Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych iwakaftoru, jego głównych metabolitów i lumakaftoru w płynach biologicznych pacjentów z mukowiscydozą

Jest to protokół przygotowania próbki do testu osocza. Należy pamiętać, że aby zapewnić ich integralność, wszystkie próbki i wzorce powinny być przechowywane w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza podczas pobierania i przetwarzania. Po zakończeniu obchodzenia się z próbkami należy przechowywać wszystkie próbki w temperaturze minus 20 stopni.

Do przygotowania wzorcowego należy przygotować dwa niezależne roztwory podstawowe każdego anilidku, iwakaftoru, metabolitu M1, metabolitu M6 i lumakaftoru w metanolu w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr i 10 mikrogramów na mililitr. Należy pamiętać, że związki tracą ważność po 10 dniach na ławce. W przypadku norm przenieś 100 mikrolitrów ludzkiego osocza do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych z polipropylenu.

Kontynuuj to dla wszystkich innych próbek. Następnie dodaj wzorzec wewnętrzny do każdej probówki. Na przykład z przygotowanego wzorca wybieramy 0,01 mikrograma na mililitr.

Otóż ta tuba zawiera plazmę wzbogaconą wewnętrznym wzorcem. Postępuj w ten sposób ze wszystkimi innymi standardami. Weź swoje standardy i odkręć je w dół przez kilka sekund, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie tuby.

Kontynuuj to dla wszystkich swoich 40 standardów. W przypadku próbek pacjenta przenieś 100 mikrolitrów z probówki z próbką pacjenta do probówki mikrowirówkowej. Rzeczywista próbka pacjenta nie jest wzbogacona wewnętrznym wzorcem.

Obracaj próbkę pacjenta przez kilka sekund, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie probówki. Kolejne kroki są przeznaczone zarówno dla próbek, jak i wzorców. Dodaj 200 mikrolitrów 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu do każdej probówki z próbką, aby wytrącić białka osocza.

Kontynuuj to w przypadku wszystkich standardów i próbek pacjentów. Energicznie wirować każdą próbkę przez około 15 sekund. Kontynuuj to dla wszystkich norm i pobranych próbek.

Odstawić na 10 minut do lodówki, aby ułatwić wytrącanie się. W celach demonstracyjnych odwiruję tylko jedną próbkę i jeden wzorzec. Wirujemy z prędkością 10 000 obr./min przez 10 minut na wirówce Eppendorf 5430 w temperaturze czterech stopni.

Teraz przefiltrujemy supernatant do fiolek Phenomenex. W tym celu używamy 13-milimetrowego filtra strzykawkowego z nylonowymi filtrami Grace o grubości 0,45 mikrometra zakupionymi w USA i filtrujemy do fiolek HPLC, które mogą zawierać 1,5 mililitra. Po filtracji przeniesiemy 100 mikrolitrów supernatantu do fiolek LC/MS w celu analizy LC/MS.

Ta próbka jest teraz gotowa do analizy. Teraz po prostu umieść wszystkie próbki w stojaku na fiolki. Używamy systemu Shimadzu 8030 LC/MS w połączeniu z potrójnym kwadrupolem o masie.

Pozwól systemowi zrównoważyć się przed analizą. Po wyrównaniu, co zajmuje około 15 minut, wystarczy nacisnąć przycisk Start. Dla każdego metabolitu należy skonstruować krzywą kalibracyjną, wykreślając stosunek powierzchni pików anilidów do nominalnego stężenia wzorców kalibracyjnych.

Użyj równania regresji dla krzywej kalibracyjnej, aby obliczyć stężenia anilidów w pobranej próbce. Typowy chromatogram jest pokazany na tym rysunku. Zoptymalizowaną rozdzielczość chromatograficzną uzyskano przy użyciu fazy ruchomej 100% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie z elucją gradientową na kolumnie Phenomenex Kinetex C8.

Czasy przechowywania LC były następujące. Dla M6 jedna minuta. Dla M1 1,3 minuty.

Dla iwakaftoru 1,55 minuty. W przypadku lumakaftora 2,3 minuty. We wszystkich ślepych próbkach osocza nie zaobserwowano interferencji z czasem retencji któregokolwiek z anilidów, ani nie wykryto interferencji wynikającej z jednoczesnego stosowania iwakaftoru z lumakaftorem.

Dzięki wysokoprzepustowej analizie dużej ilości próbek pobranych od pacjentów, zoptymalizowaliśmy naszą zgłoszoną metodę poprzez zastosowanie kolumny do chromatografii odwróconych faz o mniejszej wielkości porów i kolumny Phenomenex C8 oraz gradientowego systemu rozpuszczalnikowego zamiast obecnej elucji izokratycznej. Skraca to czas pracy do sześciu minut na próbkę, wliczając w to fazę mycia. Ta niezawodna i nowatorska metoda oferuje proste, czułe i szybkie podejście do monitorowania terapeutycznego leków w iwakaftorze i kombinacji iwakaftoru-lumakaftoru oraz płynów biologicznych.

Biorąc pod uwagę potrzebę opracowania zależności między ekspozycją a reakcją w celu maksymalizacji skuteczności leku, a także ograniczenia kosztów opieki zdrowotnej, należy opracować i zwalidować bardziej czułe narzędzia, aby pomóc klinicystom w stosowaniu terapii opartej na dowodach i wysokoprzepustowych technik analitycznych u pacjentów cierpiących na CF.By zastosowaniu proponowanej metody analitycznej w klinicznych badaniach farmakokinetycznych i farmakodynamicznych, pojawia się możliwość dalszego zbadania parametrów farmakokinetycznych iwakaftoru lub Skojarzenie iwakaftoru i lumakaftoru na większej grupie pacjentów.