolio triage and prioritization of compounds with lower carcinogenic liability. The method's reproducibility and quantitative outputs strengthen cross-functional decision-making in preclinical safety evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of mutation frequency in critical stem cell populations following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by linking genotoxicity to functional outcomes in tissue-resident stem cells.
- Provides quantitative evidence for target validation and early-stage compound triage.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, reproducible enzymatic assay for detecting phenotypic mutations in situ.
- Facilitates standardization of genotoxicity screening across compound libraries.
- Generates quantitative, observer-confirmed outputs suitable for comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mutation frequency data with disease-relevant endpoints in colon carcinogenesis models.
- Enables continuity from discovery-stage genotoxicity findings to preclinical safety assessment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on stem cell mutation burden.
Pipeline & Workflow Integration
This phenotypic mutation quantification assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early genotoxicity assessment with downstream safety workflows.
- Discovery Biology: Provides a direct readout of somatic mutation induction in stem cells, clarifying compound mechanism-of-action risks.
- Screening: Offers reproducible, quantitative mutation frequency data for compound ranking and selection.
- Analytics: Enables statistical comparison of mutation rates between treatment and control groups, supporting data-driven decisions.
- Translational Research: Connects in vivo mutation data to disease-relevant models of carcinogenesis.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organ systems or model organisms with identifiable stem cell niches.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genotoxicity risk and target validation.
- Operational Value: Standardizes mutation detection and quantification for reproducible results.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage attrition due to unforeseen carcinogenicity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on stem cell mutation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue processing, cryosectioning, and enzymatic histochemistry.
- Demands access to cryostats, light microscopy, and quantitative image analysis tools.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for solution preparation and scoring criteria.
- Adaptable to other tissues with defined stem cell compartments, pending niche identification.
- Careful solution handling and observer validation are critical for assay reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:10
Preparation of Glucose-6-phosphate Dehydrogenase (G6PD) Staining Mixture
3:56
Tissue Section Staining
5:19
Determination of Mutation Frequency
6:14
Results: Colonic Stem Cell Mutation Frequency as Determined by Analysis of G6PD Mutant Crypts
7:12
Conclusion
