Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Ogólnym celem tej metody jest lokalizacja oraz śledzenie migracji, ekspansji i przeżywalności komórek macierzystych oraz komórek progenitorowych w nabłonku rogówki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek nabłonka rogówki dotyczące homeostazy, regeneracji tkanek, starzenia się oraz patologii. Główną zaletą tej techniki jest łatwość jej wdrożenia oraz możliwość nieinwazyjnego śledzenia linii komórkowych w sposób klonalny.

Aby rozpocząć, należy najpierw wybrać transgeniczna linię myszy Cree z indukowalnym promotorem specyficznym tkankowo, aby oznakować komórki progenitorowe i komórki macierzyste nabłonka rogówki i obrąbka. Wykorzystuje się linię Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT. Następnie należy wybrać odpowiednią kasetę brainbow, w zależności od pytania badawczego oraz dostępnej linii Cree.

W tym przypadku wykorzystano linię Brainbow 2.1. Skrzyżuj homozygotyczny szczep R 26 R confetti z homozygotycznym szczepem K 14 Cree ERT, aby uzyskać myszy z czterokolorowymi komórkami K 14 dodatnimi. Aby wywołać rekombinację u myszy transgenicznych, najpierw odważ 80 milligrams tamoksyfenu i rozpuść go w one milliliter oleju kukurydzianego, mieszając na wirówce Vortex.

Umieść roztwór w wytrząsanej łaźni wodnej, utrzymywanej w temperaturze 65°C, aż całkowicie się rozpuści, i pozostaw go w łaźni do momentu kolejnego znieczulenia. U ośmiotygodniowej myszy Brainbow 2.1 Cree ERT heterozygotycznej, po dokładnym sprawdzeniu głębokości znieczulenia za pomocą testu ucisku palca, ostrożnie nanieś 100 µL roztworu tamoksyfenu na każdą powierzchnię oka myszy. Bezpośrednie podanie tamoksyfenu zapewnia wysoką wydajność indukcji Cree. Wszelkie pozostałości roztworu tamoksyfenu przechowuj w ciemności w temperaturze 4°C przez maksymalnie jeden tydzień.

Podgrzać roztwór przed aplikacją, którą powtarza się przez trzy kolejne dni u każdej myszy. Najpierw rozpuścić jeden gram proszku Tamoksyfenu w pięciu mililitrach sterylnego dimetylosulfotlenku. Aby uzyskać roztwór o stężeniu 200 mg/ml, umieścić go w wstrząsowej łaźni wodnej, utrzymując temperaturę 65 °C aż do całkowitego rozpuszczenia, i pozostawić w łaźni do momentu użycia.

Następnie znieczul mysz i sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą ucisku palca stopy, nałóż maść do oczu na nieleczone oko myszy, aby chronić je przed odwodnieniem podczas procedury, i podaj odpowiednie leki przeciwbólowe. Następnie nabierz 200 µL roztworu Tamoksifenu do strzykawki bez igły i nanieś go miejscowo na całą rogówkę oka. Ciecz twardnieje na tkance w temperaturze pokojowej.

Obserwuj mysz, aż utrzyma pozycję na brzuchu, i zwróć ją do grupy dopiero wtedy, gdy odzyska pełną przytomność. Po uśmierceniu myszy w odpowiednich punktach czasowych po indukcji, wykonaj uszkodzenie oka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wykonaj enukleację oka, najpierw uciskając powiekę, aby wypchnąć gałkę oczną z oczodołu.

Przesuń zakrzywioną pęsetę za gałkę oczną, aby uchwycić nerw wzrokowy, a następnie pociągnij gałkę oczną do góry w celu jej oddzielenia. Umieść każdą gałkę oczną w 60 milimetrowym naczyniu zawierającym PBS. Umieść płytkę z okiem pod chirurgicznym stereomikroskopem.

Upewnij się, że rozpoznajesz podstawową budowę oka: rogówkę, limbus oraz nerw wzrokowy. Usuń nerw wzrokowy, mięśnie i tkankę łączną wokół oka. Przytrzymaj oko za tylną część, skierowując rogówkę w dół, a następnie za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie twardówki w tylnej części gałki ocznej.

Powiększyć nacięcie, aby soczewka mogła wyskoczyć, a następnie usunąć tęczówkę za pomocą pincety. Następnie wykonać cztery do pięciu nacięć promieniowych, tnąc od środka w kierunku obwodu, aby spłaszczyć rogówkę, a następnie usunąć pozostałe fragmenty tęczówki cienką płaską szpatułką. Na koniec odciąć nadmiar tkanki obwodowej otaczającej limbus, aby unieruchomić rogówkę.

Przenieś wypreparowaną tkankę do płytki 12-dołkowej i inkubuj w 4% formaldehydzie przez 10 minut. Następnie krótko przemyj tkankę w PBS, aby zabarwić jądra komórkowe. Inkubuj rogówkę w roztworze DPI o stężeniu 2 µg/mL przez 10 minut, a następnie krótko przemyj w PBS.

Następnie należy umieścić rogówkę na szkiełku przedmiotowym stroną nabłonkową do góry. Następnie na wierzch rogówki nanosi się kroplę medium montażowego i przykrywa ją szkiełkiem nakrywkowym. Pozostawić preparaty do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać je w temperaturze 4 °C.

Do obrazowania rogówki należy użyć spektralnego systemu konfokalnego umożliwiającego rozdzielenie emisji R-F-P-Y-F-P-G-F-P oraz CFP. Najpierw ustaw długości fal fluorescencji, wzbudzenia i emisji w zależności od białek fluorescencyjnych mózgu. Kaseta Bo, dbając o zapobieganie wzbudzeniu krzyżowemu lub nakładaniu się sygnałów emisji.

Następnie należy wykonać obrazy mozaikowe, aby zwizualizować całą rogówkę w wysokiej rozdzielczości. W tym kroku uzyskuje się macierz 12 na 12 obrazów we wszystkich czterech kanałach fluorescencyjnych. Na koniec należy połączyć obrazy, aby stworzyć kompozytowy obraz linii komórkowej.

W celu prześledzenia losów komórek progenitorowych nabłonka limbusa i rogówki przeprowadzono eksperymenty z wykorzystaniem myszy konfetti R 26 R. W warunkach stanu stacjonarnego, zgodnie z oczekiwaniami, 10 dni po indukcji zaobserwowano małe skupiska fluorescencyjnych komórek. Po czterech miesiącach pojawiły się pasma rozciągające się od limbusa do centrum rogówki, co sugeruje, że komórki migrują z limbusa w celu regeneracji rogówki po jej uszkodzeniu.

Migracja saw z obrąbka następowała szybko, a długie, grube prążki obrąbkowe rozwijały się w ciągu siedmiu dni. Model ten jest cenny w śledzeniu i badaniu komórek macierzystych i progenitorowych rogówki w różnych warunkach. Pozwoli on na badanie klonalnej ekspansji, przeżywalności i migracji komórek w stanie stacjonarnym oraz w warunkach stresu, takich jak zranienie, oparzenia chemiczne, mutacje i inne czynniki w przyszłości.

Model ten może zostać również wykorzystany do analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw prawidłowej oraz patologicznej regeneracji rogówki. Technika ta może przyczynić się do zrozumienia różnych stanów patologicznych, takich jak dystrofie rogówki, oparzenia i urazy rogówki, a ponadto do oceny wpływu różnych terapii na regenerację, ekspansję i migrację komórek rogówki.