Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego

Ogólnym celem tego protokołu preparacji dla unaczynienia siatkówki dorosłego danio pręgowanego jest zapewnienie szybkiego odczytu w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi za pomocą fluorescencji lub laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w zakresie powikłań mikronaczyniowych, takich jak rozwój retinopatii cukrzycowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że cała siatkówka może być prezentowana i analizowana w procesach fizjologicznych i chorobowych bez stosowania fluorescencji międzynaczyniowej w stosunkowo szybki i ustandaryzowany sposób.

Na początek przenieś sześć mililitrów świeżo przygotowanego czteroprocentowego roztworu PBS PFA na próbkę do dołków z sześcioma płytkami. Po eutanazji dorosłego danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym połóż je na świeżych ręcznikach papierowych i osusz. Użyj skalpela i odetnij głowy za wieczkiem.

Następnie przenieś głowice bezpośrednio do dołków świeżo przygotowanego utrwalacza. Płytki zawierające głowy ryb należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny, aby upewnić się, że utrwalacz wnika w głębsze warstwy siatkówki. Podgrzaną dwuprocentową agarozą napełnij szalkę Petriego do jednej trzeciej i poczekaj, aż agar będzie twardy.

Przykryj płytkę agarową jednym X PBS, aby stworzyć przestrzeń roboczą do wypreparowania oczu. Przenieść utrwaloną próbkę na szalkę Petriego. I przytrzymując głowę na powierzchni cięcia jedną pęsetą, włóż drugą, spiętą ze sobą pęsetę poniżej gałki ocznej w jamie oczodołu.

Powoli otwórz pęsetę pod okiem i chwyć nerw wzrokowy. Następnie ostrożnie oderwij i odłącz oko. Aby usunąć którykolwiek z czterech mięśni prostych i dwóch skośnych mięśni zewnątrzgałkowych połączonych z okiem, a także pozostałą tkankę zewnątrzgałkową łączącą oko z jamą oczodołu, przytrzymaj oko za pomocą półzamkniętej pęsety i chwytając strukturę drugą pęsetą, użyj diametralnego ruchu, aby delikatnie ją oderwać.

Następnie użyj jednorazowej igły o rozmiarze 27, aby nakłuć rogówkę w zewnętrznym zakresie. Przez ten otwór użyj obu pęset, aby przytrzymać rogówkę i lekko ją rozerwij. Następnie ostrożnie pracuj, aby utworzyć wyśrodkowaną łzę o wielkości odpowiedniej źrenicy.

Wywieraj nacisk na stronę rogówki gałki ocznej na zewnętrznej krawędzi rogówki nad tęczówką. Spowoduje to powstanie małego wgniecenia i popchnie soczewkę na wysokość rozdarcia rogówki. Następnie wsuń pęsetę pod soczewkę i wyjmij ją.

Następnie odwróć oko do góry nogami z nerwem wzrokowym skierowanym do góry. Należy pamiętać, że twardówka i rogówka są połączone i tworzą włóknistą tunikę bańki oka, aby chronić siatkówkę w kształcie miseczki. Ta powłoka, zwana rogówką, oszczędza obszar wokół nerwu wzrokowego.

Wbij igłę w tym przerwaniu, aby utworzyć otwór między twardówką a siatkówką. Następnie, korzystając z tego dostępu za pomocą obu pęset, ostrożnie rozerwij twardówkę osiowo na paski, aby zwiększyć otwór wokół nerwu wzrokowego. Należy uważać, aby twardówka rogówki pozostała nienaruszona przy przejściu na obwód strony rogówki.

Przed usunięciem rogówki z pozostałej tkanki wewnątrzgałkowej postaraj się uszkodzić wszelkie połączenia, ponieważ przyczepienie się do innych struktur będzie punktem krytycznym. Następnie przytrzymaj twardówkę jedną pęsetą, a drugą chwytając nerw wzrokowy i odciągając, całkowicie usuń rogówkę z oka i wyrzuć ją. Ten krok zapewni strukturę w kształcie miseczki składającą się z błony naczyniowej oka i siatkówki zawierającej unaczynienie siatkówki.

Następnie należy utworzyć pęknięcie w warstwie naczyniówki i RPE, przytrzymując igłę o rozmiarze 27 bokiem do pozostałej miseczki, jednocześnie skrobając zewnętrzną powierzchnię krawędzią końcówki igły. Użyj pęknięcia jako punktu dostępu, aby chwycić warstwę naczyniówki i RPE, a następnie użyj obu pęset, aby rozerwać ją na paski, zachowując nienaruszone połączenie z tęczówką. Następnie uruchom jedną pęsetę pod tęczówką i przesuwaj ją w obwodzie od zewnątrz, tworząc napięcie, ciągnąc za przerwaną warstwę naczyniówki i RPE i odłącz połączoną strukturę.

Jeśli części tęczówki nie mogą zostać usunięte i pozostać połączone z siatkówką w kształcie miseczki po usunięciu warstwy naczyniówki i RPE, wykorzystaj inny naturalny punkt złamania, który oko dorosłego danio pręgowanego wykazuje wewnątrz warstwy fotoreceptorów. W podobny sposób pokazano, jak usunąć tęczówkę. Zeskrob pozostałą siatkówkę w kształcie miseczki, aby wywołać przerwanie w warstwie fotoreceptorów.

Następnie użyj utworzonego dostępu, aby usunąć warstwę, zachowując możliwe połączenie z tęczówką w stanie nienaruszonym. Następnie uruchom pęsetę pod tęczówką i kontynuuj w obwodzie, jak pokazano wcześniej w tym filmie, aby odłączyć połączoną strukturę. Bardzo ważne jest, aby w rozsądny sposób odłączyć tęczówkę od leżącej pod nią tkanki, ponieważ będzie ona blokować fluorescencję bezpośrednio nad wewnętrznym okręgiem wzrokowym podczas wizualizacji naczyń.

Zbyt bezpośrednie podejście może prowadzić do pęknięcia naczynia. Następnie użyj nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji z prostą, dwupunktową, pięciomilimetrową krawędzią tnącą, aby przeciąć nerw wzrokowy jak najbliżej siatkówki. Pozwoli to na lepsze płaskie mocowanie tkanki.

Aby zamontować i uwidocznić unaczynienie siatkówki, użyj jednego X PBS, aby przemyć wypreparowaną siatkówkę dwa razy przez pięć minut każdy. Umieść kroplę PBS na szkiełku podstawowym. Następnie za pomocą szpatułki laboratoryjnej z końcówką mikrołyżeczkową przenieś siatkówkę do kropli.

Za pomocą pęsety utrzymuj tkankę na miejscu, używając skalpela do przecięcia struktury w kształcie miseczki, aby stworzyć płaski kształt czterech lub pięciu płatków, w zależności od rozmiaru siatkówki. Za pomocą cienkiego kawałka papieru zassaj resztki PBS, uważając, aby nie dotknąć siatkówki. Następnie pokryj płaską siatkówkę w podłożu montażowym i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym.

Uważaj, aby nie tworzyć piany, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą zniekształcać wizualizację naczyń siatkówki. Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić okładkę. Na koniec przeprowadź fluorescencję lub laserową mikroskopię skaningową, aby uwidocznić unaczynienie siatkówki.

Pokazano tutaj morfologiczny przykład unaczynienia siatkówki u dorosłej transgenicznej muchy EGFP zebry uwidoczniony za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i drugi przykład zobrazowany za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, który zmniejsza fluorescencję tła. Odsłonięta struktura siatkówki wykazuje wysoce zorganizowany wzór. Tętnica wzrokowa przenika do siatkówki w głowie nerwu wzrokowego i w większości próbek rozprzestrzenia się na pięć do siedmiu głównych naczyń.

Główne naczynia rozgałęziają się następnie w szereg arkad i łączą się z wewnętrznym okręgiem wzrokowym lub IOC, zwanym również żyłą obwodową, otaczającym dysk wzrokowy na obrzeżach płasko zamontowanej siatkówki. Siatkówka dorosłego danio pręgowanego składa się od wewnątrz z następujących warstw. Warstwa komórek zwojowych, wewnętrzna warstwa splotowata, wewnętrzna warstwa jądrowa, zewnętrzna warstwa splotowata, zewnętrzna warstwa jądrowa, warstwa fotoreceptorów i nabłonek barwnikowy siatkówki.

Oszacowanie parametrów naczyniowych na podstawie wizualizacji unaczynienia siatkówki przedstawiono tutaj. Wewnętrzne unaczynienie siatkówki znajduje się na warstwie komórek zwojowych, podczas gdy naczynia włosowate serca byłyby związane z pigmentowanym nabłonkiem siatkówki. Po przeszkoleniu tę technikę można wykonać w mniej niż 20 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o regularnym ćwiczeniu, ponieważ długotrwała nieobecność w przygotowaniu zmniejsza wynik integralności naczynia. Po tej procedurze można przeanalizować cukrzycę i patologie nerwowo-naczyniowe u dorosłych danio pręgowanego.