Name: Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania komórek endodermy z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu sortowania magnetycznego. Technika ta umożliwia uzyskanie czystej populacji komórek endodermy poprzez usunięcie niezróżnicowanych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za umiejętną pomoc techniczną Jasmin Kresse.

1. Zróżnicowanie ludzkiego ESC w kierunku ostatecznej endodermy
<ol>
	<li>Hodować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ESC) w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Pokryć nową 6-dołkową płytkę do hodowli komórkowych 1 ml matrycy błony podstawnej i inkubować materiał do hodowli przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. W celu uzyskania szczegółowych informacji należy zapoznać się z instrukcjami odpowiedniego producenta.</li>
	<li>Upewnij się, że hodowane ludzkie ESC osiągnęły 80%-90% konfluencji pod mikroskopem, używając małego powiększenia (np. 4X). Odessać pożywkę z jam poprzez odsysanie pożywki za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura. Raz przemyć komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). W tym celu dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, delikatnie potrząśnij płytką i odessaj roztwór, aby usunąć martwe komórki i resztki komórek.</li>
	<li>Dodać 1 ml odczynnika do pasażowania bez enzymów w celu delikatnej dysocjacji klastrów komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu, gdy komórki wykażą wyraźne oznaki rozpadu na małe skupiska. 
	nuta: Czas inkubacji zależy od użytego odczynnika. W przypadku bezenzymatycznego roztworu pasażowego, o którym mowa w rozdziale dotyczącym materiałów, czas inkubacji wynosi około 7 minut.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki DMEM/F-12 i rozbić pozostałe agregaty komórek na pojedyncze komórki, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Użyj tego, aby wypłukać komórki z powierzchni i przenieść je do probówki wirówkowej. Aby pobrać wszystkie komórki, przemyj każdą studzienkę 1 ml pożywki DMEM/F-12 i dodaj pożywkę do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki do hodowli komórek ES zawierającej inhibitor 10 μM kinazy Rho (ROCK).</li>
	<li>Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i zasiej 150 000 - 400 000 komórek na 6 dołków lub w innym układzie płytek, w zależności od użytej linii komórkowej ES. Aby uniknąć apoptozy, należy użyć pożywki hodowlanej zawierającej 10 μM inhibitora ROCK i hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Około 24 godziny po wysiewie odessać pożywkę sterylną szklaną pipetą Pasteura i dodać 2 ml prymitywnej pożywki do indukcji smug. 
	nuta: Pożywka ta zawiera końcowe stężenia 1% glutaminy, 0,2% FCS, 5 μM CHIR-99021 i 50 ng/ml aktywiny A w pożywce Advanced RPMI-1640. Zwykle używa się 2 ml podłoża do uprawy na płytkach 6-dołkowych.</li>
	<li>48 godzin po wysiewie wymienić pożywkę na pożywkę indukcyjną endodermy. Hoduj komórki w tym podłożu przez kolejne 48 godzin z codzienną wymianą podłoża. 
	nuta: Pożywka ta zawiera 1% glutaminy, 0,2% FCS i 50 ng/ml aktywiny A w pożywce Advanced RPMI-1640. Komórki, które są zaangażowane w ostateczną endodermę, wyrażają marker powierzchniowy CXCR4. Barwienie CXCR4 można wykorzystać do ilościowego określenia liczby komórek DE-zaangażowanych.</li>
</ol>
2. Barwienie ostatecznych komórek endodermy CXCR4+ do analizy cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przez ostatnie 24 godziny, ale co najmniej 1 godzinę przed pobraniem, komórki dodać 10 μM inhibitora ROCK do pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Przygotować do hodowli komórkowych, które będą używane do ponownego wysiewu, za pomocą macierzy błony podstawnej, tj. 12-dołkowych płytek do analizy qPCR lub szkiełek komorowych do barwienia immunofluorescencyjnego. Inkubować płytki lub szkiełka podstawowe przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę sterylną szklaną pipetą Pasteura z dołków zróżnicowanych komórek używanych do barwienia i/lub sortowania.</li>
	<li>Dodać 1 ml odczynnika do pasażowania bez enzymów w celu delikatnej dysocjacji klastrów komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu, gdy komórki wykażą wyraźne oznaki rozpadu na małe skupiska. 
	nuta: Czas inkubacji zależy od użytego odczynnika. W przypadku bezenzymatycznego roztworu pasażowego, o którym mowa w rozdziale dotyczącym materiałów, czas inkubacji wynosi około 7 minut.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki DMEM/F-12 i rozbić pozostałe agregaty komórkowe na pojedyncze komórki, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki o pojemności 1 ml. Użyj tego, aby wypłukać komórki z powierzchni i przenieść je do probówki wirówkowej. Aby pobrać wszystkie komórki, przemyj każdą studzienkę 1 ml pożywki DMEM/F-12 bez FCS i dodaj pożywkę do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Komórki z trzech dołków płytki 6-dołkowej powinny dać 10-15 x 106 komórek po trzech dniach różnicowania. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 300 x g. 
	nuta: Dokładna liczba uzyskanych komórek będzie zależeć od pluripotencjalnej linii komórkowej użytej do różnicowania.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze PEB zawierającym 10 μM inhibitor ROCK. Użyj 100 μl tego buforu na maksymalnie 107 komórek. Dodać 10 μM inhibitora ROCK w dniu barwienia. Użyj tego bufora dla wszystkich aplikacji podrzędnych (określanego jako bufor PEB + RI). 
	nuta: Bufor PEB zawiera 0,5% BSA i 2 mM EDTA w PBS. Jeśli ma zostać zabarwionych więcej komórek, odpowiednio dostosuj objętość bufora.</li>
	<li>Dodać 10 μl przeciwciała CXCR4-APC na 107 komórek w 100 μl, co w przybliżeniu odpowiada rozcieńczeniu 1:10, 
	nuta: Stosowanie przeciwciał sprzężonych z APC nie jest obowiązkowe. Zamiast tego można go zastąpić w zależności od użytych mikrogranulek. Jeśli ma zostać wybarwionych więcej komórek, odpowiednio dostosuj objętość przeciwciała.</li>
	<li>Wymieszać, delikatnie obracając probówkę palcami i inkubować w temperaturze 4 °C w lodówce przez 15 minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1-2 ml buforu PEB. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant sterylnym szklanym pipetem Pasteura i ponownie zawiesić osad komórek w 80 μl PEB na 107 komórek i dodać 20 μl mikrogranulek anty-APC. 
	nuta: Jeśli ma zostać wybarwionych więcej komórek, odpowiednio dostosuj objętość mikrokulek.</li>
	<li>Wymieszać, delikatnie obracając probówkę palcami i inkubować w temperaturze 4 °C w lodówce przez 15 minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1-2 ml buforu PEB + RRI. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 300 x g. Zassać bufor. Zawiesić w 500 μl buforu PEB + RI.</li>
</ol>
3. Separacja magnetyczna komórek CXCR4+
<ol>
	<li>Umieść średniej wielkości kolumnę magnetyczną w polu magnetycznym zgodnie z instrukcjami producenta. Wstępnie przepłukać kolumnę 500 μl buforu PEB +RI. Nałóż całą zawiesinę komórek na kolumnę. Zbierz przepływ, ponieważ nie wszystkie komórki zostaną powiązane z kolumną. Upewnij się, że nie przeszkadzasz kolumnom, aby uzyskać optymalne pobieranie komórek CXCR4+.</li>
	<li>Przemyć kolumnę trzykrotnie 500 μl buforu PEB + RI. Zbierz pierwszy przepływ i połącz go z zebranymi komórkami z kroku 3.1. Usuń kolumnę magnetyczną z pola magnetycznego i umieść ją w odpowiedniej probówce zbiorczej. Dodać 1 ml buforu PEB + RI do kolumny. Aby wymyć komórki, mocno wciśnij tłok do kolumny.</li>
	<li>Opcjonalnie: Zebrać wszystkie przepływające próbki oddzielnie i użyć 20 μl każda do analizy liczby komórek CXCR4+ za pomocą cytometrii przepływowej. Ich liczba powinna maleć z każdym krokiem prania. 
	nuta: Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy policzyć co najmniej 2 x 104 żywotne, bramkowane komórki.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.1-3.3 z próbką pobraną przez próbkę z kroku 3.1 i pierwszym przepływem przez próbkę z kroku 3.2 przy użyciu nowej kolumny. Nie używaj ponownie poprzedniej kolumny. Za pomocą tłoka powietrze jest wtłaczane do kolumny, która ją blokuje.</li>
	<li>Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. W zależności od skuteczności różnicowania, początkowo można posortować do 6 x 10 6 komórek, a kolejne 1 x 106 komórek za pomocą drugiej kolumny przy użyciu 10:7 komórek do zabiegu.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i sterylnym szklanym pipetem Pasteura ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do indukcji endodermy z kroku 1.9 z dodatkowym inhibitorem 10 μM ROCK.</li>
	<li>Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Wysiewać komórki w odpowiedniej gęstości, tj. ~ 4 x 105 komórek na studzienkę płytki 12-dołkowej (ok. 3,6 cm2 powierzchni) lub ~ 1,5 x 105 komórek na studzienkę 8-dołkowego szkiełka podstawowego.</li>
</ol>
4. Opcjonalnie: Analiza oczyszczonej populacji endodermy
<ol>
	<li>W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego utrwalić oczyszczone komórki z kroku 3.7 około 24 godziny po wysianiu za pomocą 4% paraformaldehydu i wybarwienia w celu uzyskania ostatecznej endodermy (DE) i/lub białek markera pluripotencji. 
	nuta: Powszechnie stosowane markery DE to FOXA2 i SOX17, powszechnie stosowane markery pluripotencji to OCT3/4, NANOG i SOX26, 8.</li>
	<li>W przypadku analizy RT-qPCR należy zebrać oczyszczone komórki bezpośrednio lub 24 godziny po wysianiu, wyekstrahować całkowite RNA i dokonać odwrotnej transkrypcji cDNA z wyekstrahowanych próbek całkowitego RNA. Użyj 10 ng cDNA jako matrycy w reakcji RT-qPCR (trzykrotnie), aby przeanalizować ekspresję DE i genów markerów pluripotencji6, 8, 
	nuta: Powszechnie stosowane geny markerowe są wymienione w kroku 4.1. Warunki cyklu to 5 minut w temperaturze 95 °C i 40 cykli po 15 sekund w temperaturze 95 °C i 1 minuta w temperaturze 60 °C, po których następuje analiza krzywej topnienia.</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Highly+Purified+Cardiomyocytes+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Small+Molecule-modulated+Differentiation+and+Subsequent+Glucose+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Sgodda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+hepatic+differentiation+strategies+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).</li>
<li>Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-producing+surrogate+beta-cells+from+embryonic+stem+cells%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet.</a> Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).</li>
<li>Katsirntaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+sublineage+specification+of+pluripotent+stem+cells%3A+effect+of+dexamethasone+plus+cAMP-elevating+agents+and+keratinocyte+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor.</a> Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).</li>
<li>Abranches, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro%3A+a+road+map+to+neurogenesis+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo.</a> PLoS One. 4 (7), e6286(2009).</li>
<li>Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+definitive+endoderm+from+human+embryonic+stem+cells+is+initially+independent+from+activin+A+but+requires+canonical+Wnt-signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling.</a> Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+and+efficient+protocol+for+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+into+the+definitive+endoderm+based+on+dispersed+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).</li>
<li>Kim, P. T., Ong, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+definitive+endoderm+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).</li>
<li>Katoh, M., Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analyses+of+CXCR4%3A+transcriptional+regulation+of+CXCR4+based+on+TGFbeta%2C+Nodal%2C+Activin+signaling+and+POU5F1%2C+FOXA2%2C+FOXC2%2C+FOXH1%2C+SOX17%2C+and+GFI1+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors.</a> Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+in+macroencapsulation+devices+following+transplant+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice.</a> Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).</li>
<li>Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+undifferentiated+cells+during+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).</li>
<li>Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+in+the+development+of+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Risk factors in the development of stem cell therapy.</a> J Transl Med. 9, 29(2011).</li>
<li>Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+removal+of+undifferentiated+embryonic+stem+cells+from+differentiation+cultures+through+HSV1+thymidine+kinase+and+ganciclovir+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment.</a> Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).</li>
<li>Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+FACS+approach+isolates+hESC+derived+endoderm+using+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors.</a> PLoS One. 6 (3), 17536(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obecnie stosowane protokoły różnicowania rzadko prowadzą do 100% różnicowania komórek. Z powodów, którymi nadal należy się zająć, niektóre komórki opierają się procesowi różnicowania. W zależności od skuteczności zastosowanego protokołu różnicowania i skłonności linii ESC, często obserwuje się pewną liczbę resztkowych komórek pluripotencjalnych nawet po różnicowaniu się do ostatecznej endodermy. Te szczątkowe komórki mogą upośledzać dalsze różnicowanie lub dalszą analizę, taką jak transkryptomika, proteomika i analiza ek...

Pluripotencjalne komórki macierzyste, takie jak embrionalne komórki macierzyste (ESC), mają zdolność różnicowania się w praktycznie każdy typ komórek ludzkiego ciała. W ten sposób protokoły różnicowania in vitro mogą być wykorzystywane do generowania wielu typów dorosłych komórek, takich jak kardiomiocyty1, hepatocyty2, komórki beta3, nabłonek płuc4 lub komórki neuronalne5. To sprawia, że ESC są cennym narzędziem w potencjalnym leczeniu różnych chorób zwyrodnieniowych3.
Różnicowanie in vitro ESC w kierunku dorosłych tkanek płuc, wątroby i trzustki wymaga pseudo-gastrulacji do komórek przypominających ostateczną endodermę (DE)6. Ponieważ dalsze różnicowanie w kierunku wyżej wymienionych typów komórek somatycznych jest znacznie mniej efektywne, optymalne różnicowanie endodermy uważa się za ograniczające szybkość7. Komórki, które są zaangażowane w linię endodermy, ulegają charakterystycznym zmianom w profilu ekspresji genów. Geny głównego regulatora pluripotencji są regulowane w dół, podczas gdy ekspresja innych czynników transkrypcyjnych, takich jak FOXA2, SOX17, HNF1B, członków rodziny GATA i receptora powierzchniowego CXCR4, jest silnie regulowana w górę6, 8, 9. Wiadomo, że CXCR4 jest transaktywowany przez SMAD2 / 3, za sygnalizacją węzłową/TGF-β i SOX17 ze względu na specyficzne miejsca wiązania w regioniepromotora 10. Jest to więc bardzo odpowiedni marker używany w wielu raportach6, 8, 11-13. Te zmiany ekspresji odzwierciedlają zdarzenie pseudo-gastrulacji, w którym ESC najpierw nabywają cechy prymitywnej populacji komórek przypominających smugi, a następnie angażują się w listek zarodkowy endodermy6.
Jednak protokoły różnicowania rzadko są w 100% skuteczne, ponieważ kilka komórek może opierać się procesowi różnicowania lub różnicować się w kierunku innych niezamierzonych linii14. Komórki te mogą negatywnie wpływać na dalsze różnicowanie. Co więcej, szczątkowe niezróżnicowane komórki niosą ze sobą duże ryzyko dla późniejszych eksperymentów transplantacyjnych i mogą prowadzić do powstawania potworniaków15-17.
Aby usunąć te niechciane komórki na wczesnym etapie, marker powierzchniowy CXCR4 może być użyty do oczyszczania komórek, które są zaangażowane w DE18. W tym miejscu opisujemy metodę pozytywnej selekcji komórek CXCR4+ z kultur różnicujących DE. W tym celu marker powierzchniowy CXCR4 jest wiązany przez przeciwciało, które następnie wiąże się z mikrokulkami magnetycznymi. W przeciwieństwie do trudnych warunków podczas sortowania FACS, magnetycznie znakowane ogniwa DE-podobne mogą być następnie łatwo oczyszczane w formacie stołowym przy użyciu delikatnej metody oczyszczania. Protokół ten zapewnia prostą metodę usuwania populacji komórek, które oparły się procesowi różnicowania DE.

<table><tbody><tr><td>Linia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych Hues8</td><td>Harvard Department of stem cell & regenerative biology</td><td></td><td>Odpowiednia linia komórkowa do generacji</td></tr><tr><td>endodermy Linia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych Hes3</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Odpowiednia i wytrzymała linia komórkowa do generowania endodermy</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>Pożywka hodowlana ESC</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowane technologie życia RPMI 1640</td><td></td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anty-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Separator OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>pole magnetyczne</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>Inhibitor ROCK</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>Bez enzymów roztwór do pasażowania, alternatywa: Trypsin/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>matryca błony podstawnej * rozpuścić i przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -80 &; C zgodnie z instrukcją dla dostawców. Po użyciu rozmrozić na lodzie, rozcieńczyć w 25 ml lodowatego nokautu DMEM/F-12. Dodać 1 ml do każdego dołka na 6-dołkowej płytce i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć matrycę i natychmiast zużyć. </td></tr><tr><td>Kolumny MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separator MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek FOXA2 REV tcatgttgctcacggagta</td><td>Technologie</td><td></td><td></td>życiowe</tr><tr><td>Ludzkie GSC FW gaggagaaagtggaggtggtt</td><td>Życie Technologie Człowiek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 Test TaqMan</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Technologie</td><td></td><td></td>życiowe</tr><tr><td>Człowiek SOX7 REV tgcggccggggtacttgtag</td><td>Technologie</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>życiaCzłowiek POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggggg</td><td>Technologie</td><td></td><td></td>życiowe</tr><tr><td>Ludzki POU5F1 REV ctgcagtgtgtgtttcgggca</td><td>Technologie</td><td></td><td></td>życiowe</tr><tr><td>Ludzki nanog FW ccgagggcagacatcatcc</td><td>Technologie</td><td></td><td></td>życiowe</tr><tr><td>Ludzki nanog REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Technologie życia Ludzki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca a</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD REV cga TGA TG TG GGT TCC AGC CTA t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R& Systemy D</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Zdolności różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych, takich jak embrionalne komórki macierzyste (ESC), pozwalają na potencjalne zastosowanie terapeutyczne dla terapii zastępczych komórek. Terminalnie zróżnicowane typy komórek mogą być wykorzystywane w leczeniu różnych chorób zwyrodnieniowych. Różnicowanie in vitro tych komórek w kierunku tkanek płuc, wątroby i trzustki wymaga w pierwszej kolejności wytworzenia ostatecznych komórek endodermy. Ten etap ogranicza szybkość dalszego różnicowania w kierunku terminalnie dojrzałych typów komórek, takich jak komórki beta wytwarzające insulinę, hepatocyty lub inne typy komórek pochodzących z endodermy. Komórki, które są zaangażowane w linię endodermy, wykazują wysoką ekspresję wielu czynników transkrypcyjnych, takich jak FOXA2, SOX17, HNF1B, członkowie rodziny GATA i receptor powierzchniowy CXCR4. Jednak protokoły różnicowania rzadko są w 100% skuteczne. W tym miejscu opisujemy metodę oczyszczania populacji komórek CXCR4+ po różnicowaniu do DE za pomocą mikrokulek magnetycznych. To oczyszczenie dodatkowo usuwa komórki niechcianych linii. Metoda delikatnego oczyszczania jest szybka i niezawodna i może być stosowana w celu poprawy dalszych zastosowań i różnicowania.

Po zróżnicowaniu Embrionalne komórki macierzyste (ESC) przechodzą drastyczne zmiany w ekspresji genów i białek. Rycina 1 przedstawia typowe geny markerowe, które można wykorzystać do weryfikacji prawidłowej różnicowania w endodermę. Głównymi celami analizy ekspresji genów są GSC, FOXA2, i SOX17. W analizie względnej ekspresji genów, w szczególności FOXA2 i SOX17 zwiększają się poprzez &gt; 2000-krotnie w porówn...

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Ogólnym celem tej metody jest oczyszczanie komórek endodermalnych generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub komórek ES. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych dotyczące różnicowania endodermalnego. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania czystej populacji komórek endodermy po usunięciu komórek nieróżnicujących się.Przed rozpoczęciem procedury należy pokryć płytki hodowlane z sześcioma dołkami macierzą błony podstawnej w ilości jednego mililitra na dołek. Pozostawić na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, aby zebrać ludzkie komórki ES, należy odessać medium z hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych o stopniu konfluencji od 80 do 90%, używając sterylnej szklanej pipety Pasteura.Następnie należy przemyć komórki dwiema mililitrami PBS na każdą studzienkę. Płytkę należy potrząsnąć, a następnie odessać sól fizjologiczną, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia. W dalszej kolejności należy delikatnie rozczłonkować skupiska komórek za pomocą jednego mililitra odczynnika w postaci roztworu do pasażowania bez enzymów, w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, aż do momentu, gdy komórki wykażą wyraźne oznaki rozpadu na mniejsze skupiska.Po około siedmiu minutach dodaj do otworów jeden mililitr pożywki DMMF12. Następnie, używając końcówki do pipety o pojemności jednego mililitra, kilkakrotnie zasysaj i wydmuchuj ciecz, aby odłączyć pozostałe agregaty komórkowe i uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Korzystając z tej samej pipety, przenieś komórki do probówki wirówkowej i przemyj otwory jednym mililitrem świeżej pożywki DMMF12, zbierając płukanki w probówce.Po odwirowaniu komórek, ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki do hodowli komórek ES uzupełnionej o inhibitor ROCK. Policzyć komórki i wysiać od 1,5 do 4 × 10⁵ komórek na dołek na płytkach powlekanych macierzą błony podstawnej w pożywce hodowlanej uzupełnionej o inhibitor ROCK w celu zapobiegania apoptozie. Inkubować komórki przez około 24 godziny.Następnie za pomocą sterylnej, szklanej pipety Pasteura należy wymienić medium w każdym dołku na 2 milliliters medium indukującego pręgę pierwotną. Po kolejnych 24 godzinach hodowli medium należy zastąpić medium indukującym endodermę i inkubować przez 48 godzin, codziennie wymieniając medium. W ostatnim dniu hodowli, co najmniej na godzinę przed zbiorami komórek, do medium hodowlanego należy dodać świeży inhibitor ROCK.Następnie za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura odessać pożywkę z każdej z studzienek i zdysocjować komórki za pomocą odczynnika w postaci roztworu do pasażowania bez enzymów, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek, należy policzyć komórki i poddać je wirowaniu. Należy upewnić się, że od tego momentu wszystkie pożywki i bufory zawierają inhibitor ROCK, aby zapobiec obumieraniu komórek.W przeciwnym razie po cofnięciu się płynu nie przyczepią się one prawidłowo. Ponownie zawiesić osad w 100 µL buforu PEB, uzupełnionego o inhibitor ROCK w przeliczeniu na 1 × 10⁷ komórek. Następnie dodać do komórek przeciwciało CXCR4 APC.Delikatnie potrząśnij probówką, aby wymieszać zawartość. Po 15 minutach w temperaturze 4 °C przemyj komórki w 1–2 ml buforu PEB i za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura odessij supernatant. Resuspenduj osad w 80 µl buforu PEB na każde 1 × 10⁷ komórek i dodaj do komórek 20 µl mikrokulek anti-APC.Wymieszaj próbkę, delikatnie potrząsając probówką. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 4°C przez 15 minut. Po zakończeniu inkubacji przemyj komórki od 1 do 2 ml buforu PEB z dodatkiem inhibitora ROCK.Następnie zawiesinę z osadu należy ponownie zawiesić w 500 µL świeżego buforu PEB z dodatkiem inhibitora. W celu wyizolowania komórek CXCR4+ za pomocą separacji kuleczkami magnetycznymi, należy załadować kolumnę magnetyczną średniej wielkości na odpowiedni magnes i przepłukać ją 500 µL buforu PEB z inhibitorem ROCK. Gdy cały płuczący roztwór spłynie z góry kolumny, należy nanieść na nią całą objętość komórek znakowanych kuleczkami magnetycznymi, zbierając frakcję przepływową do probówki stożkowej.Przemyj kolumnę trzykrotnie, aplikując po 500 µL buforu PEB z inhibitorem ROCK. Następnie przenieś kolumnę z magnesu do odpowiedniej probówki zbiorczej. Przelej przez kolumnę 1 mL buforu PEB z inhibitorem ROCK, aby zebrać komórki CXCR4+.Opcjonalnie wszystkie próbki przepływowe można zbierać oddzielnie, a 20 µL alikwoty z każdej próbki można wykorzystać do oznaczenia procentowej zawartości komórek CXCR4+ w każdej alikwocie za pomocą cytometrii przepływowej. Procedurę tę można powtórzyć z pierwszą frakcją przepływową, aby zebrać komórki, które nie związały się z kolumną. Następnie należy połączyć obie alikwoty próbek CXCR4+ i poddać je wirowaniu.Na koniec ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze medium do indukcji endodermy uzupełnionego o inhibitor ROCK i wysiać komórki z odpowiednią gęstością do naczynia hodowlanego powleczonego macierzą błony podstawnej. Przed różnicowaniem ludzkie komórki ES wykazują wysoki poziom markeru pluripotencji SOX2, natomiast nie stwierdza się obecności FOXA2, markera ostatecznej endodermy.Podczas różnicowania komórki ES przechodzą gwałtowne zmiany w ekspresji genów i białek. Rzeczywiście, po czterech dniach w medium do różnicowania białka SOX17 i FOXA2 są równomiernie koekspresjonowane w jądrach wielu byłych komórek ES, co jest cechą charakterystyczną dla zaangażowania w linię ostatecznej endodermy. Niektóre komórki opierają się procesowi różnicowania, nie wykazując ekspresji żadnego z dwóch białek markerowych.W rzeczywistości zachowują one ekspresję markera pluripotencji SOX2. W tym reprezentatywnym eksperymencie, w trzecim dniu różnicowania, blisko 60% zebranych komórek ES wykazywało ekspresję CXCR4, a ich czystość została zwiększona do ponad 85% po sortowaniu za pomocą kulek magnetycznych w celu usunięcia komórek pluripotencjalnych oraz innych niepożądanych linii komórkowych. Po wysianiu oczyszczonych komórek CXCR4+, wykryto jedynie kilka komórek SOX2+, podczas gdy większość wysianych komórek wykazywała ekspresję FOXA2.Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne analizy, takie jak immunohistochemia lub qPCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące procesu różnicowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak oczyszczać komórki endodermy za pomocą sortowania magnetycznego.

a-quick-efficient-method-for-purification-endoderm-cells-generated

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu sprawia, że stanowią one ogromną obietnicę zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym materiale przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalną izolację masy komórkowej...

Wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Pomimo podejmowanych wysiłków w celu przejścia na warunki hodowli bez komórek podporowych, izolacja i hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pozostają w dużej mierze zależne od kokultur z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs). W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodologię szybkiego usuwania komórek podporowych z kultur hESC przed przystąpieniem do eksperymentów.

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opisujemy użycie przeciwciał monoklonalnych TG30 (CD9) i GCTM-2 do połączonego wykrywania antygenów powierzchniowych komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do identyfikacji i wzbogacania żywych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) za pomocą selekcji pozytywnej, a także użycie selekcji negatywnej do usuwania hESC z populacji komórek mieszanych.

Wzbogacanie i oczyszczanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez wykrywanie antygenów powierzchniowych komórek przy użyciu przeciwciał monoklonalnych TG30 i GCTM-2

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów (HLC) poprzez ciągłe uzupełnianie Activiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC do ostatecznej endodermy (DE).

Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Aby uniknąć ograniczeń związanych z enzymatycznym lub mechanicznym pasażowaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) hodowanych na komórkach żywicielskich, ustaliliśmy szybką, skuteczną, ekonomiczną, wysokowydajną metodę zbierania kolonii hESC lub hiPSC utrzymywanych na warstwie komórek zasilających ludzkie fibroblasty napletka za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA.

Szybkie, ekonomiczne, bezenzymatyczne pasażowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na komórkach zasilających przez dysadhezję za pośrednictwem kwasu etylenodiaminotetraoctowego

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Poznaj metodę oczyszczania komórek endodermy z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu sortowania magnetycznego. Technika ta umożliwia uzyskanie czystej populacji komórek endodermy poprzez usunięcie niezróżnicowanych komórek.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów