Name: Absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Poznaj techniki nasosorpcji i bronchosorpcji do pobierania płynu z błony śluzowej dróg oddechowych z użyciem syntetycznych matryc sorpcyjnych. Metody te umożliwiają standaryzowane i tolerowane pobieranie próbek w badaniach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie: Ta praca była wspierana przez fundusze z Centrum Badań Biomedycznych (BRC) Imperial National Institute for Health Research (NIHR), Jednostki Badawczej Ochrony Zdrowia NIHR (HPRU) w Imperial College London we współpracy z Public Health England (PHE) i NIHR Imperial Patient Safety Translational Research Centre. Wyrażone poglądy są poglądami autorów, a niekoniecznie poglądami NHS, NIHR, Departamentu Zdrowia lub Zdrowia Publicznego Anglii.

Techniki użyte w poniższym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych w Zachodnim Londynie (numer referencyjny 15/lO/0444).
1. Absorpcja przez nos (NA)
<ol>
	<li>Przygotowanie przed pobraniem próbek z azotu północnego
	<ol>
		<li>Podczas wykonywania NA, najpierw umyj ręce i załóż rękawiczki, najlepiej w obecności pacjenta.</li>
		<li>Sprawdź jamę nosową za pomocą latarki czołowej i poproś lekarza, aby użył niedominującego kciuka do cofnięcia nosa pacjenta, aby uwidocznić jamę nosową. 
		nuta: Wziernik do nosa zwykle nie jest wymagany.</li>
		<li>Wizualizacja jamy nosowej i małżowiny usznej dolnej przed pobraniem próbki. 
		nuta: Nozdrza (nozdrza) nie są okrągłe w przekroju poprzecznym i biegną prosto do tyłu. Ogólnie rzecz biorąc, małżowina nosowa dolna może być postrzegana jako wybrzuszenie lub wgłębienie na bocznej ścianie nozdrza, przy czym przegroda nosowa tworzy gładką, płaską ścianę przyśrodkową. Chcemy pobrać próbkę z tego dolnego małżowiny nosowej, ponieważ leżący pod spodem nabłonek jest prostym nabłonkiem rzęskowym dróg oddechowych44.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek w Ameryce Północnej
	<ol>
		<li>Podczas pobierania próbek należy delikatnie przesunąć NA SAM w górę światła nozdrza, ustawiając go tak, aby przylegał płasko do małżowiny dolnej.</li>
		<li>Poproś dawcę, aby użył palca wskazującego do przyciśnięcia SAM do błony śluzowej nosa. NA może powodować lekkie łaskotanie, z możliwym łzawieniem oczu, gdy MLF jest wchłaniany. 
		nuta: U dorosłych na ogół wykonujemy NA przez 60 s.</li>
		<li>Po wchłonięciu MLF wyjmij urządzenie NA z nozdrza i włóż z powrotem do oryginalnej probówki.</li>
		<li>Próbki należy natychmiast przetworzyć w laboratorium lub zamrozić, zgodnie z opisem w dalszej części niniejszego protokołu. 
		nuta: NA jest badany w różnych modelach prowokacji błony śluzowej nosa, a także w różnych chorobach dróg oddechowych. Należy jednak przeprowadzić walidację w odniesieniu do innych metod pobierania próbek z układu oddechowego dla każdego badania i każdej populacji pacjentów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Absorpcja oskrzelowa (BA)
<ol>
	<li>Przygotowanie przed pobraniem próbek BA 
	nuta: Licencjat wykonywany jest przez wyspecjalizowany personel w pracowni bronchoskopii.
	<ol>
		<li>Przed umieszczeniem urządzenia BA w cewniku należy sprawdzić, czy SAM wysuwa się i wycofuje z powrotem do cewnika.</li>
		<li>Przed przeprowadzeniem BA na pacjencie przeprowadź próbne BA na symulatorze bronchoskopii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek BA
	<ol>
		<li>Przełóż bronchoskop w dół tchawicy i prawego oskrzela głównego do poziomu oskrzela pośredniego, tuż proksymalnie do podziału na prawy dolny i prawy środkowy płat. 
		UWAGA: Zazwyczaj pobieramy próbki z oskrzela pośredniego, chociaż można pobrać próbki z innych miejsc w drogach oddechowych. Obserwując cewnik i SAM, nie widać końcówki bronchoskopu. Obserwujemy następujące proste kroki dla BA, gdy bronchoskop dotrze do pożądanego miejsca pobierania próbek.</li>
		<li>KATATER W DÓŁ: Wprowadzić cewnik BA przez kanał operacyjny bronchoskopu, aż biała końcówka będzie widoczna w drogach oddechowych, maksymalnie 1 cm dystalnie do końca bronchoskopu. Trzymaj bronchoskop i końcówkę cewnika pośrodku światła dróg oddechowych. Należy uważać, aby zminimalizować kontakt między końcówką cewnika a błoną śluzową oskrzeli, aby zmniejszyć ryzyko otarcia błony śluzowej.</li>
		<li>SAM OUT: Wciśnij uchwyt urządzenia BA tak, aby SAM został wytłoczony w świetle prawych środkowych lub prawych dolnych dróg oddechowych. W bezpośrednim widzeniu zegnij końcówkę bronchoskopu, aby upewnić się, że SAM styka się z MLF na ścianie dróg oddechowych. Pozostaw SAM w drogach oddechowych, płasko do ściany błony śluzowej na 30 sekund.</li>
		<li>SAM IN: Spójrz przez bronchoskop, aby upewnić się, że wilgotna sonda SAM jest prosta i nie jest wygięta z powrotem nad końcem cewnika. W razie potrzeby cewnik i końcówkę bronchoskopu można przyłożyć z powrotem, aby wyprostować SAM. W przypadku bezpośredniego widzenia delikatnie wsuń prosty SAM z powrotem do cewnika. 
		UWAGA: Jeśli wystąpią trudności z wciągnięciem SAM z powrotem do cewnika, należy wyjąć całe urządzenie z SAM wyciśniętym z powrotem z dróg oddechowych.</li>
		<li>KABINA GÓRNA: Wyjmij cały cewnik z kanału operacyjnego bronchoskopu.</li>
		<li>ODETNIJ SAM: SAM jest odcinany sterylnymi nożyczkami, a następnie umieszczany w kriotubie na lodzie. Próbki te mogą być przetwarzane różnymi metodami, jak opisano w dalszej części niniejszego protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie próbek NA i BA
Uwaga: Istnieje wiele opcji laboratoryjnego przetwarzania próbek pochodzących z NA i BA. Protokoły te mają na celu przechowywanie próbek do późniejszego wykorzystania i elucję próbki MLF z SAM.
<ol>
	<li>Opcje natychmiastowego postępowania z próbkami NA i BA
	<ol>
		<li>Opcja 1: Przechowuj wilgotny SAM na lodzie przez kilka godzin przed dalszym przetwarzaniem.</li>
		<li>Opcja 2: Natychmiast głęboko zamrozić NA SAM w probówce zbiorczej. Podobnie, zamrozić BA SAM w fiolkach kriogenicznych po wyjęciu nożyczkami z urządzenia do pobierania próbek.</li>
		<li>Opcja 3: Umieścić odłączony SAM w buforze elucyjnym (300 μl) przed bezpośrednim przetwarzaniem lub głębokim zamrożeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcje buforu elucyjnego dla próbek NA i BA 
	nuta: Wybór buforu elucyjnego zależy od tego, co ma być analizowane w próbce MLF i sugerujemy cztery główne alternatywy:
	<ol>
		<li>Należy użyć wstępnie przygotowanego buforu testowego odpowiedniego do procedur testów immunologicznych. Takie powinny zawierać niewielką ilość detergentu (0,05%), a także białko, np. albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 1%.</li>
		<li>Alternatywnie należy użyć buforu zawierającego większą ilość detergentu, aby doszło do lizy komórek. 
		nuta: Stosujemy zawierające Triton-X lub NP40 w stężeniu 1%. Butory do lizy komórek umożliwiają elucję zarówno cytokin wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych z SAM i generalnie powodują wyższe poziomy cytokin i chemokin. Bufor ten powinien również zawierać białko i jest uzupełniony o BSA do 1%.</li>
		<li>W przypadku pomiarów RNA, takich jak ilościowy PCR wirusowego RNA lub pomiar RNA gospodarza, należy dodać bufor do ekstrakcji RNA bezpośrednio do wilgotnego SAM. 
		nuta: Buzy do ekstrakcji chaotropowego RNA zawierają guanidynę, która denaturuje białka. Alternatywą jest dodanie buforu do ekstrakcji RNA do eluowanego płynu MLF zawartego w teście immunologicznym lub buforze do lizy komórek.</li>
		<li>Rozpuszczalniki organiczne, takie jak kwas trifluorooctowy, należy stosować do ekstrakcji lipidów i metabolitów w celu oceny metodą spektrometrii mas. 
		nuta: Szczegółowe informacje na temat wszystkich tych odczynników znajdują się w sekcji Materiały.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Technika elucji
	<ol>
		<li>W przypadku którejkolwiek z powyższych technik elucji należy umieścić SAM w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml wraz z żądanym buforem ekstrakcyjnym.</li>
		<li>Wirowo mieszaj próbkę przez 30 sekund, aby zmyć SAM z luźno przyczepionych płynów i biomolekuł.</li>
		<li>Aby zapewnić pełne odzysk próbki, należy przeprowadzić elucję odśrodkową, dodając wilgotny SAM do minikolumny z filtrem wirowym, którą wkłada się do tej samej probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml, która służy do mycia. 
		nuta: Można zastosować dwa rodzaje minikolumn z filtrem wirowym. Pierwsza zawiera tylko plastikową siatkę, która utrzymuje SAM na miejscu, umożliwiając pełną elucję płynów. Alternatywnie, jeśli pracujesz z materiałami zakaźnymi, użyj filtrów wirowych o wielkości porów 0,22 μm. Filtry te sterylizują próbki i nadają się do próbek z podejrzeniem infekcji prątkami. Jednak filtry te powinny być wstępnie inkubowane z buforem, aby zminimalizować wiązanie mediatorów z filtrem przez niespecyficzne interakcje.</li>
		<li>Użyj wysterylizowanych kleszczyków, aby przenieść wilgotny SAM do filtra wirowego. Zmieniaj kleszcze między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
		<li>Odwirować próbki przez 20 minut przy 16 000 x g w miniwirówce schłodzonej do temperatury 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podsumowanie przykładowy protokół
	<ol>
		<li>W laboratorium oznaczyć 2 ml mikroprobówek wirówkowych do pobrania próbki i dodać żądaną objętość buforu elucyjnego (zwykle 300 μl dla NA; 100 μL dla BA). Zamknij pokrywkę i umieść na lodzie.</li>
		<li>Po pobraniu próbek (natychmiast lub w laboratorium) SAM jest usuwany z uchwytu za pomocą kleszczy i umieszczany w probówce zawierającej bufor (wyprodukowanej w poprzednim etapie). Upewnij się, że nakrętka probówki mikrowirówki jest dobrze zamknięta i przenieś próbki na lodzie do laboratorium w celu dalszego przetwarzania.</li>
		<li>Wyjąć probówki zawierające SAM i bufor elucyjny z pojemnika transferowego i mieszać wirowo przez 30 s.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków usuń SAM i umieść w kolumnie wirowej (z filtrem z octanu celulozy 0,22 μm lub bez).</li>
		<li>Zebrać bufor elucyjny z probówki zbiorczej i zachować.</li>
		<li>Umieścić kolumnę wirową z SAM w oryginalnej probówce zbiorczej (lub nowej, jeśli próbki są sterylnie filtrowane) i dodać bufor do zbierania do kolumny wirowej. W ten sposób płyn płuczący przejdzie przez kolumnę wirową z powrotem do probówki zbiorczej, pomagając w wymyciu próbki z SAM.</li>
		<li>Odwirować próbki z zamkniętymi pokrywkami (16 000 x g, 20 min, 4 °C).</li>
		<li>Wyjmij próbki z wirówki i umieść je w stojaku.</li>
		<li>Otwórz szczelną pokrywę probówek i wyjmij kolumnę wirującą zawierającą SAM. Wyrzuć SAM i kolumnę wirującą do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
		<li>Ostrożnie podwielokrotnić eluat zawarty w probówce do oznakowanych probówek kriogenicznych. Zanotować całkowitą objętość eluatu i objętość w każdej podwielokrotności.</li>
		<li>Przenieś zamknięte probówki kriogeniczne do zamrażarki o temperaturze -80°C i przechowuj w pozycji pionowej do czasu użycia. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyniki uzyskane przy użyciu istniejących technik pobierania próbek z dróg oddechowych uważa się za bardzo zmienne; Do standaryzacji badań wtej dziedzinie potrzebne są alternatywne techniki doboru próby5. NA i BA pozwalają na pobieranie próbek MLF w sposób nieinwazyjny i mają ekscytujący potencjał do pomiaru odpowiedzi immunologicznych w zdrowych i chorych drogach oddechowych. Techniki te oferują wiele potencjalnych zalet w porównaniu z istniejącymi technikami, w tym większą tolerancję, szybkość pobierania próbek, możliwość częstego powtarzania próbkowania, mniejszą zmienność między użytkownikami i zmniejszone rozcieńczenie mediatorów immunologicznych5. Czas trwania absorpcji i zastosowana technika przetwarzania powinny być zoptymalizowane dla każdego badania i rygorystycznie utrzymywane między zdarzeniami pobierania próbek. Dodatkowo, w przypadku BA, miejsce pobrania próbki w drogach oddechowych powinno być dokładnie odtworzone u różnych osób.
NA, a w szczególności BA, są wciąż stosunkowo nowymi technikami badań klinicznych. Jednak korzyści płynące z tych technik zaowocowały ich zastosowaniem w licznych badaniach, w tym staranną walidacją w odniesieniu do technik alternatywnych5. Urządzenia te są obecnie dostępne jako urządzenia z oznaczeniem CE, gotowe do powszechnego stosowania w badaniach nad układem oddechowym. Podczas gdy NA i BA skutkują znacznie mniejszymi objętościami próbek niż alternatywne techniki pobierania próbek, wyższe uzyskane stężenia mogą skutkować większą czułością dla mediatorów immunologicznych o niskiej liczebności.
W zależności od pożądanych zastosowań końcowych, próbki NA i BA mogą być bezpośrednio zamrażane w celu późniejszego przetworzenia, co zwiększa wykonalność badań w środowisku badań klinicznych. Protokół postępowania z próbkami może być również dostosowany do konkretnych zastosowań końcowych. Sugerowane techniki przetwarzania mogą być stosowane do zbierania białkowych lub lipidowych mediatorów immunologicznych lub kwasów nukleinowych, ale powinny być zoptymalizowane dla każdego badania. W szczególności MLF można eluować za pomocą różnych. Po pierwsze, bufor testu immunologicznego może być używany do pomiaru cytokin błony śluzowej, chemokin i przeciwciał 6,45. o wyższych poziomach detergentów mogą być również stosowane w celu zagwarantowania lizy komórek, co pozwala na włączenie cytokin wewnątrzkomórkowych. do ekstrakcji chaotropowego RNA powinny być używane do określania infekcji wirusowej, wiremii, mRNA gospodarza i mikrobiomu. Alternatywnie rozpuszczalniki organiczne mogą być stosowane w lipidomice i spektrometrii mas.
Podsumowując, bezpośrednie wchłanianie MLF z powierzchni błony śluzowej jest ekscytującą techniką o potencjalnym zastosowaniu w chorobach układu oddechowego, żołądkowo-jelitowego, moczowo-płciowego i innych chorobach błony śluzowej. Jednak te obiecujące techniki absorpcji będą wymagały precyzyjnej walidacji techniki pobierania próbek i przetwarzania dla poszczególnych testów (biomarkerów) w każdym środowisku chorobowym. Ponadto te nowatorskie techniki precyzyjnego pobierania próbek błony śluzowej będą wymagały walidacji w porównaniu z konwencjonalnymi próbkami, takimi jak krew, oddech i plwocina. Dzięki tym technikom MLF może być używany do pomiaru drobnoustrojów, cytokin, chemokin, prostanoidów i przeciwciał.

Większość chorób układu oddechowego powoduje reakcję zapalną i istnieje pilna potrzeba pobrania próbek z powierzchni błony śluzowej dróg oddechowych w alergicznym nieżycie nosa, infekcjach wirusowych i grzybiczych, gruźlicy, astmie, przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc, zwłóknieniu płuc i raku płuc <klasa sup="xref">1. Aspirat do nosogardzieli (NPA), płukanie nosa i płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) są powszechnymi technikami pobierania próbek z górnych i dolnych dróg oddechowych. Jednak techniki te stwarzają poważne problemy, w tym słabą tolerancję, rozcieńczenie mediatorów stanu zapalnego i niemożność częstego powtarzania pobierania próbek2. Jedną z alternatyw dla pobierania próbek NPA jest użycie wacików, nylonowych flokowanych, bawełnianych lub ze sztucznego jedwabiu3,4, ale mają one również ograniczenia, ponieważ powodują dyskomfort i uszkodzenie nabłonka nosa, a w niektórych przypadkach nieodwracalne wiązanie mediatorów stanu zapalnego5. Techniki te nie mogą być na ogół powtarzane seryjnie przez godzinę, a alternatywne techniki mogą być bardziej skuteczne w wykrywaniu cytokin i chemokin o niskiej liczebności5,6. Ponadto zmienność użytkowników związana z tymi technikami może generować niespójności w danych, co skutkuje koniecznością stosowania większych kohort pacjentów.
Alternatywnie, techniki absorpcji przy użyciu zarówno naturalnych, jak i syntetycznych gąbek zostały użyte do pobrania MLF z powierzchni błony śluzowej. Gąbki okulistyczne wykonane z naturalnej celulozy (np. Weck-cel) zostały użyte do pobierania próbek śliny, wydzieliny z szyjki macicy i pochwy7. Ponadto wykorzystano gąbki syntetyczne wykonane z alkoholu poliwinylowego (PVA) i hydroksylowanego polioctanu winylu (HPVA)8. Porównano siedem różnych materiałów absorpcyjnych do pobierania próbek płynu ustnego przed pomiarem przeciwciał9, podczas gdy mini-gąbki poliuretanowe zostały użyte do zbierania ludzkich łez10.
Bibuła filtracyjna składająca się z naturalnej celulozy pochodzącej z bawełny jest szeroko stosowana do wchłaniania wydzieliny z nosa od czasu pionierskiej pracy Alama i współpracowników w 1992 roku11,12,13,14,15,16,17. Krążki z bibuły filtracyjnej zostały wyprodukowane z kart filtracyjnych (np. Shandon) i zostały wykorzystane do pomiaru histaminy i cytokin po kontrolowanych prowokacjach alergenów w nosie i z naturalną ekspozycją na alergeny18,19,20,21. Jednak różne partie bibuły filtracyjnej różnią się stopniem wiązania białek, a niektóre nie uwalniają cytokin. W związku z tym opracowano metody wykorzystujące syntetyczną matrycę absorpcyjną (SAM)2,22,23. SAM są obecnie powszechnie używane do uzyskiwania MLF donosowego przez NA. Te chłonne materiały są wygodne w użyciu i mogą pozyskiwać MLF nawet z zapalenia nosa w częstych odstępach czasu przez dłuższy czas.
Absorpcja przez nos jest formą precyzyjnego pobierania próbek błony śluzowej za pomocą SAM do pobierania próbek MLF w górnych drogach oddechowych. Urządzenia NA są produkowane jako wyroby medyczne z oznaczeniem CE z materiałów klasy medycznej w pomieszczeniach czystych i są wolne od kurzu i alergenów. Próbnik NA składa się z uchwytu i SAM w sterylnej krioprobówce. SAM składa się z polimerów, zazwyczaj włókien, ale jest również dostępny w postaci pianki, a te są wybierane tak, aby były miękkie i chłonne, z szybkim odprowadzaniem wilgoci do pobierania próbek. SAM mają minimalne wiązanie z białkami, aby umożliwić skuteczne wymywanie wchłoniętych wydzielin. NA jest bardzo delikatną, nieinwazyjną techniką, którą można wykonywać na dawcach w każdym wieku. Ponadto możliwe jest próbkowanie szeregowe, nawet co kilka minut. NA został zweryfikowany pod kątem istniejących technik pobierania próbek z górnych dróg oddechowych5, a powtarzalne pobieranie próbek umożliwiło wygenerowanie danych kinetycznych po zbadaniu drogi oddechowej alergenem23,24,25, endotoksyna bakteryjna26 i agoniści TLR typu wirusowego (Jha, A. i wsp., rękopis w przygotowaniu). NA był również stosowany u niemowląt do badania naturalnej historii atopii 27,28,29 oraz w wirusowym zapaleniu oskrzelików30.
Bronchoskopowe mikropobieranie próbek (BMS) to procedura pobierania MLF w dolnych drogach oddechowych, która została opracowana przez Olympus31,32,33. Niestety, ten system BMS jest licencjonowany tylko w Japonii. Olympus dostarcza dwa systemy BMS: jeden z sondą z hydroksylowanego poliestru włóknistego (FHPE)34,35,36,37, a drugi z sondą bawełnianą33,38,39,40,41,42,43. Główną przeszkodą było to, że sonda BMS stosowana u pacjentów z astmą powodowała krwawienie z błony śluzowej, przy czym połowa wszystkich próbek była zanieczyszczona krwią. Autorzy doszli do wniosku, że nie jest możliwe pobranie próbki MLF za pomocą tego systemu BMS z obwodowych dróg oddechowych u pacjentów z astmą43.
Jako alternatywę, opracowaliśmy BA za pomocą miękkiego SAM, który może być wykonywany podczas bronchoskopowego badania dolnych dróg oddechowych, w tym po eksperymentalnym zakażeniu osób z astmą rinowirusem6. Urządzenie BA składa się z: zewnętrznego pustego cewnika, rękojeści, która po aktywacji wytłacza SAM, oraz centralnego plastikowego przewodu prowadzącego, który ma SAM na swoim końcu. Jeśli chodzi o NA, zestawy BA są produkowane z materiałów klasy medycznej w pomieszczeniach czystych i są wolne od kurzu i alergenów. Dodatkowo urządzenia są oznaczone znakiem CE i są dostarczane w stanie naświetlania promieniami gamma. Pasek SAM jest miękki, chłonny i ma szybkie odprowadzanie wilgoci do pobierania próbek. Ma również minimalne wiązanie z białkami, aby umożliwić skuteczne wymywanie wchłoniętych wydzielin. Urządzenie może zmieścić się w kanale roboczym bronchoskopu i może być używane do szybkiego i dokładnego pobierania próbek MLF w określonych miejscach zainteresowania w drogach oddechowych. W przeciwieństwie do BAL lub BMS, BA nie powoduje krwawienia kontaktowego ani dodatkowego dyskomfortu pacjenta po zabiegu.
Należy dokładnie rozważyć przetwarzanie próbek NA i BA. Próbki mogą być bezpośrednio zamrażane i przetwarzane partiami lub mogą być przetwarzane natychmiast. Rodzaj przetwarzania można dostosować do niektórych dalszych zastosowań, w tym testów immunologicznych dla cytokin, chemokin i immunoglobulin lub elucji RNA związanego z wirusem, bakteriami i komórkami gospodarza. Przedstawiamy kolekcję kliniczną i techniki przetwarzania laboratoryjnego związane z NA i BA jako przewodnik dla badaczy klinicznych.

<table><tbody><tr><td>Nasosorpcja (dla dorosłych, szerokość 7 mm)</td><td>Hunt Developments</td><td>NSFL-FXI-11</td><td>Dostępne są różne rozmiary dla różnych grup pacjentów/grup wiekowych.</td></tr><tr><td>Bronchosorpcja</td><td>Hunt Developments</td><td>BSFL-FXI-11</td><td>Minimalny rozmiar kanału bronchoskopu 2 mm; Maksymalna długość robocza 815mm</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar&nbsp; Spin-X&nbsp; filtry probówkowe wirówkowe (bez membrany)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS9301-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar&nbsp; Spin-X&nbsp; filtry probówkowe wirówkowe (membrana 0,22um)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160-24EA</td><td>Do sterylizacji próbek zagrożonych infekcją.</td></tr><tr><td>Bufor testowy (elucji)</td><td>Millipore</td><td>AB-33k</td><td>Nie wymieniony na stronie internetowej Millipore, ale dostępny za pośrednictwem zapytań lub ogólnych firm zajmujących się zaopatrzeniem laboratoriów, takich jak Cedarlane. Zawiera 0,05% Tween-20 i 1% BSA.</td></tr><tr><td>NP-40 Bufor do lizy komórek</td><td>Life Technologies</td><td>FNN0021</td><td>Dodaj albuminę surowicy bydlęcej do 1% (w/v). Może odzyskać wyższe bezwzględne poziomy mediatora.</td></tr><tr><td>Bufor RLT (ekstrakcja RNA)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Umożliwia odzyskiwanie RNA z próbek z nososorpcji i bronchosorpcji.</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML-M Do</td><td>elucji próbek do zastosowań HPLC</td></tr> do mikroprobówek wirówkowych <tr><td>o pojemności 2,0 ml</td><td>Do filtrów rurkowych Spin-X wymagane są probówki o pojemności 2,0 ml Costar 3213, tradycyjne probówki o pojemności 1,5 ml nie będą do nich pasować.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Metody wchłaniania przez nos (NA) i oskrzelowego (BA) wykorzystują syntetyczne matryce absorpcyjne (SAM) do wchłaniania płynu wyściełającego błonę śluzową (MLF) ludzkich dróg oddechowych. NA jest nieinwazyjną techniką, która wchłania płyn z małżowiny dolnej i powoduje minimalny dyskomfort. NA przyniósł powtarzalne wyniki z możliwością częstego powtarzania pobierania próbek z górnych dróg oddechowych. 
Dla porównania, alternatywne metody pobierania próbek błony śluzowej układu oddechowego, takie jak aspiracja nosogardzieli (NPA) i konwencjonalne pobieranie wymazów, są bardziej inwazyjne i mogą powodować większą zmienność danych. Inne metody mają ograniczenia, na przykład biopsje i zabiegi oskrzelowe są inwazyjne, plwocina zawiera wiele martwych i umierających komórek i wymaga upłynnienia, kondensat wydychanego powietrza (EBC) zawiera wodę i ślinę, a próbki płukania są rozcieńczone i zmienne.
BA można wykonać za pomocą kanału roboczego bronchoskopu w klinice. Pobieranie próbek jest dobrze tolerowane i może być przeprowadzane w wielu miejscach w drogach oddechowych. BA powoduje, że próbki MLF są mniej rozcieńczone niż próbki z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL).
Ten artykuł demonstruje techniki NA i BA, a także laboratoryjne przetwarzanie otrzymanych próbek, które można dostosować do pożądanego dalszego pomiaru biomarkera. Te techniki absorpcji są użyteczną alternatywą dla konwencjonalnych technik pobierania próbek stosowanych w klinicznych badaniach oddechowych.

NA była wykorzystywana w wielu badaniach do łatwego i nieinwazyjnego pomiaru stanu zapalnego błony śluzowej. Po podaniu alergenu do nosa można zaobserwować wzrost i spadek poziomu prostaglandyny D2 (PGD2) w ciągu kilku minut (Rysunek 1), co jest zgodne z degranulacją komórek tucznych (Thwaites et al., rękopis w przygotowaniu). Ponadto w godzinach następujących po ekspozycji nosa na alergen można mierzyć mediatory stanu zapalnego typu II, takie jak IL-5 (Rysunek 2, przedrukowano za zgodą 24)23,24. W eksperymentalnej infekcji osób z astmą alergiczną i zdrowych kontroli NA została użyta do pomiaru panelu mediatorów, w tym interferonu gamma (IFN-γ), w ciągu 7 dni (Rysunek 3, przedrukowano za zgodą 6). Dodatkowo, w przypadku naturalnej infekcji wirusem RSV (respiratory syncytial virus) u niemowląt, NA wykazała, że RSV wiąże się z podwyższonymi poziomami cytokin prozapalnych, takich jak IFN-γ, w porównaniu z niemowlętami z zapaleniem oskrzelików bez RSV oraz zdrowymi kontrolami (Rysunek 4, przedrukowano za zgodą 30). Co ciekawe, rozróżnienie to między zapaleniem oskrzelików z RSV a bez RSV nie było istotne w próbkach NPA pobranych w tym samym czasie (Rysunek 4).
BA zastosowano również podczas eksperymentalnej infekcji rinowirusem u pacjentów z astmą alergiczną. W 4. dniu infekcji rinowirusem poziomy IFN-γ, CXCL1, IL-10 i IL-5 były podwyższone w stosunku do wartości wyjściowych (Rycina 5; odpowiednio A, B, C i D). Dodatkowo technika ta wykazała podwyższone poziomy IL-5 w dolnych drogach oddechowych pacjentów z astmą alergiczną podczas infekcji rinowirusem w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (Rycina 5D)(Rycina 5 przedrukowana za zgodą 6).
Te reprezentatywne wyniki uzyskano z próbek eluowanych przy użyciu buforu do analizy zawierającego 0,05% Tween-20 oraz 1% BSA (patrz Tabela materiałów).
<img alt="Wykres stężenia PGD2 w funkcji czasu; analiza danych dotycząca szczytów wydzielania hormonów; wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Szybka generacja i eliminacja prostaglandyny D2 po donosowym podaniu alergenu. Poziomy prostaglandyny D2 (PGD2) zmierzone w eluatach z wchłaniania nosowego w próbkach seryjnych po prowokacji nosowej alergenem w postaci pyłku traw owncej (n=5). Każda linia reprezentuje dane od jednej osoby. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Poziomy IL-5 w czasie po NAC; wykres zależności stężenia od czasu; analiza cytokin; naniesiono słupki błędów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Pomiar kinetyki IL-5 po donosowej prowokacji alergenowej. Produkcja IL-5 w seryjnych próbkach absorpcji z nosa po prowokacji alergenowej z drogą nosową. Przeprowadzono trzy powtórne badania prowokacji alergenowej, w których uczestnicy (n=19) otrzymali placebo (kolor niebieski), niską dawkę (10 mg) doustnego prednizonu (kolor pomarańczowy) lub wysoką dawkę (25 mg) doustnego prednizonu (kolor czerwony) na godzinę przed podaniem alergenu. Linie oznaczają średnią geometryczną, a słupki błędów przedstawiają 95-procentowe przedziały ufności dla wszystkich uczestników. (Rycina przedrukowana za zgodą Leakera) i inni, Immunologia Błon śluzowych, 2017). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wyniki ekspresji IFN-γ; wykresy przedstawiające poziomy cytokin w czasie; analiza danych eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3Indukcja interferonu-γ podczas infekcji rinowirusami. Podczas próby zakażenia zdrowych dorosłych (n=1, kolor niebieski) oraz osób z astmą alergiczną (n=28, kolor czerwony) rynowirusem 16 (rhinovirus-16), do pomiaru poziomów interferonu-γ (IFN-γ) zastosowano próbkowanie absorpcyjne z jamy nosowej. Dane przedstawiono jako A) surowe wykresy spaghetti dla poszczególnych osób oraz B) poziomy median z paskami błędów oznaczającymi rozstęp międzykwartylowy. (Rycina przedrukowana za zgodą Hansela) i wsp.6). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy stężenia IFN-γ; badanie RSV; metody nasosorpcyjna i NPA; analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4Nasosorpcja różnicuje podwyższony poziom interferonu-γ związany z zakażeniem RSV u niemowląt. Do pomiaru poziomu interferonu-γ u niemowląt z zapaleniem oskrzelek związanym z zakażeniem wirusem RSV (kolor czerwony, n=12), innym patogenem oddechowym niż RSV (kolor zielony, n=12) oraz w grupie kontrolnej osób zdrowych (kolor niebieski, n=9) wykorzystano absorpcjęy z nosa oraz aspirację nosogardzielną (NPA). Dane analizowano za pomocą testu Kruskalla-Wallisa z korektą Dunna dla wielokrotnych porównań (***p&lt;0,01). Linie oznaczają wartości mediany, a słupki błędów zakresy międzykwartylne. (Rysunek zmodyfikowano za zgodą Thwaites) i wsp.30). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres odpowiedzi cytokinowej porównujący poziomy IFN-γ, CXCL1, IL-10 oraz IL-5 w stanie wyjściowym i w etapach infekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5Mediatory stanu zapalnego w próbkach aspiratu oskrzelowego podczas infekcji rynowirusami. 
Po zakażeniu rhinovirusem-16 zdrowych osób kontrolnych (n=10, kolor niebieski) oraz ochotników z astmą alergiczną (n=23, kolor czerwony), zastosowano absorpcję oskrzelową w celu pomiaru poziomu A) IFN-γ, B) CXCL1, C) IL-10 oraz D) IL-5 w punkcie wyjściowym i w 4. dniu zakażenia. Dane analizowano za pomocą testu poziomów znakowanych Wilcoxona (próbki sparowane) oraz testu Manna-Whitneya (próbki niesparowane). Rysunek przedrukowano za zgodą Hansela i inni6 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Ten manuskrypt opisuje użycie technik wchłaniania przez nos i oskrzela, w szczególności przy użyciu syntetycznych matryc absorpcyjnych (SAM) do pobierania próbek płynu wyściełającego błonę śluzową (MLF) górnych i dolnych dróg oddechowych. Metody te zapewniają lepszą standaryzację i tolerancję niż istniejące techniki pobierania próbek z układu oddechowego.

Absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Dzisiaj zademonstrujemy technikę nososorpcji, formę precyzyjnego pobierania próbek błony śluzowej przy użyciu syntetycznej matrycy absorpcyjnej do wchłaniania płynu z błony śluzowej. Próbnik nososorpcyjny składa się z uchwytu i SAM w sterylnej krioprobówce. SAM składa się z polimerów, włókien lub pianki, i jest specjalnie dobrany tak, aby był miękki i chłonny, z szybkim odprowadzaniem wilgoci w celu pobrania próbki.SAM mają również minimalne wiązanie z białkami, aby umożliwić skuteczną eliminację wchłoniętych wydzielin. Nasosorpcja jest bardzo delikatną, nieinwazyjną techniką, którą można wykonywać u pacjentów w każdym wieku, w tym u niemowląt. Ponadto możliwe jest próbkowanie szeregowe, nawet co kilka minut.Podczas wykonywania nososorpcji należy najpierw umyć ręce i założyć rękawiczki, najlepiej w obecności pacjenta. Najpierw sprawdzana jest jama nosowa. Zalecamy użycie latarki czołowej i użycie przez lekarza niedominującego kciuka do cofnięcia nosa pacjenta w celu uwidocznienia jamy nosowej.Wziernik do nosa zwykle nie jest wymagany. Jeśli spojrzysz do jamy nosowej, nozdrza lub nozdrza nie są okrągłe w przekroju i biegną prosto do tyłu. Na ogół widzisz małżowinę dolną jako wybrzuszenie, wgłębienie na bocznej ścianie nozdrza, z przegrodą nosową tworzącą gładką, płaską ścianę przyśrodkową.Chcemy pobrać próbkę z tej małżowin nosowych, ponieważ leżący pod spodem nabłonek jest prostym nabłonkiem rzęskowym dróg oddechowych. Podczas pobierania próbek, SAM z nosa jest delikatnie przesuwany w górę światła, ustawiając go tak, aby był płasko przylegający do dolnej małżowiny. Następnie palcem wskazującym dociśnij SAM do błony śluzowej nosa.Może to powodować lekkie łaskotanie z możliwym łzawieniem oczu podczas wchłaniania MLF. Zazwyczaj używamy 60-sekundowej absorpcji w czasie. Urządzenie do nososorpcji jest następnie wyjmowane z nozdrza, wkładane z powrotem do krioprobówki i może być natychmiast przechowywane na lodzie, a następnie głęboko mrożone.Alternatywnie można natychmiast przystąpić do elucji MLF. Sorpcja nosa jest badana w różnych modelach prowokacji błony śluzowej nosa, a także w różnych chorobach dróg oddechowych. Jednak ta stosunkowo nowa metoda nadal wymaga formalnej walidacji w porównaniu z innymi metodami pobierania próbek z układu oddechowego.Technika bronchosorpcji wykorzystuje syntetyczną matrycę absorpcyjną do pobierania próbki płynu wyściełającego błonę śluzową oskrzeli. Metoda wykonywana jest przez wyspecjalizowany personel za pomocą bronchoskopu światłowodowego. Urządzenie do bronchosorpcji składa się z zewnętrznego pustego cewnika z centralnym plastikowym prowadnikiem.Na końcu znajduje się SAM, który można wytłoczyć po aktywacji rękojeści. Podobnie jak nasosorpcja, pasek SAM jest miękki i chłonny z szybkim odprowadzaniem wilgoci podczas pobierania próbki. Ma również minimalne wiązanie z białkami, aby umożliwić skuteczne wymywanie wchłoniętych wydzielin.Przed umieszczeniem urządzenia do bronchosorpcji w bronchoskopie zwykle należy sprawdzić, czy SAM z łatwością wytłacza się i wycofuje z powrotem do cewnika. Zademonstrujemy teraz metodę bronchosorpcji za pomocą symulatora bronchoskopii. Najpierw wykonuje się standardową bronchoskopię, przechodząc bronchoskopem w dół tchawicy, do prawego oskrzela głównego i na poziom oskrzela pośredniego tuż proksymalnie do podziału prawego dolnego i prawego środkowego płata.Po włożeniu do tego poziomu należy wykonać pięć kroków. Jeden, cewnik w dół. Wprowadzić cewnik bronchosorpcyjny przez kanał operacyjny bronchoskopu, aż biała końcówka będzie widoczna w drogach oddechowych maksymalnie na jeden centymetr dystalnie do końca bronchoskopu.Trzymaj bronchoskop i końcówkę cewnika pośrodku światła dróg oddechowych. Należy uważać, aby zminimalizować kontakt końcówki cewnika z błoną śluzową oskrzeli, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia błony śluzowej. Dwa, SAM na zewnątrz.Wcisnąć uchwyt urządzenia do bronchosorpcji tak, aby pasek SAM został wytłoczony w świetle prawej środkowej lub prawej dolnej drogi oddechowej płata. W bezpośrednim widzeniu zegnij końcówkę bronchoskopu, aby upewnić się, że SAM styka się z płynem wyściełającym błonę śluzową na ścianie dróg oddechowych. Pozostaw pasek SAM w drogach oddechowych, płasko do ściany błony śluzowej na 30 sekund.Trzy, SAM w. W przypadku bezpośredniego widzenia cofnij SAM bezpośrednio z powrotem do cewnika. Podczas chowania upewnij się, że wilgotna sonda SAM jest prosta.W razie potrzeby cewnik i końcówkę bronchoskopu można przynieść, aby wyprostować SAM. Jeśli wystąpią trudności z wycofaniem SAM, wyjmij całe urządzenie z SAM wysuniętym z powrotem z dróg oddechowych. Cztery, cewnik do góry.Wyjmij cały cewnik z kanału operacyjnego bronchoskopu. Pięć, odetnij SAM. SAM odcina się sterylnymi nożyczkami, umieszcza w krioprobówce i należy go natychmiast umieścić na lodzie przed głębokim zamrożeniem lub bezpośrednią elucją.Poniższy klip wideo pokazuje wytłaczanie SAM do dróg oddechowych pacjenta poddawanego bronchoskopii badawczej. Bronchosorpcja jest obecnie badana w wielu różnych chorobach płuc. Mamy nadzieję, że ta metoda precyzyjnego pobierania próbek błony śluzowej okaże się przydatna w diagnostyce oraz stratyfikacji i monitorowaniu pacjentów.Przetwarzanie laboratoryjne Po nososorpcji i bronchosorpcji. Elucja płynu wyściełającego błonę śluzową z syntetycznej matrycy absorpcyjnej. Dzisiaj przedstawimy ogólne zasady przetwarzania próbek laboratoryjnych po nieinwazyjnych technikach pobierania próbek błony śluzowej nosa i bronchosorpcji.W szczególności pokażemy, w jaki sposób eluujemy próbkę płynu wyściełającego błonę śluzową z syntetycznej matrycy absorpcyjnej. W miejscu pobierania próbki należy umieścić na lodzie w celu przetransportowania do laboratorium. Próbki mogą być przetwarzane natychmiast lub mogą być umieszczane bezpośrednio w głębokim zamrażaniu w oryginalnej probówce z próbką w celu wyelowania w późniejszym terminie.Jeżeli przeprowadzane jest natychmiastowe przetwarzanie, próbkę można przenieść na lodzie do laboratorium w oryginalnej probówce z próbką. Lub SAM można odłączyć i umieścić w buforze elucyjnym w miejscu pobrania, a następnie przenieść na lodzie do laboratorium. Próbki mogą pozostawać na lodzie w buforze lub w probówce z próbkami przez kilka godzin przed przetworzeniem.Etap płukania przed odwirowaniem i odwirowaniem elucji SAM ma na celu optymalizację wydajności próbki. Aby to osiągnąć, SAM jest wkładany do rurki Eppendorfa wraz z żądanym urządzeniem do ekstrakcji. Próbka jest następnie mieszana w mieszalniku wirowym przez 30 sekund w celu wypłukania SAM z luźno przyczepionych płynów i biomolekuł.Aby zapewnić pełne odzyskanie próbki, przeprowadza się elucję wirową poprzez dodanie wilgotnego SAM do wkładki wirowej wewnątrz tej samej probówki Eppendorfa, która jest używana do mycia. Do tej procedury należy używać czystych kleszczy, które należy wymieniać między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Ta metoda wykorzystuje wirowanie do ekstrakcji płynu z SAM.Próbki odwirowujemy przez 20 minut w temperaturze 16 000 g w wirówce schłodzonej do czterech stopni Celsjusza. Zastosowany robak elucji zostanie określony przez pożądaną aplikację. Powszechnie używamy buforu do oznaczania aminokwasów zawierających białka lub buforu do lizy RNA.Można stosować dwa rodzaje filtrów wirowych. Pierwsza zawiera tylko plastikową siatkę, która utrzymuje SAM na miejscu, umożliwiając pełną elucję płynów. Alternatywnie, w przypadku pracy z materiałami zakaźnymi, można zastosować filtry wirowe o wielkości porów 0,2 mikrometra.Filtry te odkażają zakażone próbki i są odpowiednie dla próbek z podejrzeniem infekcji mikrobakteryjnej. Jeśli takie filtry są wymagane, ważne jest, aby uwzględnić etap wstępnej inkubacji, w którym bufor białkowy może przeniknąć przez filtr przed dodaniem próbki. Ten etap minimalizuje wiązanie mediatorów z filtrem przez niespecyficzną absorpcję białka.Poniżej znajduje się przykładowa metoda stosowana przez nasze laboratorium do przetwarzania nososorpcji i bronchosorpcji próbek niewymagających etapu dekontaminacji, w tym patogenów klasy drugiej. Krok pierwszy, SAM jest umieszczany w Eppendorfie zawierającym odpowiedni bufor i wir na 30 sekund. Do nososorpcji używamy zwykle 300 mikrolitrów buforu, a do bronchosorpcji 100 mikrolitrów.Krok drugi, SAM jest usuwany za pomocą kleszczy i umieszczany w plastikowym siatkowym kubku filtracyjnym wraz z buforem używanym do mycia SAM. Krok trzeci, plastikowy kubek filtra siatkowego zawierający SAM jest zwracany do oryginalnego Eppendorfa. Krok czwarty, Eppendorf zawierający kubek filtracyjny, bufor i SAM jest odwirowywany przez 20 minut w temperaturze 16 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu kubek filtracyjny zawierający SAM jest usuwany i usuwany. Elucję można następnie podzielić na porcje i głęboko zamrozić w celu analizy w późniejszym czasie. Pobieranie próbek z nososorpcji zostało zastosowane w wielu klinicznych badaniach układu oddechowego.Obejmuje to pomiary mediatorów stanu zapalnego podczas prowokacji alergenami w nosie, takich jak prostaglandyna D2 i interleukina 5. Co ważne w tych modelach wyzwań, pobieranie próbek za pomocą nososorpcji umożliwia częste profilowanie kinetyczne poziomów mediatorów, gdzie pobieranie próbek może być powtarzane co kilka minut. Nasosorpcja była również stosowana podczas prowokacji infekcją rinowirusem u zdrowych osób i alergicznych astmatyków, gdzie nasosorpcja była powtarzana codziennie w okresie badania.Zastosowanie nososorpcji w badaniu pozwoliło na czułą charakterystykę odpowiedzi interferonu na zakażenie rinowirusem. Na koniec wykorzystaliśmy pobieranie próbek z nososorpcji do badania niemowląt z zapaleniem oskrzelików. W tym badaniu zakażenie syncytialnym wirusem oddechowym wiązało się z wyższymi poziomami mediatorów stanu zapalnego, takich jak interferon gamma.Co ważne, pobieranie próbek z wykorzystaniem nososorpcji pozwala na włączenie zdrowej grupy kontrolnej do badań na niemowlętach. Bronchosorpcję stosowano również w badaniu prowokacyjnym rinowirusa u zdrowych ochotników i astmatyków alergicznych. Badanie to wykazało znaczny wzrost mediatorów stanu zapalnego interferonu gamma, ITAC, IL-10 i IL-5 w dolnych drogach oddechowych podczas infekcji rinowirusem.Włączenie tej techniki do badań dolnych dróg oddechowych stwarza możliwość pomiaru poziomów mediatorów, które mogą być niewykrywalne konwencjonalnymi metodami, takimi jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe. Podsumowując, płyn z błony śluzowej można uzyskać nieinwazyjnie i ma ekscytujący potencjał do pomiaru reakcji zapalnych w infekcjach i stanach zapalnych. Metody elucji muszą być dostosowane do rodzaju próbek i parametrów, które mają być mierzone.W szczególności MLF może być stosowany do pomiaru cytokin i chemokin błony śluzowej, infekcji wirusowych, wiremii, infekcji bakteryjnych i grzybiczych oraz mikrobiomu i przeciwciał błony śluzowej. Wreszcie, metody pobierania próbek i elucji błony śluzowej będą wymagały dostosowanego opracowania i starannej walidacji dla poszczególnych projektów.

absorption-nasal-bronchial-fluids-precision-sampling-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje oddzielanie neutrofili od wydzielin tchawicy za pomocą urządzenia mikroprzepływowego ze spiralnymi kanałami. Urządzenie osiąga wydajną separację w zależności od wielkości komórki dzięki wykorzystaniu różnych grubości i kanałów w kształcie trapezu. Wzajemne oddziaływanie sił powoduje, że duże neutrofile gromadzą się w pobliżu ściany wewnętrznej, podczas gdy erytrocyty i agregaty mucyny pozostają w pobliżu ściany zewnętrznej, zapewniając skuteczną separację neutrofili.

Bezznacznikowa separacja neutrofili od wydzieliny tchawicy za pomocą spiralnego kanału mikroprzepływowego

Ten film pokazuje ilościowe określenie poziomów mediatorów immunologicznych w ekstrakcie z błony śluzowej nosa u noworodków. System testów multipleksowych oparty na elektrochemiluminescencji mierzy te mediatory, oceniając intensywność emitowanego światła, gdy są one wzbudzone.

Kwantyfikacja poziomów mediatorów immunologicznych w płynie z błony śluzowej człowieka

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Ten artykuł opisuje techniki bronchoskopowe w płucach bydlęcych w warunkach eksperymentalnych, tj. inokulację pod kontrolą bronchoskopową, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, szczotkowanie oskrzeli i przezoskrzelową biopsję płuc.

Płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo

Ten protokół opisuje nieinwazyjną technikę pobierania próbek nienaruszonego płynu z błony śluzowej z górnych dróg oddechowych. Może być stosowany do ilościowego oznaczania in vivo poziomów mediatorów białkowych, takich jak cytokiny i chemokiny, u osób w każdym wieku.

Nieinwazyjne pobieranie próbek płynu wyściełającego błonę śluzową w celu ilościowego określenia in vivo poziomów mediatorów immunologicznych w górnych drogach oddechowych

Tutaj opisujemy technikę indukcji plwociny. Protokół ten wyjaśnia również przetwarzanie plwociny w celu przeprowadzenia różnicowej liczby komórek oraz pobrania supernatantu plwociny i komórek do dalszej analizy.

Metodologia indukcji plwociny i przetwarzania laboratoryjnego

W tym badaniu demonstrujemy metodę separacji neutrofili bez znaczników z klinicznych wydzielin dróg oddechowych przy użyciu zamkniętej pętli spiralnej inercyjnej mikrofluidyki. Proponowana metoda rozszerzyłaby kliniczne testy in vitro dla różnych chorób układu oddechowego.

Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej

Aby zagwarantować skuteczną i wysokiej jakości analizę funkcjonalną rzęsek w celu diagnozy PCD, niezbędna jest precyzyjna i staranna metoda pobierania i przetwarzania nabłonka oddechowego. Aby kontynuować świadczenie usług diagnostycznych w kierunku PCD podczas pandemii COVID-19, protokół wideomikroskopii rzęskowej został zaktualizowany w celu uwzględnienia odpowiednich środków kontroli zakażeń.

Pobieranie próbek i przetwarzanie szczotkowania nosa za pomocą cyfrowej wideomikroskopii rzęskowej o dużej prędkości – adaptacja do pandemii COVID-19

Ten protokół opisuje zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie komórek nabłonka nosa do organotypowych modeli komórek nabłonka dróg oddechowych oraz kwantyfikację częstotliwości uderzeń rzęsek za pomocą obrazowania żywych komórek i niestandardowych skryptów.

Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę unikania zanieczyszczenia krwi mysim płynem do płukania nosa (NLF). Ponieważ metoda ta zapewnia pobranie NLF bez zanieczyszczenia krwi, pozwala na dokładniejsze wykrywanie składników immunologicznych i różnych patogenów układu oddechowego.

Pobieranie płynu do płukania nosa dla myszy bez zanieczyszczenia krwi

Poznaj techniki nasosorpcji i bronchosorpcji do pobierania płynu z błony śluzowej dróg oddechowych z użyciem syntetycznych matryc sorpcyjnych. Metody te umożliwiają standaryzowane i tolerowane pobieranie próbek w badaniach klinicznych.

Absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek (Wideo) | JoVE Journal

Absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek

Przeglądaj więcej filmów