Name: Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę wielokolorowego śledzenia linii komórek nabłonka rogówki przy użyciu myszy R26R-Confetti. Technika ta umożliwia nieinwazyjne badanie dynamiki komórek macierzystych i progenitorowych w procesach regeneracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RSF otrzymało dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013]) na podstawie umowy o grant nr 618432 – MC – Epi-Patho-Stem, a także od Izraelskiej Fundacji Naukowej (218/14).

Oświadczenie etyczne: W tym badaniu opieka nad zwierzętami i ich użytkowanie były zgodne z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną.
1. Wybierz odpowiedni szczep myszy z ekspresją rekombinazy Cre
<ol>
	<li>Spośród szerokiej gamy linii transgenicznych Cre dostępnych do zakupu26 i w zależności od tkanki docelowej, która ma być badana, wybierz transgeniczny szczep myszy Cre, w którym gen rekombinazy Cre jest kontrolowany przez promotor specyficzny dla tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku, gdy potrzebna jest kontrola czasowa, wybierz indukowalną linię Cre. 
	Uwaga: Wybraliśmy indukowany tamoksyfenem transgen K14-CreERT, aby specyficznie oznaczyć komórki macierzyste / progenitorowe nabłonka rąbka i rogówki24. Należy pamiętać, że mogą istnieć różnice między szczepami, ponieważ Di Girolamo i współpracownicy zgłosili swoistość rąbkową bez ekspresji rogówki dla ich K14-CreERT22. Zaletą stosowania indukowalnych transgenicznych myszy Cre jest to, że umożliwia to indukcję śledzenia linii w różnych ramach czasowych.</li>
</ol>
2. Wybierz odpowiednią odmianę myszy Br
<ol>
	<li>Wybierz odpowiednią kasetę Br w zależności od pytania badawczego i dostępnej linii Cre16,18,20.
	<ol>
		<li>Jeśli stosuje się nieindukowalny szczep myszy Cre, należy wybrać kasetę Br, która nie pozwala na ciągłe inwersje/wycinanie DNA, a tym samym powoduje powstawanie ślepych zaułków (na przykład Br1.0 lub Br1.1)16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Skrzyżowanie transgenicznych linii zainteresowania
<ol>
	<li>W przypadku przedstawionego tutaj protokołu należy skrzyżować homozygotyczny szczep R26R-Confetti (Br2.1/Br2.1) z homozygotycznym szczepem CreERT (CreERT/CreERT), aby uzyskać hemizygotyczne potomstwo (Br2.1/+; Cre/+), które są gotowe do śledzenia linii monoallelicznej, ponieważ wszystkie zawierają pojedynczy allel Br2.1 i pojedynczy allel Cre. 
	Uwaga: Aby zwiększyć skuteczność znakowania, można wygenerować myszy zawierające dwa allele Cre (Br2.1/+; Cre/Cre), natomiast dwa allele Br2.1 (Br2.1/Br2.1; Cre/+) zwiększyłoby kombinacje kolorów (jak opisano w 22).</li>
</ol>
4. Indukcja rekombinazy Cre
Uwaga: Podawanie tamoksyfenu w tych eksperymentach odbywało się poprzez codzienne wstrzyknięcie dootrzewnowe, przez okres 3-4 dni, w celu wywołania translokacji rekombinazy CreERT do jądra rąbka i rogówki K14-dodatnich komórek macierzystych/progenitorowych komórek macierzystych/progenitorowych. Do wstrzyknięcia czterem myszom można zastosować następujący protokół. Alternatywnie, miejscowe stosowanie tamoksyfenu na powierzchnię oka daje wyższą skuteczność. Roztwór tamoksyfenu można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. Podgrzej roztwór przed użyciem.
<ol>
	<li>Odważyć 100 mg tamoksyfenu i rozpuścić go w 5 ml oleju kukurydzianego do uzyskania roztworu tamoksyfenu o stężeniu 20 mg/ml.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo 200 μl roztworu tamoksyfenu (4 mg) 8-tygodniowym myszom przez 3-4 kolejne dni. 
	Uwaga: Roztwór tamoksyfenu można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. Podgrzej roztwór przed użyciem.</li>
	<li>Do stosowania miejscowego: zważyć 60 mg tamoksyfenu i rozpuścić go w 1 ml oleju kukurydzianego, aby utworzyć roztwór tamoksyfenu o stężeniu 60 mg/ml. Odwirować roztwór i umieścić go w wstrząsającej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 65 °C, aż stanie się klarowny, pozostawić w łaźni do czasu użycia.
	<ol>
		<li>Ostrożnie nanieść 100 μl roztworu tamoksyfenu na każdą powierzchnię oka myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie tkanek do obrazowania
<ol>
	<li>Uśmiercać zwierzęta za pomocą znieczulenia izofluranem (2% odparowywanego tlenu) (potwierdzić prawidłowe znieczulenie przez brak odruchów), a następnie wdychać CO2 w odpowiednich punktach czasowych po wstrzyknięciu tamoksyfenu i pobrać odpowiednią tkankę.
	<ol>
		<li>W tych eksperymentach należy wyłuszczyć oczy w następujących punktach czasowych: 1, 4, 8, 12 i 16 tygodni po wstrzyknięciu tamoksyfenu. Osiągnij enukleację za pomocą zakrzywionych kleszczy. Naciśnij powieki, powodując wyskoczenie gałki ocznej z oczodołu. Umieść kleszcze za gałką oczną, trzymając nerw wzrokowy. Delikatnie pociągnij gałkę oczną i odłącz ją. 
		Uwaga: Na tym etapie, jak opisano poniżej, tkanki można przygotować do całościowej analizy znakowanych komórek. Można również przygotować regularne zamrożone skrawki tkanek, utrwalić je w PFA i zobrazować w sposób opisany poniżej (patrz punkty 6 i 22).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść każde oko w naczyniu o średnicy 60 mm wypełnionym PBS.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy przytrzymaj oko w pobliżu nerwu wzrokowego rogówką skierowaną w dół i użyj skalpela w celu usunięcia nerwu wzrokowego, mięśni i tkanki łącznej oraz wykonania małego nacięcia w tylnej części oka.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych ostrożnie powiększ nacięcie, pozwalając obiektywowi wyskoczyć i usuń tęczówkę za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Spłaszcz rogówkę, wykonując 4-5 promienistych nacięć, zaczynając od środka w kierunku obwodu za pomocą skalpela.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby wyciąć nadmiar tkanki obwodowej poza rąbkiem.</li>
	<li>Utrwal rogówki w PFA 4% przez 10 minut, a następnie krótko umyj je PBS.</li>
	<li>Inkubować próbki z DAPI przez 10 minut i krótko przemyć PBS.</li>
	<li>Zamontuj rogówki na szkiełkach szkiełkowych stroną nabłonkową skierowaną do góry. Umieść kroplę podłoża montażowego na rogówce i przykryj szkłem nakrywkowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia O/N w RT. Utrzymuj szkiełka w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Mikroskopia konfokalna i analiza obrazowa
<ol>
	<li>Stosować spektralny system konfokalny, który umożliwia separację emisji YFP/GFP/CFP. Ustaw długości fal wzbudzenia i emisji fluorescencji w zależności od białek fluorescencyjnych kasety Br. Wybierz najbardziej odpowiednią długość fali wzbudzenia dla każdego białka, dążąc do zminimalizowania wzbudzenia krzyżowego. Wybierz wąskie zakresy emisji, aby zminimalizować wyciek sygnałów z różnych białek.
	<ol>
		<li>W przypadku kasety Br2.1 jako punkt wyjścia należy przyjąć następujący układ wzbudzenia fluorescencyjnego (ex) i emisji (em): DAPI — ex 405 nm/em 420–480 nm, CFP — ex 458 nm/em 470–500 nm, GFP — ex 488 nm/em 497–508 nm, YFP — ex 514 nm/em 529–540 nm, oraz RFP — ex 561 nm/em 575–615 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uwidocznić duże obszary tkanek w wysokiej rozdzielczości, uzyskaj obrazowanie płytek. Aby uzyskać wyniki pokazane na rysunku 2A-B, zobrazuj całą rogówkę, uzyskując tablicę obrazów 12 x 12, tj. uzyskaj 144 pola (512 x 512) przy użyciu 4 kanałów fluorescencyjnych w każdym polu. W sumie zbierz 576 obrazów, a następnie połącz.</li>
	<li>Aby zbadać lokalizację oznakowanych komórek na różnych głębokościach i strukturach tkanki, uzyskaj obrazy stosu Z różnych regionów zainteresowania. Aby zobrazować pełną głębokość rogówki, należy pobrać 8 odcinków optycznych w odstępach co 3 μm. Ortogonalne widoki pobranych odcinków, jak również projekcje obrazów w oparciu o maksymalne intensywności mogą być konstruowane za pomocą konwencjonalnych programów do obrazowania 24.</li>
</ol>
7. Uraz rogówki połączony z indukcją tamoksyfenu
<ol>
	<li>Znieczulić myszy izofluranem (2% odparowane w tlenie) i podać leki przeciwbólowe (10 mg/kg karpofenu, wstrzykiwany podskórnie). Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak reakcji na szczypanie palców u stóp.</li>
	<li>Odważyć 1 g tamoksyfenu w proszku i rozpuścić go w 5 ml sterylnego DMSO do uzyskania roztworu o stężeniu 200 mg/ml.</li>
	<li>Ogrzać roztwór tamoksyfenu do temperatury 65 °C w łaźni wodnej do momentu, aż roztwór stanie się klarowny. Roztwór należy przechowywać w kąpieli do czasu użycia.</li>
	<li>Nałóż maść do oczu na nieleczone oko po przeciwnej stronie, aby zapobiec odwodnieniu podczas znieczulenia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie zwracaj myszy, które zostały zranione w oczy, do towarzystwa innych myszy, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. Myszy powinny być ściśle monitorowane po urazie. W przypadku, gdy tracą więcej niż 10% masy ciała, cierpią na erozję rogówki lub dyskomfort, eksperyment należy przerwać. Powtarzaj podawanie leków przeciwbólowych co 24 godziny przez cały czas trwania eksperymentu. </li>
	<li>Za pomocą sterylnej strzykawki, bez dołączonej do niej igły, nanieść miejscowo 200 μl roztworu tamoksyfenu na całą powierzchnię rogówki jednego oka każdej myszy. 
	Uwaga: Płynny roztwór szybko krzepnie na powierzchni oka w temperaturze pokojowej. Efekt uszkodzenia rogówki zależy od ciężkości rany. Po jednym zastosowaniu tamoksyfenu/roztworu DMSO nie obserwuje się żadnych działań niepożądanych u myszy. W przypadku wielokrotnego stosowania można zaobserwować zmętnienie rogówki. </li>
	<li>Kontynuować przygotowanie tkanek i obrazowanie (patrz punkty 5 i 6) w odpowiednich punktach czasowych. Aby uzyskać pokazane tutaj wyniki, poświęć myszy (jak opisano w etapie 5.1) tydzień po zranieniu (ryc. 2 i 24).</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior.</a> Dev Cell. 21, 394-409 (2011).</li>
<li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing.</a> Cell. 148, 33-45 (2012).</li>
<li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).</li>
<li>Beck, B., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+cancer+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unravelling cancer stem cell potential.</a> Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vital+dye+analysis+of+the+timing+and+pathways+of+avian+trunk+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration.</a> Development. 106, 809-816 (1989).</li>
<li>Eagleson, G. W., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+presumptive+brain+regions+in+the+neural+plate+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis.</a> J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).</li>
<li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate%3A+implications+on+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li>
<li>Snippert, H. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Tracking adult stem cells.</a> EMBO Rep. 12, 113-122 (2011).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr6+marks+stem+cells+in+the+hair+follicle+that+generate+all+cell+lineages+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.</a> Science. 327, 1385-1389 (2010).</li>
<li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li>
<li>Jaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+marks+cycling%2C+yet+long-lived%2C+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li>
<li>Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-layer+and+lineage-restricted+stem%2Fprogenitors+regenerate+the+mouse+digit+tip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip.</a> Nature. 476, 409-413 (2011).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506, 322-327 (2014).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+podocyte+reporter+highlights+heterogeneous+podocyte+changes+in+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney Int. 85, 972-980 (2014).</li>
<li>Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+and+imaging+multicolor+Brainbow+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating and imaging multicolor Brainbow mice.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 763-769 (2011).</li>
<li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainbow%3A+new+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199, 293-306 (2015).</li>
<li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nat Methods. 10, 540-547 (2013).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li>
<li>Di Girolamo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+fate+of+limbal+epithelial+progenitor+cells+in+the+murine+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea.</a> Stem Cells. 33, 157-169 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+stem+and+progenitor+cells+of+the+murine+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium.</a> Stem Cells. 33, 230-239 (2015).</li>
<li>Schepers, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+Lgr5%2B+stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337, 730-735 (2012).</li>
<li>Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible Cre mice.</a> Methods Mol Biol. 530, 343-363 (2009).</li>
<li>Collinson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+patterns+of+growth%2C+stem+cell+activity%2C+and+cell+movement+during+the+development+and+maintenance+of+the+murine+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium.</a> Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).</li>
<li>Buck, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+centripetal+migration+of+normal+corneal+epithelial+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).</li>
<li>Nagasaki, T., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centripetal+movement+of+corneal+epithelial+cells+in+the+normal+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).</li>
<li>Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligopotent+stem+cells+are+distributed+throughout+the+mammalian+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface.</a> Nature. 456, 250-254 (2008).</li>
<li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrabow%3A+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Eksperymenty ze śledzeniem linii są prowadzone od wielu lat. Ostatnie ulepszenia technologiczne i pojawienie się szczepów myszy Confetti otworzyły nowe możliwości badań. Obecnie naukowcy mogą korzystać z dużej liczby dostępnych na rynku linii Cre specyficznych dla tkanki, myszy z nokautem i myszy transgenicznych. Daje to możliwość zaprojektowania wszechstronnych systemów eksperymentalnych do rozwiązywania problemów naukowych z podstawową wiedzą specjalistyczną, unikając pracochłonnej praktyki, a jednocześnie dostarczając solidnych i wiarygodnych danych.
Myszy R26R-Confetti to eleganckie narzędzie do skutecznego śledzenia i badania natury i zachowania komórek w żywym organizmie. System jest łatwy do stworzenia i umożliwia nieinwazyjne śledzenie linii pojedynczych komórek podczas embriogenezy, regeneracji komórek macierzystych w homeostazie lub w różnych okolicznościach, takich jak uraz, stan zapalny i rak. Uzyskane dane dostarczają solidnego opisu przeżywalności komórek docelowych, ekspansji komórek klonalnych i migracji komórek w wymierny sposób. Kluczowym krokiem byłby wybór odpowiedniego genetycznego szczepu myszy, który może niezawodnie umożliwić skuteczne znakowanie specyficzne dla tkanek na precyzyjnym etapie rozwoju. Jednym z ograniczeń tego systemu jest to, że do monitorowania żywego organizmu tkanka musi być dostępna i przezroczysta. Podobnie, śledzenie grubej tkanki w żywym zwierzęciu może być ułatwione tylko przez mikroskopię dwufotonową lub wielofotonową. Możliwe jest jednak śledzenie komórek na pośmiertnych skrawkach tkanek i być może nienaruszona tkanka może być badana po przekształceniu w przezroczystość za pomocą metody CLARITY32,33. Innym ograniczeniem, które należy wziąć pod uwagę, jest to, że chociaż sąsiednie komórki, które wyrażają ten sam fluorofor, prawdopodobnie należą do tej samej linii klonalnej, możliwe jest również, że mogą one pochodzić z niezależnego pochodzenia komórek, które losowo wyrażały ten sam gen fluorescencyjny. Ta możliwość staje się bardzo mało prawdopodobna w przypadku stosowania wielu alleli Br, aby umożliwić liczne kombinacje kolorów.
W przyszłości połączenie systemu Confetti z dostępnymi narzędziami genetycznymi (tj. modelami myszy knockout, knockin i transgenicznych) pozwoli na badanie genów i ich mutacji w zdrowiu i patologii. Podobnie, śledzenie linii genetycznych w warunkach różnych zaburzeń systemowych (tj. niszczenie nisz komórek macierzystych, ablacja komórek za pośrednictwem lasera, leczenie farmakologiczne) przyniesie nowe informacje na temat udziału szlaków sygnałowych w decyzjach dotyczących losu komórki. Ostatecznie, kombinatoryczne zastosowanie znakowania fluorescencyjnego i bioluminescencyjnego, genetyczne reportery szlaków sygnałowych i najnowocześniejsza mikroskopia zapewnią naukowcom solidny system do uczenia się, jak pojedyncze komórki reagują na otoczenie w ich naturalnym środowisku.

Podczas rozwoju embrionalnego, morfogeneza tkanek i narządów odbywa się za pomocą precyzyjnego programu, który można opisać w kategoriach proliferacji komórek, migracji komórek i specyfikacji linii1-4. Te procesy biologiczne biorą również udział w utrzymaniu homeostazy tkanek dorosłych, co wymaga regeneracji komórek macierzystych. Śledzenie linii, czyli identyfikacja i śledzenie potomstwa określonego typu populacji komórek, stanowi ważne narzędzie do badania embriogenezy i homeostazy komórek macierzystych. Rzeczywiście, jest coraz częściej wykorzystywany w wielu dziedzinach badań. W szczególności śledzenie linii stało się podstawowym narzędziem w identyfikacji pochodzenia i losu komórek macierzystych w homeostazie i rozwoju raka. Dzieje się tak, ponieważ może dostarczyć istotnych informacji o tym, jak komórka zachowuje się w kontekście nienaruszonej tkanki lub organizmu, przy minimalnej interwencji eksperymentalnej, w przeciwieństwie do izolacji komórek i hodowli in vitro lub przeszczepu, które mogą skutkować niepożądanym odchyleniem.
Tradycyjnie, barwniki takie jak rozpuszczalna w tłuszczach karbocyjanina, które włączają się do błony komórkowej komórek, były używane do śledzenia linii. Chociaż tego typu eksperymenty z powodzeniem doprowadziły do ważnych odkryć i ukształtowały przełomowe koncepcje w biologii rozwoju5,6, mają one pewne ograniczenia, w tym trudność w kontrolowaniu specyficzności docelowych komórek, niepożądany wpływ barwnika na zachowanie komórek i rozcieńczenie etykiety w czasie. Metody znakowania analogami nukleotydów umożliwiły udokumentowanie istnienia "komórek zatrzymujących etykiety" o powolnym cyklu, które przypuszczalnie odpowiadają komórkom macierzystym w stanie spoczynku7,8. Jednakże, chociaż technika ta może wykazać obecność komórek o powolnych cyklach w oparciu o kinetykę proliferacji w ograniczonym czasie, nie może dostarczyć istotnych informacji na temat funkcjonalności komórek macierzystych. Optymalna metodologia śledzenia linii rodowej powinna zminimalizować wpływ znakowania na właściwości znakowanej komórki, jej potomstwa lub sąsiadów. Ponadto korzystne byłoby posiadanie kontroli nad indukcją znakowania, a mianowicie posiadanie możliwości znakowania interesującej populacji komórek w sposób zależny od etapu i czasu, a także w sposób pojedynczy (klonalny). Stabilna i nieodwracalna metoda znakowania, która jest przekazywana całemu potomstwu komórki założycielskiej, jest ważna, aby etykieta została zachowana w czasie, a nie przeniesiona na sąsiednie komórki.
Niedawno opracowano genetyczne metody znakowania komórek. W tych systemach promotory specyficzne dla komórek mogą być używane do wyzwalania ekspresji rekombinazy Cre w celu usunięcia blokady drogowej otoczonej loxP i umożliwienia ekspresji genów reporterowych, takich jak białko zielonej fluorescencji lub geny reporterowe Β-galaktozydazy9-13. Takie podejście umożliwia nie tylko śledzenie komórek i ich potomstwa, ale także izolację komórek i charakterystykę molekularną. Śledzenie komórek na poziomie pojedynczej komórki stało się możliwe dzięki indukcji ekspresji pojedynczego fluorescencyjnego genu reporterowego. Jednym z istotnych ograniczeń tego systemu jest fakt, że tylko wtedy, gdy znakowany jest bardzo niski procent komórek, możliwe jest oddzielenie i śledzenie poszczególnych klonów. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, można użyć wielokolorowych reporterów. W przypadku korzystania z wielokolorowego etykietowania można skutecznie osiągnąć śledzenie losów różnicowych sąsiednich komórek w tej samej niszy14-17. Ostatnio opracowano różne allele Brainbow (Br) do eksperymentów ze śledzeniem linii, umożliwiając stochastyczną ekspresję wielu fluorescencyjnych genów reporterowych z wykorzystaniem systemu Cre/lox. Układ Cre / lox składa się z enzymu rekombinazy Cre, który rozpoznaje i wiąże się z określonymi sekwencjami DNA, takimi jak miejsca loxP. Po związaniu rekombinazy Cre zachodzi rekombinacja specyficzna dla miejsca, która powoduje usunięcie sekwencji otoczonych loxP, co skutkuje losową ekspresją różnych białek fluorescencyjnych (mechanizm opisano poniżej). Do użytku dostępne są różne linie Br (patrz recenzje16,18,19). Główne różnice między szczepami Br obejmują (i) różnice w liczbie genów fluorescencyjnych zawartych w kasecie, w zakresie od 2 (Br 2,0), 3 (Br1,0) do 4 (Br1,1, Br2,1) genów fluorescencyjnych, (ii) obecność wzajemnie zorientowanych miejsc lox umożliwiających inwersję genów (Br2,0-2,1), (iii) rodzaj użytych miejsc lox oraz (iv) ekspresję lub wyciszenie ekspresji genów fluorescencyjnych przed aktywacją Cre. Niedawno opracowany Br3 oferuje ulepszoną metodę wielokolorowego obrazowania neuronów. Jedną z głównych cech tego transkryptu jest to, że zawiera on nowy zestaw fotostabilnych farnezylowanych białek fluorescencyjnych, które umożliwiają równomierne barwienie najdrobniejszych procesów neuronalnych20.
Co ważne, różne wersje kaset Br mogą zawierać specyficzny dla neuronów promotor Thy1 lub promotor CAG (CMV) o wszechobecnej ekspresji. Wreszcie, podczas gdy niektóre transgeniczne myszy Br mogą zawierać pojedynczy transgen Br, inne mogą składać się z wielu kopii transgenu, co pozwala na wytworzenie ogromnej liczby możliwości ekspresji kombinacji kolorów w każdej komórce (na przykład patrz 16).
W naszym badaniu użyliśmy myszy R26R-Confetti, która zawiera kasetę Br2.1 21. Br2.1 jest unikalnie zaprojektowany, aby umożliwić inwersje DNA za pośrednictwem Cre, a nie tylko wycięcia ze względu na wzajemną orientację miejsc loxP (Figura 1). Tak więc, te zdarzenia inwersji/wycięcia, które prowadzą do zmiany koloru, mogą trwać tak długo, jak długo Cre jest obecne16. Z tego powodu indukowalny czasowy system ekspresji Cre jest niezbędny do niezawodnego śledzenia komórek za pomocą Br2.1. Jak pokazano na rysunku 1, Br2.1 zawiera wszechobecny promotor CAG, po którym następuje kaseta NeoR flankowana przez loxP, która działa jak transkrypcyjna blokada drogowa, po której następują 4 fluorescencyjne geny reporterowe, kodujące białka fluorescencyjne zielone (GFP), żółte (YFP), czerwone (RFP) i cyjan (CFP), umieszczone w dwóch tandemach. Przed aktywacją Cre nie ulega ekspresji fluorescencji. Indukcja rekombinazy Cre powoduje usunięcie kasety Neo-R umożliwiającej losową ekspresję jednego z 4 białek fluorescencyjnych w danej komórce. Pierwszy segment zawiera GFP z bokami loxP i odwrócony YFP, podczas gdy drugi segment zawiera zapytanie ofertowe z bokami loxP i odwrócony CFP. Te segmenty DNA mogą być w sposób ciągły odwracane (przy użyciu loxP, który jest w odwróconej orientacji) lub wycinane, o ile obecna jest rekombinaza Cre. Dlatego należy stosować przejściowy i kontrolowany transgen Cre. Kaseta Br2.1 zapewnia doskonały system rozróżniania nakładających się emisji w lokalizacji sygnału: ekspresja YFP i RFP jest cytoplazmatyczna, GFP jest jądrowa, a CFP jest związany z błoną komórkową. Emisje GFP i RFP można łatwo oddzielić za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. W celu oddzielenia emisji YFP/GFP/CFP potrzebny jest spektralny system obrazowania konfokalnego. Ogólnie rzecz biorąc, kaseta Br2.1 umożliwia losową, indukowalną i specyficzną tkankowo ekspresję jednego z czterech odrębnych genów fluorescencyjnych w każdej docelowej komórce. W rzeczywistości, gdy potrzebna jest większa liczba kombinacji kolorów, można wygenerować myszy homozygotyczne, które zawierają 2 allele Br2.1, co skutkuje ekspresją 2 znaczników kolorów dla każdej komórki i zwiększeniem liczby możliwych kombinacji kolorów do 10 22. Niektóre szczepy myszy Br umożliwiają ekspresję znacznie większej liczby możliwych kombinacji kolorów, ponieważ wiele kopii kasety zostało zintegrowanych z ich genomem16. Jednak w większości przypadków cztery kombinacje kolorów zapewniane przez pojedynczy allel Br2.1 są wystarczające. Postępując zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem, można ustalić tę metodę przy użyciu stosunkowo prostej konfiguracji mikroskopii spektralnej z niewielką, jeśli w ogóle, potrzebą kalibracji.
Tutaj udostępniamy adaptowalny protokół do użycia myszy R26R-Confetti, które zawierają pojedynczy allel Br2.1, do eksperymentów śledzenia linii nabłonka rogówki. Ten transgeniczny szczep myszy został wykorzystany do badania pochodzenia i losów okrężnicy 21,23 i komórek macierzystych nabłonka rogówki22,24, obecności aktywności komórek macierzystych w raku jelita25 oraz do scharakteryzowania podocytów nerkowych w ogniskowym segmentalnym stwardnieniu kłębuszków nerkowych (FSGS)17.

<table><tbody><tr><td>R26R-Confetti transgeniczne myszy homozygotyczne dla kasety Brainbow 2.1</td> Szczep <td>Jackson</td><td>#013731</td><td></td></tr><tr><td>K14-CreERT myszy</td><td>Jackson</td><td>szczep #005107</td><td></td></tr><tr><td>tamoksyfen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>izofluran USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprieve 30</td><td>b.wt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>stosowany w stężeniu 4&#160; &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Immu Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 Meta laserowy skaningowy skaningowy system konfokalny podłączony do odwróconego mikroskopu zmotoryzowanego (Axiovert 200M) wyposażonego w zmotoryzowany stolik</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Nakładanie się widm między GFP, YFP i CFG wymaga zastosowania obrazowania spektralnego, które pozwala na rozdzielenie widm emisyjnych białek fluorescencyjnych. Tutaj używamy mikroskopu konfokalnego spektralnego Zeiss LSM 510 Meta. Detektor Meta wchodzący w skład tego systemu składa się z 32 elementów detekcyjnych, z których każdy zbiera emisję z 10-nanometrowego pasma fal. Ta technika zwana "spektralnym odciskiem palca" umożliwia użytkownikowi ustawienie najbardziej odpowiednich limitów filtrowania pasma fal. Istnieje wiele spektralnych systemów konfokalnych, które można zastosować, w tym Leica SP5 (ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).</td></tr><tr><td>Zen 2009 Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears-maść do oczu</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Eksperymenty śledzenia linii określają pochodzenie, los i zachowanie komórek w określonej tkance lub organizmie. Technika ta jest z powodzeniem stosowana od wielu dziesięcioleci, ujawniając przełomowe odkrycia w biologii rozwoju. Niedawno został przyjęty przez biologów zajmujących się komórkami macierzystymi do identyfikacji i śledzenia różnych populacji komórek macierzystych przy minimalnej interwencji eksperymentalnej. Ostatnie osiągnięcia w genetyce myszy, dostępność dużej liczby szczepów myszy oraz postępy w mikroskopii fluorescencyjnej pozwalają na proste projektowanie potężnych systemów śledzenia linii dla różnych tkanek z podstawową wiedzą specjalistyczną, przy użyciu dostępnych na rynku narzędzi. Niedawno wykorzystaliśmy tę potężną metodologię do zbadania pochodzenia i losu komórek macierzystych na powierzchni oka za pomocą myszy R26R-Confetti. Model ten oferuje wielokolorowy system genetyczny do ekspresji 4 genów fluorescencyjnych w sposób losowy. W tym miejscu opisujemy zasady tej metodologii i przedstawiamy elastyczny protokół projektowania eksperymentów śledzenia pochodzenia; w szczególności dla nabłonka rogówki, a także dla innych tkanek.

Niedawno podjęliśmy próbę zidentyfikowania pochodzenia, przeżywalności i migracji komórek macierzystych oraz komórek progenitorowych nabłonka rogówki24. Narastające dowody wspierają dogmat, według którego nabłonek rogówki jest regenerowany przez komórki macierzyste zlokalizowane wyłącznie w niszy limbalnej, czyli pierścieniowatej strefie na obwodzie rogówki. Teoria ta jest wspierana przez dane in vitro i in vivo oraz przez dowody kliniczne, które stanowiły podstawę sukcesu pionierskiej terapii komórkami macierzystymi limbusa27-29. Jednak temat ten pozostawał przedmiotem intensywnych debat w ostatnich latach ze względu na badanie oparte na eksperymentach z przeszczepem limbusa, które sugerowało, że limbus myszy nie uczestniczy w odnowie rogówki30. Aby sprawdzić tę interesującą hipotezę, przeprowadzono eksperymenty z mapowaniem linii komórkowych (lineage tracing) z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti, aby śledzić losy limbalnych i rogówkowych komórek macierzystych/progenitorowych nabłonka w warunkach stanu stacjonarnego przez okres do 120 dni24. Oczy usunięto, a preparaty rogówki w formie płaskich montaży (flat-mount) analizowano za pomocą spektralnej konfokalnej laserowej mikroskopii fluorescencyjnej 10 i 120 dni po wstrzyknięciu Tamoksyfenu. Zgodnie z oczekiwaniami, 10 dni po wstrzyknięciu w całej powierzchni gałki ocznej zaobserwowano małe, sporadyczne klastry fluorescencyjnych komórek, natomiast 1-4 miesiące później (Rycina 2B oraz 24) powoli rozwijały się wydłużone pasma rozciągające się od limbusa w kierunku centrum rogówki. Wynik ten sugeruje, że rogówka jest regenerowana przez komórki migrujące z limbusa w stronę centrum rogówki. Następnie zbadano regenerację rogówki w warunkach zranienia. Aby przetestować losy komórek limbalnych/rogówkowych dodatnich dla K14 w warunkach zranienia, przy jednoczesnym indukowaniu efektywnego śledzenia komórek, rozpuściliśmy Tamoksyfen w dimetylosulfoksydzie (DMSO), który powoduje uszkodzenie rogówki po aplikacji miejscowej. W ten sposób udało nam się wywołać łagodne zranienie w przypadku pojedynczej aplikacji miejscowej (Rycina 2C), umiarkowane zranienie w przypadku dodatkowego zastosowania samego DMSO w dniu poprzedzającym indukcję Tamoksyfenem lub ciężkie zranienie, gdy DMSO był stosowany miejscowo przez 2 kolejne dni przed indukcją Tamoksyfenem.
W przeciwieństwie do cienkich pasm limbalnych, które rozwijały się powoli i osiągnęły centrum rogówki w ciągu 4 miesięcy w warunkach stanu stacjonarnego, migracja komórek po urazie była szybka. Co niezwykłe, w tych warunkach długie i grube pasma limbalne rozwinęły się już w ciągu 7 dni. Interesujące jest to, że różnorodność kolorystyczna była niekiedy minimalna (Rycyna 2D). W naszych badaniach sporadycznie w całej rogówce identyfikowano głównie komórki czerwone, co wskazuje, że różnorodność kolorystyczna może być przesunięta w stronę konkretnych fluoroforów. To niepożądane odchylenie można skalibrować za pomocą testów odpowiedź-dawka, jak opisano wcześniej w Br1.0L31 oraz w Br2.121.
<img alt="Schemat ekspresji genów; locus Rosa 26; znaczniki GFP, YFP, RFP; kodowana kolorami ekspresja białek." src="/files/ftp_upload/53370/53370fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczna ilustracja konstrukcji R26R-Confetti. (A) Konstrukcja R26R-confetti zawiera promotor CAG zapewniający wysoki poziom ekspresji, flankowaną przez loxP (czarny trójkąt) blokadę NeoR oraz kasetę Brainbow2.1 w locus Rosa2616,21. Kaseta Brainbow2.1 obejmuje dwa flankowane przez loxP dimery ułożone jeden za drugim. Jeden dimer składa się z białka fluorescencyjnego zielonego (GFP) z lokalizacją jądrową oraz cytoplazmatycznego białka fluorescencyjnego żółtego (YFP) o orientacji odwrotnej (orientacja odwrócona jest oznaczona jako - PFY). Drugi dimer zawiera cytoplazmatyczne RFP oraz białko fluorescencyjne cyjanowe (CFP) przytwierdzone do błony o orientacji odwrotnej (orientacja odwrócona jest oznaczona jako - PFC)16. (B-E) Po aktywacji rekombinazy Cre mogą wystąpić różne zdarzenia wycięcia i inwersji; możliwe wyniki przedstawiono na panelach B-E. Aktywność Cre indukuje stochastyczną rearanżację kasety, prowadząc do usunięć i/lub inwersji genów, co skutkuje losową ekspresją jednego z czterech białek fluorescencyjnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek obrąbka oka wykazująca ekspresję RFP, CFP, YFP i GFP w czasie." src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Śledzenie linii komórkowych rogówki w warunkach homeostazy i po urazie. Myszy R26R-confetti/K14-Cre otrzymały wstrzyknięcie 4 mg tamoksyfenu zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole. W wyznaczonych punktach czasowych po indukcji wykonano obrazowanie spłaszczonych rogówek (A-B). Uszkodzenie rogówki połączone z indukcją Cre osiągnięto poprzez miejscowe zastosowanie tamoksyfenu rozpuszczonego w DMSO (C-D). Przedstawiono obrazy mozaikowe uzyskane za pomocą wielokanałowej kafelkowej spektralnej mikroskopii konfokalnej (A-D). W warunkach homeostazy radialne pasma obrąbka złożone z wolno migrujących komórek rozciągały się między obrąbkiem a centrum rogówki. Pasma te rozwijały się powoli, docierając do centrum rogówki w ciągu 4-5 miesięcy (B). Widoczne były również klastry komórek rogówki (białe strzałki, B). W przeciwieństwie do tego, w warunkach urazu duże smugi obrąbka pojawiły się w ciągu jednego tygodnia (C). Przykład stronniczości różnorodności kolorystycznej w kierunku komórek czerwonych (D). Granica obrąbek-rogówka jest zaznaczona linią przerywaną. Pasek skali wynosi 500 µm. Skróty: CFP, cyjanowe białko fluorescencyjne; GFP, zielone białko fluorescencyjne; RFP, czerwone białko fluorescencyjne; YFP, żółte białko fluorescencyjne. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Ogólnym celem tej metody jest lokalizacja oraz śledzenie migracji, ekspansji i przeżywalności komórek macierzystych oraz komórek progenitorowych w nabłonku rogówki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek nabłonka rogówki dotyczące homeostazy, regeneracji tkanek, starzenia się oraz patologii. Główną zaletą tej techniki jest łatwość jej wdrożenia oraz możliwość nieinwazyjnego śledzenia linii komórkowych w sposób klonalny.Aby rozpocząć, należy najpierw wybrać transgeniczna linię myszy Cree z indukowalnym promotorem specyficznym tkankowo, aby oznakować komórki progenitorowe i komórki macierzyste nabłonka rogówki i obrąbka. Wykorzystuje się linię Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT. Następnie należy wybrać odpowiednią kasetę brainbow, w zależności od pytania badawczego oraz dostępnej linii Cree.W tym przypadku wykorzystano linię Brainbow 2.1. Skrzyżuj homozygotyczny szczep R 26 R confetti z homozygotycznym szczepem K 14 Cree ERT, aby uzyskać myszy z czterokolorowymi komórkami K 14 dodatnimi. Aby wywołać rekombinację u myszy transgenicznych, najpierw odważ 80 milligrams tamoksyfenu i rozpuść go w one milliliter oleju kukurydzianego, mieszając na wirówce Vortex.Umieść roztwór w wytrząsanej łaźni wodnej, utrzymywanej w temperaturze 65°C, aż całkowicie się rozpuści, i pozostaw go w łaźni do momentu kolejnego znieczulenia. U ośmiotygodniowej myszy Brainbow 2.1 Cree ERT heterozygotycznej, po dokładnym sprawdzeniu głębokości znieczulenia za pomocą testu ucisku palca, ostrożnie nanieś 100 µL roztworu tamoksyfenu na każdą powierzchnię oka myszy. Bezpośrednie podanie tamoksyfenu zapewnia wysoką wydajność indukcji Cree. Wszelkie pozostałości roztworu tamoksyfenu przechowuj w ciemności w temperaturze 4°C przez maksymalnie jeden tydzień.Podgrzać roztwór przed aplikacją, którą powtarza się przez trzy kolejne dni u każdej myszy. Najpierw rozpuścić jeden gram proszku Tamoksyfenu w pięciu mililitrach sterylnego dimetylosulfotlenku. Aby uzyskać roztwór o stężeniu 200 mg/ml, umieścić go w wstrząsowej łaźni wodnej, utrzymując temperaturę 65 °C aż do całkowitego rozpuszczenia, i pozostawić w łaźni do momentu użycia.Następnie znieczul mysz i sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą ucisku palca stopy, nałóż maść do oczu na nieleczone oko myszy, aby chronić je przed odwodnieniem podczas procedury, i podaj odpowiednie leki przeciwbólowe. Następnie nabierz 200 µL roztworu Tamoksifenu do strzykawki bez igły i nanieś go miejscowo na całą rogówkę oka. Ciecz twardnieje na tkance w temperaturze pokojowej.Obserwuj mysz, aż utrzyma pozycję na brzuchu, i zwróć ją do grupy dopiero wtedy, gdy odzyska pełną przytomność. Po uśmierceniu myszy w odpowiednich punktach czasowych po indukcji, wykonaj uszkodzenie oka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wykonaj enukleację oka, najpierw uciskając powiekę, aby wypchnąć gałkę oczną z oczodołu.Przesuń zakrzywioną pęsetę za gałkę oczną, aby uchwycić nerw wzrokowy, a następnie pociągnij gałkę oczną do góry w celu jej oddzielenia. Umieść każdą gałkę oczną w 60 milimetrowym naczyniu zawierającym PBS. Umieść płytkę z okiem pod chirurgicznym stereomikroskopem.Upewnij się, że rozpoznajesz podstawową budowę oka: rogówkę, limbus oraz nerw wzrokowy. Usuń nerw wzrokowy, mięśnie i tkankę łączną wokół oka. Przytrzymaj oko za tylną część, skierowując rogówkę w dół, a następnie za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie twardówki w tylnej części gałki ocznej.Powiększyć nacięcie, aby soczewka mogła wyskoczyć, a następnie usunąć tęczówkę za pomocą pincety. Następnie wykonać cztery do pięciu nacięć promieniowych, tnąc od środka w kierunku obwodu, aby spłaszczyć rogówkę, a następnie usunąć pozostałe fragmenty tęczówki cienką płaską szpatułką. Na koniec odciąć nadmiar tkanki obwodowej otaczającej limbus, aby unieruchomić rogówkę.Przenieś wypreparowaną tkankę do płytki 12-dołkowej i inkubuj w 4% formaldehydzie przez 10 minut. Następnie krótko przemyj tkankę w PBS, aby zabarwić jądra komórkowe. Inkubuj rogówkę w roztworze DPI o stężeniu 2 µg/mL przez 10 minut, a następnie krótko przemyj w PBS.Następnie należy umieścić rogówkę na szkiełku przedmiotowym stroną nabłonkową do góry. Następnie na wierzch rogówki nanosi się kroplę medium montażowego i przykrywa ją szkiełkiem nakrywkowym. Pozostawić preparaty do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać je w temperaturze 4 °C.Do obrazowania rogówki należy użyć spektralnego systemu konfokalnego umożliwiającego rozdzielenie emisji R-F-P-Y-F-P-G-F-P oraz CFP. Najpierw ustaw długości fal fluorescencji, wzbudzenia i emisji w zależności od białek fluorescencyjnych mózgu. Kaseta Bo, dbając o zapobieganie wzbudzeniu krzyżowemu lub nakładaniu się sygnałów emisji.Następnie należy wykonać obrazy mozaikowe, aby zwizualizować całą rogówkę w wysokiej rozdzielczości. W tym kroku uzyskuje się macierz 12 na 12 obrazów we wszystkich czterech kanałach fluorescencyjnych. Na koniec należy połączyć obrazy, aby stworzyć kompozytowy obraz linii komórkowej.W celu prześledzenia losów komórek progenitorowych nabłonka limbusa i rogówki przeprowadzono eksperymenty z wykorzystaniem myszy konfetti R 26 R. W warunkach stanu stacjonarnego, zgodnie z oczekiwaniami, 10 dni po indukcji zaobserwowano małe skupiska fluorescencyjnych komórek. Po czterech miesiącach pojawiły się pasma rozciągające się od limbusa do centrum rogówki, co sugeruje, że komórki migrują z limbusa w celu regeneracji rogówki po jej uszkodzeniu.Migracja saw z obrąbka następowała szybko, a długie, grube prążki obrąbkowe rozwijały się w ciągu siedmiu dni. Model ten jest cenny w śledzeniu i badaniu komórek macierzystych i progenitorowych rogówki w różnych warunkach. Pozwoli on na badanie klonalnej ekspansji, przeżywalności i migracji komórek w stanie stacjonarnym oraz w warunkach stresu, takich jak zranienie, oparzenia chemiczne, mutacje i inne czynniki w przyszłości.Model ten może zostać również wykorzystany do analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw prawidłowej oraz patologicznej regeneracji rogówki. Technika ta może przyczynić się do zrozumienia różnych stanów patologicznych, takich jak dystrofie rogówki, oparzenia i urazy rogówki, a ponadto do oceny wpływu różnych terapii na regenerację, ekspansję i migrację komórek rogówki.

a-method-for-lineage-tracing-corneal-cells-using-multi-color

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Organizacja komórkowa kości twarzoczaszki od dawna była przedmiotem hipotezy, ale nigdy nie została bezpośrednio zwizualizowana. Wielospektralne znakowanie komórek i obrazowanie na żywo in vivo umożliwiają wizualizację dynamicznego zachowania komórek w dolnej szczęce danio pręgowanego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół manipulowania transgenicznymi rybami Zebrabow i bezpośrednio obserwujemy interkalację komórek i zmiany morfologiczne chondrocytów w chrząstce Meckla.

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Tutaj prezentujemy protokół techniki etykietowania mozaiki, który pozwala na wizualizację neuronów pochodzących ze wspólnej komórki progenitorowej w dwóch różnych kolorach. Ułatwia to analizę linii neuronalnej z możliwością datowania pojedynczych neuronów na narodziny i badania funkcji genów w tych samych neuronach różnych osób.

Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce

Ta metoda opisuje użycie modelu myszy R26R-Confetti (Confetti) do badania zmineralizowanych tkanek, obejmując wszystkie etapy od strategii hodowlanej do pozyskiwania obrazów. Dołączony jest ogólny protokół, który można zastosować do wszystkich tkanek miękkich oraz zmodyfikowany protokół, który można zastosować do tkanek zmineralizowanych.

Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.

Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy

Poznaj metodę wielokolorowego śledzenia linii komórek nabłonka rogówki przy użyciu myszy R26R-Confetti. Technika ta umożliwia nieinwazyjne badanie dynamiki komórek macierzystych i progenitorowych w procesach regeneracji.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Przeglądaj więcej filmów