Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych
18 grudnia 2015
W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.
Ogólnym celem tej metody jest zlokalizowanie i śledzenie migracji, ekspansji i przeżycia komórek macierzystych i progenitorowych w nabłonku rogówki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek nabłonka rogówki dotyczące homeostazy, naprawy tkanek, starzenia się i patologii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do ustalenia i umożliwia nieinwazyjne śledzenie linii komórek w sposób klonalny.
Na początek najpierw wybierz transgeniczny szczep myszy Cree z indukowalnym promotorem specyficznym dla tkanki, aby oznaczyć komórki progenitorowe nabłonka rąbka i rogówki oraz komórki macierzyste. Stosowana jest linia Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT. Następnie należy dobrać odpowiednią kasetę brainbow w zależności od pytania badawczego i dostępnej linii Cree.
W tym przypadku używana jest linia Brainbow 2.1. Skrzyżowanie homozygotycznego szczepu konfetti R 26 R z homozygotycznym szczepem K 14 Cree ERT, aby wygenerować myszy z czterema kolorowymi komórkami dodatnimi K 14 Aby wywołać rekombinację u myszy transgenicznych. Najpierw zważyć 80 miligramów tamoksyfenu i rozpuścić go w jednym mililitrze oleju kukurydzianego przez wirowanie.
Umieść roztwór w wstrząsającej łaźni wodnej, utrzymywanej w temperaturze 65 stopni Celsjusza do całkowitego rozpuszczenia i pozostaw w kąpieli do czasu użycia następnego znieczulenia. Ośmiotygodniowa heterozygotyczna mysz Brainbow 2.1 Cree ERT i sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi, ostrożnie nałóż 100 mikrolitrów roztworu tamoksyfenu na każdą powierzchnię oka myszy. Bezpośrednie stosowanie tamoksyfenu zapewnia wysoką skuteczność indukcji Cree Wszelkie resztki roztworu tamoksyfenu należy chronić przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia.
Przed aplikacją należy ogrzać roztwór, który powtarza się przez trzy kolejne dni dla każdej myszy. Najpierw rozpuścić jeden gram proszku tamoksyfenu w pięciu mililitrach sterylnego sultlenku dimetylu. Aby uzyskać roztwór o stężeniu 200 miligramów na mililitr, umieść roztwór w wstrząsającej łaźni wodnej, utrzymuj go w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aż stanie się klarowny i pozostaw w kąpieli do czasu użycia.
Następnie znieczulij mysz i sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi, nałóż maść do oka nieleczonego myszy, aby uchronić je przed odwodnieniem podczas zabiegu i podaj odpowiednie leki przeciwbólowe. Następnie pobrać 200 mikrolitrów roztworu tamoksyfenu do strzykawki bez dołączonej igły i nałożyć go miejscowo na całą rogówkę oka. Ciecz krzepnie na tkance w temperaturze pokojowej.
Zajmij się myszą do momentu, gdy utrzyma mostek w pozycji leżącej i zwróć ją do towarzystwa innych tylko wtedy, gdy jest w pełni przytomna. Po złożeniu myszy w ofierze w odpowiednich punktach czasowych po indukcji, zranienie oka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zajądrkuj oko, najpierw naciskając powiekę, aby wysunąć gałkę oczną z oczodołu.
Wsuń zakrzywione kleszcze za gałkę oczną, aby przytrzymać nerw wzrokowy i pociągnij gałkę oczną do góry, aby ją odłączyć. Umieść każdą gałkę oczną w 60-milimetrowym naczyniu zawierającym PBS. Umieść płytkę zawierającą oko pod chirurgicznym mikroskopem stereoskopowym.
Upewnij się, że rozpoznajesz podstawową strukturę oka, rogówkę, rąbek i nerw wzrokowy. Usuń nerw wzrokowy, mięśnie i tkankę łączną wokół oka. Przytrzymaj oko w tylnej części rogówką skierowaną w dół i wykonaj nacięcie w twardówce z tyłu gałki ocznej za pomocą nożyczek sprężynowych.
Powiększ nacięcie, aby obiektyw wyskoczył i usuń tęczówkę za pomocą kleszczy. Następnie wykonaj cztery do pięciu promieniowych nacięć, przecinając od środka w kierunku obwodu, aby spłaszczyć rogówkę, a następnie usuń wszelkie pozostałe części tęczówki cienką płaską szpatułką. Na koniec odetnij nadmiar tkanki obwodowej otaczającej rąbek, aby naprawić rogówkę.
Przenieś wypreparowaną tkankę do naczynia z 12 dołkami i inkubuj ją w 4% para formaldehydu przez 10 minut. Następnie krótko umyj tkankę w PBS, aby wybarwić jądra komórkowe. Inkubować rogówkę w dwóch mikrogramach na mililitr roztworu DPI przez 10 minut, a następnie krótko przemyć w PBS.
Następnie umieść rogówkę na szkiełku podstawowym stroną nabłonkową skierowaną do góry. Następnie umieść kroplę podłoża montażowego na rogówce i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Do obrazowania rogówki należy użyć spektralnego systemu konfokalnego, który umożliwia separację emisji R-F-P-Y-F-P-G-F-P i CFP. Najpierw ustaw długości fal fluorescencji, wzbudzenia i emisji w zależności od białek fluorescencyjnych w mózgu. Kaseta Bo, dbając o to, aby zapobiec wzbudzeniu krzyżowemu lub nakładaniu się sygnałów emisyjnych.
Następnie uzyskaj obrazy kafelkowe, aby zwizualizować całą rogówkę w wysokiej rozdzielczości. Tutaj uzyskaj tablicę obrazów 12 na 12 we wszystkich czterech kanałach fluorescencyjnych. Na koniec scal obrazy, aby utworzyć złożoną linię.
Eksperymenty śledzące z użyciem myszy konfetti R 26 R przeprowadzono w celu śledzenia losu komórek progenitorowych nabłonka rąbka i rogówki. W warunkach stanu stacjonarnego małe skupiska komórek fluorescencyjnych obserwowano 10 dni po indukcji, zgodnie z oczekiwaniami. Po czterech miesiącach pojawiły się smugi od rąbka do środka rogówki, co sugeruje, że komórki migrują z rąbka rogówki, aby zregenerować rogówkę po uszkodzeniu rogówki.
Migracja z rąbka nastąpiła gwałtownie, a długie, grube paski rąbka rozwinęły się w ciągu siedmiu dni. Model ten jest cenny do śledzenia i badania komórek macierzystych i progenitorowych rogówki w różnych okolicznościach. Umożliwi to w przyszłości badanie ekspansji, przeżycia i migracji komórek klonalnych w stanie stacjonarnym i w warunkach stresowych, takich jak zranienia, mutacje chemiczne i inne.
Model ten może być również wykorzystany do analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw prawidłowej i patologicznej regeneracji rogówki. Technika ta może przyczynić się do zrozumienia różnych stanów patologicznych, takich jak dystrofie rogówki, oparzenia i urazy rogówki, a także do oceny wpływu różnych metod leczenia na regenerację rogówki, ekspansję komórek i migrację.
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę wielokolorowego śledzenia linii komórkowych przy użyciu myszy R26R-Confetti, ze szczególnym skupieniem na komórkach nabłonka rogówki. Protokół można dostosować do innych tkanek i ma na celu zwiększenie zrozumienia dynamiki komórek macierzystych w nabłonku rogówki.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Medycyna regeneracyjna
Tło
- Śledzenie linii jest kluczowe dla badania migracji i zachowania komórek.
- Zrozumienie biologii komórek nabłonka rogówki jest ważne dla rozwiązywania różnych patologii.
- Model myszy R26R-Confetti pozwala na klonowe śledzenie komórek.
- Ta technika umożliwia nieinwazyjne obserwowanie dynamiki komórek.
Cel badania
- Śledzenie migracji i przeżycia komórek macierzystych i progenitorowych nabłonka rogówki.
- Badanie wpływu urazów i starzenia się na regenerację rogówki.
- Przedstawienie protokołu, który można dostosować do różnych pytań badawczych.
Zastosowane metody
- Indukcja rekombinacji u myszy transgenicznych za pomocą Tamoksifenu.
- Sekcjonowanie i przygotowanie tkanek rogówki do obrazowania.
- Zastosowanie spektralnej mikroskopii konfokalnej do obrazowania wysokiej rozdzielczości.
- Analiza wzorców migracji komórek po urazie.
Główne wyniki
- Udane śledzenie komórek progenitorowych limbalnych i nabłonka rogówki.
- Obserwacja migracji komórek z limbus do rogówki po urazie.
- Identyfikacja ekspansji klonalnej i przeżycia oznakowanych komórek.
- Wgląd w dynamikę regeneracji rogówki w różnych warunkach.
Wnioski
- Ten model jest cenny dla badania zachowania komórek macierzystych rogówki.
- Może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów naprawy rogówki i patologii.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować ocenę terapii urazów rogówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This lineage tracing method enables biopharma researchers to non-invasively track corneal epithelial stem and progenitor cell dynamics, providing mechanistic insights into tissue regeneration under steady-state and injury conditions. The multi-color clonal labeling system supports predictive de-risking by clarifying cellular origins, migration patterns, and expansion kinetics relevant to ophthalmic therapeutic development. It offers a translatable preclinical model for evaluating corneal repair mechanisms and treatment impacts on cellular behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by defining the origin and fate of limbal and corneal epithelial progenitor cells in homeostasis and repair.
- Operational Value: Enables functional target validation through clonal tracking of stem cell migration and expansion post-induction.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing cellular mechanisms underlying corneal regeneration under stress conditions such as wounding or chemical burn.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing reproducible corneal epithelial models with traceable stem cell populations.
- Operational Value: Standardizes assay readiness through consistent tissue preparation, fluorescent labeling, and spectral confocal imaging protocols.
- Scalability: Facilitates platform reuse across injury models and therapeutic interventions due to adaptable protocol design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase lineage tracing to preclinical validation by tracking corneal regeneration from limbus to central cornea post-injury.
- Mechanistic De-risking: Dissects molecular mechanisms of normal and pathological corneal regeneration, informing risk-adjusted advancement decisions.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by correlating clonal expansion and migration patterns with functional tissue repair outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, enabling hypothesis-driven assessment of corneal stem cell behavior in disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by locating and tracking migration, expansion, and survival of stem and progenitor cells in the corneal epithelium.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized tissue dissection, fluorescent labeling, and high-resolution imaging for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements including clonal cluster formation, streak development from limbus to cornea, and migration kinetics under steady-state and stress conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling corneal regeneration dynamics relevant to dystrophies, burns, and trauma.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability across ocular surface research due to its adaptability to various tissues and inducible Cre lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in corneal stem cell behavior.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of lineage tracing across experimental conditions and time points.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions via clonal insights that reduce late-stage biological risk in ophthalmic programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on mechanistic understanding of corneal repair pathways and treatment impacts on cell migration and expansion.
Implementation Considerations
- Required expertise in mouse genetics, tamoxifen induction, and ocular tissue dissection.
- Instrumentation needs include spectral confocal systems capable of separating RFP, YFP, GFP, and CFP emissions to prevent spectral overlap.
- Cross-team standardization requires consistent tamoxifen dosing, induction timing, and corneal preparation protocols across laboratories.
- Adaptation considerations involve selecting appropriate Cre promoter lines and Brainbow cassettes based on target tissue and research question.
- Practical limitations include the need for careful anesthesia management during topical tamoxifen application and potential variability in recombination efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:19
Combining Corneal Injury with Tamoxifen Induction
3:18
Preparing Tissue for Imaging
5:19
Confocal Microscopy and Image Analysis
6:04
Results: Corneal Lineage Tracing under Homeostasis and Injury
6:44
Conclusion
0:42
Crossing Transgenic Lines of Interest and Tamoxifen Induction
