Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem tej metody jest oczyszczenie komórek endodermy powstałych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub komórek ES. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych dotyczące różnicowania endodermy. Główną zaletą tej techniki jest to, że po usunięciu niezróżnicowanych komórek można uzyskać czystą populację komórek endodermy.

Przed rozpoczęciem procedury pokryj sześć dołków płytek do hodowli komórkowych jednym mililitrem macierzy błony podstawnej na studzienkę. Przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, aby pobrać ludzkie komórki ES, odessać pożywkę z 80 do 90% zlewającej się hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą sterylnej szklanej pipety pastwiskowej.

I umyj komórki dwoma mililitrami PBS na studzienkę. Potrząsanie płytką i zasysanie soli fizjologicznej w celu usunięcia martwych komórek i zanieczyszczeń. Następnie delikatnie oddziel klastry komórek za pomocą jednego mililitra odczynnika do pasowania bezenzymatycznego roztworu pasażującego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż komórki wykażą wyraźne oznaki rozpadu na mniejsze skupiska.

Po około siedmiu minutach dodaj jeden mililitr pożywki DMMF12 do studzienek. I pipetuj kilka razy w górę i w dół za pomocą jednomililitrowej końcówki do pipety, aby odłączyć pozostałe agregaty komórek do zawiesiny pojedynczej komórki. Za pomocą tej samej pipety przenieś komórki do probówki wirówkowej i przepłucz studzienki jednym mililitrem świeżej pożywki DMMF12, gromadząc popłuczyny w probówce.

Po odwirowaniu komórek ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki do hodowli komórek ES uzupełnionej inhibitorem ROCK. Policz komórki i nasiona 1,5:4 razy 10 do piątej komórki na studzienkę na płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej w pożywce hodowlanej uzupełnionej inhibitorem ROCK w celu zapobieżenia apoptozie. Inkubować komórki przez około 24 godziny.

A następnie użyj sterylnej, szklanej pipety Pasteura, aby zastąpić pożywkę w każdym dołku 2 mililitrami prymitywnego podłoża do indukcji smug. Po kolejnych 24 godzinach hodowli zastąp pożywkę pożywką indukcyjną endodermy na 48-godzinną inkubację z codzienną zmianą podłoża. W ostatnim dniu hodowli i co najmniej godzinę przed pobraniem komórek dodać świeży inhibitor ROCK do pożywki hodowlanej.

Następnie użyj sterylnej, szklanej pipety Pasteura, aby zassać pożywkę z każdej z studzienek i zdysocjować komórki za pomocą odczynnika do pasażowania bez enzymów, jak pokazano. Po uzyskaniu zawiesiny jednokomórkowej należy policzyć komórki i odwirować je. Upewnij się, że od tego momentu wszystkie podłoża i zawierają inhibitor ROCK, aby zapobiec śmierci komórek.

W przeciwnym razie nie zostaną prawidłowo przymocowane po cofnięciu. Ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu PEB, uzupełnionego inhibitorem ROCK na 1 razy 10 do siódmej komórki. Następnie dodaj przeciwciało CXCR4 APC do komórek.

Delikatnie przesuwaj probówkę, aby wymieszać. Po 15 minutach w temperaturze 4 stopni Celsjusza umyj komórki w jednym do dwóch mililitrów buforu PEB i użyj sterylnej, szklanej pipety Pasteura do odessania supernatantu. Ponownie zawiesić osad w 80 mikrolitrach buforu PEB na 1 razy 10 do siódmych komórek i dodać 20 mikrolitrów mikrogranulek anty-APC do komórek.

Wymieszać próbkę, delikatnie trzepiąc. Następnie inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Pod koniec inkubacji przemyć komórki jednym do dwóch mililitrów buforu PEB uzupełnionego inhibitorem ROCK.

I ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach świeżego buforu PEB plus inhibitor. Aby odizolować ogniwa CXCR4 + przez separację kulek magnetycznych, załaduj średniej wielkości kolumnę magnetyczną na magnes o odpowiedniej wielkości i wstępnie przepłucz kolumnę buforem PEB o pojemności 500 mikrolitrów oraz inhibitorem ROCK. Gdy cała ciecz spłynie z górnej części kolumny, nałóż całą objętość komórek oznaczonych kulkami magnetycznymi do kolumny, zbierając przepływ w stożkowej rurce.

Przemyć kolumnę trzema aplikacjami po 500 mikrolitrów buforu PEB plus inhibitor ROCK. Następnie przenieś kolumnę z magnesu do odpowiedniej rurki zbiorczej. I zanurz jeden mililitr buforu PEB plus inhibitor ROCK przez kolumnę, aby zebrać komórki CXCR4+.

Opcjonalnie wszystkie próbki przepływowe można pobrać oddzielnie, a 20 mikrolitrów podwielokrotności z każdej próbki można użyć do określenia procentowej zawartości komórek CXCR4 + w każdym alouette za pomocą cytometrii przepływowej. Tę procedurę można powtórzyć z pierwszym przepływem w celu zebrania komórek, które nie są powiązane z kolumną. Następnie zebrać obie wszystkie próbki CXCR4+ i odwirować je.

Na koniec ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki indukcyjnej endodermy uzupełnionej inhibitorem ROCK i wysiać komórki o odpowiedniej gęstości w pojemniku do hodowli komórek pokrytym matrycą błony podstawnej. Przed różnicowaniem ludzkie komórki ES wyrażają wysoki poziom markera pluripotencji SOX2. Natomiast ostateczny marker endodermy, FOXA2, nie jest wykrywany.

Po różnicowaniu komórki ES ulegają drastycznym zmianom w ekspresji genów i białek. Rzeczywiście, po czterech dniach w pożywce różnicowej, SOX17 i FOXA2 ulegają jednolitej ekspresji w jądrach wielu byłych komórek ES, co jest cechą charakterystyczną ostatecznego zaangażowania endodermy. Niektóre komórki opierają się procesowi różnicowania, nie wyrażając żadnego z dwóch białek markerowych.

I rzeczywiście, zachowują swój marker pluripotencji ekspresję SOX2. W tym reprezentatywnym eksperymencie, w trzecim dniu różnicowania, prawie 60% zebranych komórek ES wykazywało ekspresję CXCR4, którego czystość została wzbogacona do ponad 85% po magnetycznym sortowaniu kulek pluripotencjalnych i innych niepożądanych komórek linii. Po wysianiu oczyszczonych komórek CXCR4 + wykrywa się tylko kilka komórek SOX2 +, przy czym większość komórek nasionych wykazuje ekspresję FOXA2.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić inne, takie jak histochemia immunologiczna lub QPCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące procesu różnicowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyszczać komórki endodermy za pomocą magnetycznego sortowania kulkowego.