Kwantyfikacja mutacji komórek macierzystych okrężnicy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie fenotypowych mutacji somatycznych w genie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD) w komórkach macierzystych jelita grubego. Po podaniu zwierzętom domniemanych czynników genotoksycznych cel ten realizuje się poprzez: podanie czynnika, odczekanie odpowiedniego czasu, aby potomstwo komórki macierzystej niosącej mutację G6PD w pełni zasiedliło kryptę, uśmiercenie zwierzęcia, usunięcie jelita grubego, zwinięcie go w formę tzw. szwajcarskiej rolki (Swiss roll) i zamrożenie tkanki w ciekłym azocie. Drugim krokiem jest przygotowanie przy użyciu kriostatu zamrożonych skrawków jelita grubego o grubości 7 µm na szkiełkach przedmiotowych.

Tkankę ogrzewa się do 37°C, a następnie wokół skrawków tkanki tworzy się studzienki do barwienia. W ostatnim kroku skrawki tkanki inkubuje się z mieszaniną barwiącą G6PD, a następnie analizuje pod mikroskopem świetlnym; komórki z aktywnością G6PD barwią się na niebiesko, natomiast te z mutacjami fenotypowymi wydają się białawe. Ostatecznie ilościowe określenie zmutowanych krypt służy do ustalenia częstości mutacji.

Technika ta służy do pomiaru mutacji somatycznych dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej w komórkach macierzystych, które stanowią krytyczną populację komórek w karcynogenezie jelita grubego. Poprzez identyfikację somatycznych mutacji w komórkach macierzystych możliwe jest skorelowanie częstotliwości mutacji z występowaniem raka jelita grubego u badanych zwierząt. Chociaż metoda ta dostarcza wiedzy na temat mutacji komórek macierzystych w jelicie grubym, może ona zostać zastosowana również do innych organizmów modelowych lub układów narządowych.

Jeśli uda się zidentyfikować niszę komórek macierzystych, osoby początkujące w tej metodzie zazwyczaj będą miały trudności z przygotowaniem roztworu MBT oraz jego rozpuszczaniem. Przygotowanie roztworu MBT wymaga ścisłego przestrzegania szczegółowych instrukcji. Aby rozpocząć przygotowanie roztworu do barwienia histologicznego, należy dodać 2 ml buforu fosforanowego o pH 7.4 do 35 ml medium OCT (Optimal Cutting Temperature) w probówce o pojemności 50 ml, a następnie energicznie wstrząsnąć w celu wymieszania, kontrolując pH za pomocą papierka wskaźnikowego.

Potwierdzono, że pH roztworu wynosi około 7.4. Następnie dodano glukozo-6-fosforan, ATP oraz roztwór chlorku magnezu rozpuszczony w buforze fosforanowym zgodnie z opisem w protokole tekstowym i ponownie potwierdzono, że pH roztworu nadal wynosi około 7.4. Dodano roztwór M-M-P-M-S i energicznie wymieszano.

Powinno to doprowadzić do uzyskania klarownego, ciemnoczerwonego homogenatu; należy owinąć roztwór folią, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Jeśli roztwór stanie się mętny, należy go odrzucić, podczas gdy kąpiel olejowa się nagrzewa. Osobno należy przygotować 5 mM roztwór nitroblue tetrazolium (MBT), mieszając 0,4 ml dimetyloformamidu, 0,4 ml bezwodnego etanolu oraz MBT w probówce o pojemności 2 ml z zakrętką z pierścieniem O; należy lekko zamknąć probówkę i doprowadzić do gwałtownego wrzenia w kąpieli olejowej, aż MBT zostanie rozpuszczone.

Następnie należy pozwolić roztworowi MBT ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie dodać go do mieszaniny reakcyjnej OCT. Z czasem kolor roztworu może zmienić się z początkowego pomarańczowo-czerwonego na ciemnoczerwony lub fioletowy. Po potraktowaniu zwierząt i przygotowaniu mrożonych przekrojów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować dołki do barwienia tkanek, używając dwóch stalowych podkładek połączonych ze sobą smarem silikonowym; do podstawy podkładki należy dopasować odpowiedni element i wyciąć środek, w którym umieszczony zostanie roztwór.

Przed zabarwieniem podgrzewaj mrożone skrawki tkanek w komorze nawilżonej w temperaturze 37°C przez 10 minut. Następnie umieść na szkiełku studzienki otaczające przekroje tkanek, wlewając do każdej studzienki z przekrojem tkanek około 0,5 ml wcześniej przygotowanej mieszaniny barwiącej G6PD i inkubuj przez 45 do 50 minut. Wyjmij szkiełka z ciepłej komory i ostrożnie usuń ze szkiełek studzienki ze stali nierdzewnej.

Ustaw szkiełka przedmiotowe na dłuższej krawędzi i odlej mieszaninę reakcyjną, a następnie przeprowadź przemywanie przez 30 do 60 minut w 100 milimolarnym buforze fosforanowym. Aby usunąć ostatnie ślady roztworu barwiącego G6PD, płucz szkiełka wodą dejonizowaną przez 5 do 10 minut w celu usunięcia pozostałości buforu fosforanowego. Na koniec zabezpiecz tkankę, nakładając kroplowo fluorgel na szkiełko, i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut przed wykonaniem obrazowania do późniejszej analizy.

Umieść preparat na mikroskopie świetlnym i ustaw powiększenie 4x. Następnie wykonaj zdjęcia barwionego przekroju tkanki za pomocą kamery 5,0 megapikseli, aby oszacować całkowitą liczbę przebadanych krypt. Dla każdej myszy wybierz przekrój z poziomu o najmniejszej powierzchni i utrwal go obrazowo przy powiększeniu 10x.

Policz liczbę zmutowanych krypt. Zgodnie z poniższymi kryteriami, cała krypta jest pozbawiona niebieskiego koloru, a jej struktura zewnętrzna pozostaje nienaruszona.

Mutację obserwuje się na sąsiednich przekrojach o grubości siedmiu mikronów, a dwóch obserwatorów identyfikuje tę samą kryptę jako zmutowaną. Należy wizualnie policzyć liczbę krypt w danym przekroju i pomnożyć ją przez liczbę poziomów przebadanych dla każdego okrężnicy. Przykłady zmutowanych krypt zaobserwowanych u myszy traktowanych czynnikiem uszkadzającym DNA, azoksymetanem, można zobaczyć tutaj; po lewej stronie widoczny jest pionowy widok z góry na zmutowaną kryptę.

Podczas gdy po prawej stronie znajduje się widok poziomy lub boczny, aby kryptę uznać za zmutowaną, wszystkie komórki w obrębie krypty muszą pozostać. Białe krypty z niewielką ilością bieli wynikają z produkcji śluzu przez komórki kubkowe. Częstotliwość mutacji oblicza się jako liczbę zaobserwowanych mutantów podzieloną przez całkowitą liczbę przebadanych krypt bez mutantów.

W jelitach grubych myszy z grupy kontrolnej zaobserwowano cripse odpowiadające częstości mutacji mniejszej niż 1 × 10⁻⁵, podczas gdy u myszy traktowanych azoksymetanem częstość mutacji komórek macierzystych wyniosła 4,44 × 10⁻⁴ po zastosowaniu tej procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób czynnik chemiczny powoduje błędne kodowanie prowadzące do mutacji, można zastosować inne metody, takie jak analiza genetyczna rodzaju mutacji dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru mutacji somatycznych komórek macierzystych u myszy traktowanych potencjalnymi związkami mutagennymi i kancerogennymi.