Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych iwakaftoru, jego głównych metabolitów i lumakaftoru w płynach biologicznych pacjentów z mukowiscydozą

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie próbek do analizy plazmy. Należy pamiętać, że w celu zapewnienia ich integralności wszystkie próbki i wzorce powinny być przechowywane w temperaturze od 2 do 8 °C podczas pobierania i przetwarzania. Po zakończeniu obróbki wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

W celu przygotowania standardów, należy sporządzić dwa niezależne roztwory zapasowe każdego anilidu, ivacaftoru, metabolitu M1, metabolitu M6 oraz lumacaftoru w metanolu w stężeniach 100 µg/mL oraz 10 µg/mL. Należy pamiętać, że związki te tracą ważność po 10 dniach przechowywania w temperaturze pokojowej. Do przygotowania standardów należy przenieść 100 µL ludzkiej osocza do polipropylenowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.

Powtórz tę czynność dla wszystkich pozostałych próbek. Następnie dodaj wzorzec wewnętrzny do każdej probówki. Na przykład, wybieramy 0,01 µg/mL z przygotowanego roztworu wzorcowego.

Teraz probówka zawiera plazmę wzbogaconą standardem wewnętrznym. Postęp w ten sam sposób ze wszystkimi pozostałymi standardami. Pobierz standardy i odwiruj je przez kilka sekund, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie probówki.

Powtórz tę czynność dla wszystkich 40 wzorców. W przypadku próbek pacjentów przenieś 100 µL z probówki z próbką pacjenta do probówki do mikrocentryfugi. Autentyczna próbka pacjenta nie jest wzbogacona wzorcem wewnętrznym.

Wiruj próbkę pacjenta przez kilka sekund, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie probówki. Kolejne kroki dotyczą zarówno próbek, jak i wzorców. Do każdej probówki z próbką dodaj 200 µL 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu w celu wytrącenia białek osocza.

Powtórz tę czynność dla wszystkich wzorców i próbek pacjentów. Każdą próbkę intensywnie wymieszaj w wirówce vortex przez około 15 sekund. Powtórz tę czynność dla wszystkich wzorców i próbek z analizą poziomu substancji w organizmie (incurred samples).

Pozostawić na 10 minut w lodówce, aby ułatwić wytrącanie. W celach demonstracyjnych odwiruję tylko jedną próbkę i jeden standard. Wirowanie przeprowadzamy z prędkością 10 000 rpm przez 10 minut w wirówce Eppendorf Centrifuge 5430 w temperaturze czterech stopni.

Następnie przefiltrujemy nadsącz do fiolek Phenomenex. W tym celu używamy 13 mm filtrów strzykawkowych z nylonową membraną Grace o porach 0,45 µm zakupionych w USA i filtrujemy do fiolek HPLC o pojemności 1,5 ml. Po filtracji przeniesiemy 100 µl nadsączu do fiolek LC/MS w celu przeprowadzenia analizy LC/MS.

Próbka jest teraz gotowa do analizy. Teraz wystarczy umieścić wszystkie próbki w statywie na fiolki. Używamy systemu Shimadzu 8030 LC/MS połączonego z potrójnym spektrometrem mas quadrupole.

Pozostaw system do czasu osiągnięcia stanu równowagi przed przystąpieniem do analizy. Po ustabilizowaniu systemu, co zajmuje około 15 minut, naciśnij przycisk Start. Dla każdego metabolitu sporządź krzywą kalibracyjną, nanosząc stosunki powierzchni piku anilidów w funkcji nominalnego stężenia wzorców kalibracyjnych.

Użyj równania regresji dla krzywej kalibracyjnej, aby obliczyć stężenia anilidów w próbce badanej. Typowy chromatogram przedstawiono na tej rycinie. Zoptymalizowaną rozdzielczość chromatograficzną uzyskano, stosując fazę ruchomą składającą się ze 100% acetonitrile i 0,1% formic acid w wodzie z elucją gradientową na kolumnie Phenomenex Kinetex C8.

Czasy retencji w LC były następujące: dla M6 wynosiły one jedną minutę, a dla M1 1,3 minuty.

Dla iwakaftoru czas retencji wyniósł 1,55 minuty, a dla lumakaftoru 2,3 minuty. we wszystkich blankowych próbkach osocza nie zaobserwowano zakłóceń czasu retencji żadnego z anilidów, ani nie wykryto zakłóceń wynikających z połączenia iwakaftoru z lumakaftorem.

Dzięki wysokoprzepustowej analizie dużej liczby próbek pacjentów zoptymalizowaliśmy naszą opisaną metodę poprzez zastosowanie kolumny do chromatografii odwróconej Phenomenex C8 o mniejszym rozmiarze porów oraz gradientowego układu rozpuszczalników zamiast dotychczasowej elucji izokratycznej. Skraca to czas analizy do sześciu minut na próbkę, wliczając fazę płukania. Ta niezawodna i nowatorska metoda stanowi proste, czułe i szybkie podejście do monitorowania terapeutycznego poziomu leków ivacaftor oraz kombinacji ivacaftor-lumacaftor w płynach biologicznych.

Z uwagi na konieczność opracowania zależności między ekspozycją a odpowiedzią w celu maksymalizacji skuteczności leku oraz ograniczenia kosztów opieki zdrowotnej, niezbędne jest opracowanie i walidacja bardziej czułych narzędzi, które pomogą klinicystom w stosowaniu terapii opartej na dowodach oraz wysokoprzepustowych technik analitycznych u pacjentów cierpiących na CF. Zastosowanie proponowanej metody analitycznej w klinicznych badaniach farmakokinetycznych i farmakodynamicznych stwarza możliwość dalszego zbadania parametrów farmakokinetycznych iwakaftoru lub kombinacji iwakaftor-lumakaftor na większej grupie pacjentów.