Absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek

Dzisiaj zademonstrujemy technikę nososorpcji, formę precyzyjnego pobierania próbek błony śluzowej przy użyciu syntetycznej matrycy absorpcyjnej do wchłaniania płynu z błony śluzowej. Próbnik nososorpcyjny składa się z uchwytu i SAM w sterylnej krioprobówce. SAM składa się z polimerów, włókien lub pianki, i jest specjalnie dobrany tak, aby był miękki i chłonny, z szybkim odprowadzaniem wilgoci w celu pobrania próbki.

SAM mają również minimalne wiązanie z białkami, aby umożliwić skuteczną eliminację wchłoniętych wydzielin. Nasosorpcja jest bardzo delikatną, nieinwazyjną techniką, którą można wykonywać u pacjentów w każdym wieku, w tym u niemowląt. Ponadto możliwe jest próbkowanie szeregowe, nawet co kilka minut.

Podczas wykonywania nososorpcji należy najpierw umyć ręce i założyć rękawiczki, najlepiej w obecności pacjenta. Najpierw sprawdzana jest jama nosowa. Zalecamy użycie latarki czołowej i użycie przez lekarza niedominującego kciuka do cofnięcia nosa pacjenta w celu uwidocznienia jamy nosowej.

Wziernik do nosa zwykle nie jest wymagany. Jeśli spojrzysz do jamy nosowej, nozdrza lub nozdrza nie są okrągłe w przekroju i biegną prosto do tyłu. Na ogół widzisz małżowinę dolną jako wybrzuszenie, wgłębienie na bocznej ścianie nozdrza, z przegrodą nosową tworzącą gładką, płaską ścianę przyśrodkową.

Chcemy pobrać próbkę z tej małżowin nosowych, ponieważ leżący pod spodem nabłonek jest prostym nabłonkiem rzęskowym dróg oddechowych. Podczas pobierania próbek, SAM z nosa jest delikatnie przesuwany w górę światła, ustawiając go tak, aby był płasko przylegający do dolnej małżowiny. Następnie palcem wskazującym dociśnij SAM do błony śluzowej nosa.

Może to powodować lekkie łaskotanie z możliwym łzawieniem oczu podczas wchłaniania MLF. Zazwyczaj używamy 60-sekundowej absorpcji w czasie. Urządzenie do nososorpcji jest następnie wyjmowane z nozdrza, wkładane z powrotem do krioprobówki i może być natychmiast przechowywane na lodzie, a następnie głęboko mrożone.

Alternatywnie można natychmiast przystąpić do elucji MLF. Sorpcja nosa jest badana w różnych modelach prowokacji błony śluzowej nosa, a także w różnych chorobach dróg oddechowych. Jednak ta stosunkowo nowa metoda nadal wymaga formalnej walidacji w porównaniu z innymi metodami pobierania próbek z układu oddechowego.

Technika bronchosorpcji wykorzystuje syntetyczną matrycę absorpcyjną do pobierania próbki płynu wyściełającego błonę śluzową oskrzeli. Metoda wykonywana jest przez wyspecjalizowany personel za pomocą bronchoskopu światłowodowego. Urządzenie do bronchosorpcji składa się z zewnętrznego pustego cewnika z centralnym plastikowym prowadnikiem.

Na końcu znajduje się SAM, który można wytłoczyć po aktywacji rękojeści. Podobnie jak nasosorpcja, pasek SAM jest miękki i chłonny z szybkim odprowadzaniem wilgoci podczas pobierania próbki. Ma również minimalne wiązanie z białkami, aby umożliwić skuteczne wymywanie wchłoniętych wydzielin.

Przed umieszczeniem urządzenia do bronchosorpcji w bronchoskopie zwykle należy sprawdzić, czy SAM z łatwością wytłacza się i wycofuje z powrotem do cewnika. Zademonstrujemy teraz metodę bronchosorpcji za pomocą symulatora bronchoskopii. Najpierw wykonuje się standardową bronchoskopię, przechodząc bronchoskopem w dół tchawicy, do prawego oskrzela głównego i na poziom oskrzela pośredniego tuż proksymalnie do podziału prawego dolnego i prawego środkowego płata.

Po włożeniu do tego poziomu należy wykonać pięć kroków. Jeden, cewnik w dół. Wprowadzić cewnik bronchosorpcyjny przez kanał operacyjny bronchoskopu, aż biała końcówka będzie widoczna w drogach oddechowych maksymalnie na jeden centymetr dystalnie do końca bronchoskopu.

Trzymaj bronchoskop i końcówkę cewnika pośrodku światła dróg oddechowych. Należy uważać, aby zminimalizować kontakt końcówki cewnika z błoną śluzową oskrzeli, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia błony śluzowej. Dwa, SAM na zewnątrz.

Wcisnąć uchwyt urządzenia do bronchosorpcji tak, aby pasek SAM został wytłoczony w świetle prawej środkowej lub prawej dolnej drogi oddechowej płata. W bezpośrednim widzeniu zegnij końcówkę bronchoskopu, aby upewnić się, że SAM styka się z płynem wyściełającym błonę śluzową na ścianie dróg oddechowych. Pozostaw pasek SAM w drogach oddechowych, płasko do ściany błony śluzowej na 30 sekund.

Trzy, SAM w. W przypadku bezpośredniego widzenia cofnij SAM bezpośrednio z powrotem do cewnika. Podczas chowania upewnij się, że wilgotna sonda SAM jest prosta.

W razie potrzeby cewnik i końcówkę bronchoskopu można przynieść, aby wyprostować SAM. Jeśli wystąpią trudności z wycofaniem SAM, wyjmij całe urządzenie z SAM wysuniętym z powrotem z dróg oddechowych. Cztery, cewnik do góry.

Wyjmij cały cewnik z kanału operacyjnego bronchoskopu. Pięć, odetnij SAM. SAM odcina się sterylnymi nożyczkami, umieszcza w krioprobówce i należy go natychmiast umieścić na lodzie przed głębokim zamrożeniem lub bezpośrednią elucją.

Poniższy klip wideo pokazuje wytłaczanie SAM do dróg oddechowych pacjenta poddawanego bronchoskopii badawczej. Bronchosorpcja jest obecnie badana w wielu różnych chorobach płuc. Mamy nadzieję, że ta metoda precyzyjnego pobierania próbek błony śluzowej okaże się przydatna w diagnostyce oraz stratyfikacji i monitorowaniu pacjentów.

Przetwarzanie laboratoryjne Po nososorpcji i bronchosorpcji. Elucja płynu wyściełającego błonę śluzową z syntetycznej matrycy absorpcyjnej. Dzisiaj przedstawimy ogólne zasady przetwarzania próbek laboratoryjnych po nieinwazyjnych technikach pobierania próbek błony śluzowej nosa i bronchosorpcji.

W szczególności pokażemy, w jaki sposób eluujemy próbkę płynu wyściełającego błonę śluzową z syntetycznej matrycy absorpcyjnej. W miejscu pobierania próbki należy umieścić na lodzie w celu przetransportowania do laboratorium. Próbki mogą być przetwarzane natychmiast lub mogą być umieszczane bezpośrednio w głębokim zamrażaniu w oryginalnej probówce z próbką w celu wyelowania w późniejszym terminie.

Jeżeli przeprowadzane jest natychmiastowe przetwarzanie, próbkę można przenieść na lodzie do laboratorium w oryginalnej probówce z próbką. Lub SAM można odłączyć i umieścić w buforze elucyjnym w miejscu pobrania, a następnie przenieść na lodzie do laboratorium. Próbki mogą pozostawać na lodzie w buforze lub w probówce z próbkami przez kilka godzin przed przetworzeniem.

Etap płukania przed odwirowaniem i odwirowaniem elucji SAM ma na celu optymalizację wydajności próbki. Aby to osiągnąć, SAM jest wkładany do rurki Eppendorfa wraz z żądanym urządzeniem do ekstrakcji. Próbka jest następnie mieszana w mieszalniku wirowym przez 30 sekund w celu wypłukania SAM z luźno przyczepionych płynów i biomolekuł.

Aby zapewnić pełne odzyskanie próbki, przeprowadza się elucję wirową poprzez dodanie wilgotnego SAM do wkładki wirowej wewnątrz tej samej probówki Eppendorfa, która jest używana do mycia. Do tej procedury należy używać czystych kleszczy, które należy wymieniać między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Ta metoda wykorzystuje wirowanie do ekstrakcji płynu z SAM.

Próbki odwirowujemy przez 20 minut w temperaturze 16 000 g w wirówce schłodzonej do czterech stopni Celsjusza. Zastosowany robak elucji zostanie określony przez pożądaną aplikację. Powszechnie używamy buforu do oznaczania aminokwasów zawierających białka lub buforu do lizy RNA.

Można stosować dwa rodzaje filtrów wirowych. Pierwsza zawiera tylko plastikową siatkę, która utrzymuje SAM na miejscu, umożliwiając pełną elucję płynów. Alternatywnie, w przypadku pracy z materiałami zakaźnymi, można zastosować filtry wirowe o wielkości porów 0,2 mikrometra.

Filtry te odkażają zakażone próbki i są odpowiednie dla próbek z podejrzeniem infekcji mikrobakteryjnej. Jeśli takie filtry są wymagane, ważne jest, aby uwzględnić etap wstępnej inkubacji, w którym bufor białkowy może przeniknąć przez filtr przed dodaniem próbki. Ten etap minimalizuje wiązanie mediatorów z filtrem przez niespecyficzną absorpcję białka.

Poniżej znajduje się przykładowa metoda stosowana przez nasze laboratorium do przetwarzania nososorpcji i bronchosorpcji próbek niewymagających etapu dekontaminacji, w tym patogenów klasy drugiej. Krok pierwszy, SAM jest umieszczany w Eppendorfie zawierającym odpowiedni bufor i wir na 30 sekund. Do nososorpcji używamy zwykle 300 mikrolitrów buforu, a do bronchosorpcji 100 mikrolitrów.

Krok drugi, SAM jest usuwany za pomocą kleszczy i umieszczany w plastikowym siatkowym kubku filtracyjnym wraz z buforem używanym do mycia SAM. Krok trzeci, plastikowy kubek filtra siatkowego zawierający SAM jest zwracany do oryginalnego Eppendorfa. Krok czwarty, Eppendorf zawierający kubek filtracyjny, bufor i SAM jest odwirowywany przez 20 minut w temperaturze 16 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu kubek filtracyjny zawierający SAM jest usuwany i usuwany. Elucję można następnie podzielić na porcje i głęboko zamrozić w celu analizy w późniejszym czasie. Pobieranie próbek z nososorpcji zostało zastosowane w wielu klinicznych badaniach układu oddechowego.

Obejmuje to pomiary mediatorów stanu zapalnego podczas prowokacji alergenami w nosie, takich jak prostaglandyna D2 i interleukina 5. Co ważne w tych modelach wyzwań, pobieranie próbek za pomocą nososorpcji umożliwia częste profilowanie kinetyczne poziomów mediatorów, gdzie pobieranie próbek może być powtarzane co kilka minut. Nasosorpcja była również stosowana podczas prowokacji infekcją rinowirusem u zdrowych osób i alergicznych astmatyków, gdzie nasosorpcja była powtarzana codziennie w okresie badania.

Zastosowanie nososorpcji w badaniu pozwoliło na czułą charakterystykę odpowiedzi interferonu na zakażenie rinowirusem. Na koniec wykorzystaliśmy pobieranie próbek z nososorpcji do badania niemowląt z zapaleniem oskrzelików. W tym badaniu zakażenie syncytialnym wirusem oddechowym wiązało się z wyższymi poziomami mediatorów stanu zapalnego, takich jak interferon gamma.

Co ważne, pobieranie próbek z wykorzystaniem nososorpcji pozwala na włączenie zdrowej grupy kontrolnej do badań na niemowlętach. Bronchosorpcję stosowano również w badaniu prowokacyjnym rinowirusa u zdrowych ochotników i astmatyków alergicznych. Badanie to wykazało znaczny wzrost mediatorów stanu zapalnego interferonu gamma, ITAC, IL-10 i IL-5 w dolnych drogach oddechowych podczas infekcji rinowirusem.

Włączenie tej techniki do badań dolnych dróg oddechowych stwarza możliwość pomiaru poziomów mediatorów, które mogą być niewykrywalne konwencjonalnymi metodami, takimi jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe. Podsumowując, płyn z błony śluzowej można uzyskać nieinwazyjnie i ma ekscytujący potencjał do pomiaru reakcji zapalnych w infekcjach i stanach zapalnych. Metody elucji muszą być dostosowane do rodzaju próbek i parametrów, które mają być mierzone.

W szczególności MLF może być stosowany do pomiaru cytokin i chemokin błony śluzowej, infekcji wirusowych, wiremii, infekcji bakteryjnych i grzybiczych oraz mikrobiomu i przeciwciał błony śluzowej. Wreszcie, metody pobierania próbek i elucji błony śluzowej będą wymagały dostosowanego opracowania i starannej walidacji dla poszczególnych projektów.