Name: Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę mikrodysekcji siatkówki dorosłego danio pręgowanego tg(fli:EGFP) do analizy naczyń krwionośnych. Technika umożliwia szybką ocenę patologii naczyniowych związanych z neowaskularyzacją w badaniach cukrzycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Katrin Bennewitz i Marlene Hausner za hodowlę danio pręgowanego i pomoc techniczną. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Core Facility Live Cell Imaging Mannheim w Centrum Biomedycyny i Technologii Medycznej w Mannheim (DFG INST 91027/9-1). Badania te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (Międzynarodowa Grupa Szkoleniowa 1874/1 "DIAMICOM", projekt SP5 i SP9; Centrum Badawcze Współpracy SFB1118, projekt B1 oraz Centrum Badawcze SFB/TR23 projekt Z5).

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+report+on+diabetes%22">Global report on diabetes</a>. , 88(2016).</li>
<li>Lim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+nephropathy+-+complications+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nephrol+Renovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Diabetic nephropathy - complications and treatment.</a> Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).</li>
<li>Yau, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+and+major+risk+factors+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy.</a> Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).</li>
<li>Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20580421">Diabetic retinopathy.</a> The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).</li>
<li>Raymond, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+prevalence+of+retinopathy+in+diabetic+patients+of+South+Asian+ethnicity+compared+with+white+Europeans+in+the+community%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study.</a> Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).</li>
<li>Heng, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+pathogenesis%2C+clinical+grading%2C+management+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments.</a> Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).</li>
<li>Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).</li>
<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li>
<li>Sharma, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELMO1+protects+renal+structure+and+ultrafiltration+in+kidney+development+and+under+diabetic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions.</a> Sci Rep. 6, 37172(2016).</li>
<li>Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezetimibe+and+simvastatin+reduce+cholesterol+levels+in+zebrafish+larvae+fed+a+high-cholesterol+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Cholesterol%22%5BJournal%5D)">Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet.</a> Cholesterol. , 564705(2012).</li>
<li>Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+zebrafish+as+a+model+for+glucose+metabolism%3A+expression+of+phosphoenolpyruvate+carboxykinase+as+a+marker+for+exposure+to+anti-diabetic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds.</a> J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).</li>
<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+Fish%2C+Big+Data%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).</li>
<li>Kasprick, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+of+adult+zebrafish+extraocular+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles.</a> PLoS One. 6 (11), e27095(2011).</li>
<li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visual+system+of+zebrafish+and+its+use+to+model+human+ocular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases.</a> Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Bell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vasculature+of+adult+zebrafish%3A+in+vivo+imaging+using+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21111217">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li>
<li>Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+and+function+of+midkine+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The expression and function of midkine in the vertebrate retina.</a> Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).</li>
<li>Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+retinal+angiogenesis+in+zebrafish+as+a+model+to+study+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy.</a> PLoS One. 3 (7), e2748(2008).</li>
<li>Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+for+understanding+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model for understanding diabetic complications.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).</li>
<li>Alvarez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+cone+photoreceptor+dysfunction+in+a+hyperglycaemic+model+of+non-proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy.</a> Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).</li>
<li>Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+hyperglycaemia+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+leads+to+morphological+changes+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina.</a> Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).</li>
<li>Jorgens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+tissue+glucose+alters+intersomitic+blood+vessels+in+zebrafish+via+methylglyoxal+targeting+the+VEGF+receptor+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade.</a> Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).</li>
<li>Lai, A. K., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+diabetic+retinopathy%3A+summary+and+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison.</a> J Diabetes Res. 2013, 106594(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Modele neoangiogenezy siatkówkowej indukowanej hipoksją wykazują zwiększoną liczbę punktów rozgałęzień, pąków angiogennych, całkowitą powierzchnię naczyniową oraz zmniejszoną odległość międzykapilarną u ryb zebrafish20. Wyniki te wspierają tezę, że ryba zebrafish jest podatna na powikłania mikronaczyniowe związane z cukrzycą21, ponieważ kluczowe cechy zaawansowanej retinopatii cukrzycowej obejmują neoangiogenezę zależną od hipoksji, która jest silnie powiązana z ekspresją VEGF. Zmiany w siatkówce zebrafish indukowane hiperglikemią prowadzą do zwiększenia grubości naczyń, przy jednoczesnym zachowaniu ogólnego wzorca ich rozmieszczenia2. Naprzemienne zanurzanie w roztworach glukozy przez 30 dni zmniejsza również grubość IPL oraz INL23. Wykazano już również bezpośredni wpływ metabolitów glukozy u zebrafish jako metabolicznych czynników sprawczych waskulopatii. Dodatkowe nadmierne rozgałęzianie naczyń zaobserwowano w naczyniach tułowia embrionów zebrafish po inkubacji z metyloglioksalem24. Obecnie nie istnieje model zwierzęcy, który spełniałby wszystkie kluczowe kryteria retinopatii cukrzycowej. Często stwierdza się zmiany wczesne, jednak brakuje progresji do proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej25. Ryba zebrafish również wpisuje się w tę definicję, ponieważ do tej pory obserwowano albo neoangiogenezę indukowaną hipoksją, albo zmiany indukowane hiperglikemią. Obecne wyniki wspierają tezę, że zebrafish jest podatny na zmiany naczyniowe indukowane hiperglikemią i jako model zwierzęcy może potencjalnie wykazywać progresję do proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej. W zależności od siły i czasu ekspozycji na efekt indukowany hiperglikemią, odpowiedni model eksperymentalny mógłby doprowadzić do niedokrwienia w określonych obszarach siatkówki zebrafish i promować neoangiogenezę jako kluczowe kryterium proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej. Jednakże, ponieważ zebrafish jest stosunkowo nowym obiektem w dziedzinie modelowania długoterminowych patologii mikronaczyniowych, nadchodzące modele cukrzycy u zebrafish dostarczą dalszych informacji i pozwolą ocenić jego znaczenie w odniesieniu do innych modeli i ich patologii. Na przykład, krzyżowanie ryb zebrafish tg(gata1a:DsRed) z erytrocytami znakowanymi na czerwono z linią tg(fli:EGFP) mogłoby posłużyć do jednoczesnej wizualizacji potencjalnych krwawień wewnątrzgałkowych w przyszłych modelach zebrafish wykazujących mikrotętniaki jako predyktor progresji do PDR.
Ponieważ układ naczyniowy siatkówki rozwija się w serii łuków, ocena odległości między naczyniami, liczby punktów rozgałęzień oraz całkowitego obszaru naczyniowego jest powiązana z odległością od centralnej tętnicy wzrokowej. Aby uniknąć błędów w ocenie parametrów naczyniowych, wymagany jest punkt orientacyjny. Taką strukturą jest IOC, która jest szczególnie istotna, ponieważ obszary aktywności naczyniowej znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie przestrzennym. Dla zapewnienia spójności oceny skan siatkówki należy podzielić na wiele prostokątnych sekcji obrazu o stałej odległości od IOC. Analizie powinna zostać poddana cała siatkówka, a obrazy powinny być rozłożone numerycznie i symetrycznie. Siatkówka rybki zebrafish wykazuje obszary o wysokiej i niskiej gęstości kapilar, a nierównomierny rozkład sekcji obrazu może prowadzić do dodatkowych błędów pomiarowych.
<img alt="Obrazy z mikroskopii konfokalnej struktur komórek korzenia rośliny, przedstawiające układ i podziały komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 12"> 
Rycina 12: Przykład prezentacji parametrów naczyniowych jako wyniku wizualizacji naczyń krwionośnych siatkówki. Pomiar odległości międynaczyniowej (czerwona podwójna strzałka) w pobliżu wewnętrznego kręgutocznego (IOC) (A)Trzy punkty rozgałęzień (czerwone okręgi) w pobliżu IOC (B). Wizualizacja unaczynienia siatkówki rybki zebrafish z powiększonym obszarem (czerwona ramka) przedstawiającym wypukające się naczynie (C)Średnica naczynia mierzona w określonej odległości (biała podwójna strzałka) od tętnicy centralnej (biały krzyżyk) (D)Gęstość naczyń to procent powierzchni siatkówki zajętej przez nakładające się naczynia (czerwone linie ukośne). (E). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Aby zmierzyć odległość między naczyniami, należy wyznaczyć określoną odległość od IOC jako standard (Rysunek 12A, biała podwójna strzałka) i narysować wyimaginowaną linię poziomą (Rysunek 12A, pozioma biała linia) równoległą do IOC. Odległość między naczyniami na tej linii, po zsumowaniu i wyciągnięciu średniej arytmetycznej, stanowi odległość między naczyniami. Punkty rozgałęzień są liczone na każdym zdjęciu wszędzie tam, gdzie naczynie dzieli się i z punktu wyjścia kontynuuje więcej niż jedno światło naczyniowe. Obejmuje to również połączenia poziome między kapilarami. Ważne jest zachowanie spójności analizy i ustalenie, które punkty rozgałęzień należy liczyć, oraz przestrzeganie tych zasad przez cały eksperyment, aby zredukować niepotrzebną zmienność. Kiełkowanie naczyń, przedstawione na Rysunku 12C, to kolejny parametr, który można zliczyć na każdym zdjęciu, aby ocenić wpływ na naczyńkówkę siatkówki. Pąki angiogenne nie podążają za łukowatą sekwencją między tętnicą centralną a IOC i koncentrują się w pobliżu zewnętrznych części siatkówki. Aby ocenić średnice określonych naczyń, zawsze potrzebny jest punkt orientacyjny, od którego określona odległość wyznacza miejsce pomiaru. Początek tętnicy centralnej wewnątrz siatkówki stanowi taki punkt odniesienia dla głównych pni naczyniowych (Rysunek 12D, biały krzyżyk). Obszar zajęty przez naczynia (Rysunek 12E, ukośne czerwone linie), wyrażony jako procent całkowitego obszaru siatkówki, to gęstość naczyniowa, która koreluje pośrednio z obszarem awaskularnym.
Pełny skan konfokalny jednej próbki powinien składać się z wielu obrazów o wysokiej szczegółowości, aby umożliwić wizualizację niewielkich nadpączkowań kapilarnych (hypersprouting). Aby zoptymalizować czas i zasoby poświęcone na ten etap, należy zastosować zautomatyzowaną procedurę kaflowania (tiling) z ogólną głębokością skanowania dla każdego kafelka. Nierówne zamocowanie siatkówki może znacznie wydłużyć czas skanowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopu konfokalnego. W podejściu optymalnym należałoby skanować jedynie warstwę naczyniową (Rycina 13B, biała ramka), jednak często konieczne jest częściowe włączenie GCL. Pozostawienie zbyt długiego odcinka nerwu wzrokowego po uciętym fragmencie, a także zbyt krótkie nacięcia wykonane w celu uzyskania preparatu typu flat-mount, mogą prowadzić do nierównego zamocowania próbki.
<img alt="Histologia, mikroskopia fluorescencyjna tkanki siatkówki ukazująca warstwy komórkowe, fluorescencja w kanale zielonym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 13"> 
Rycina 13: Porównanie barwienia HE i autofluorescencji w siatkówce dorosłego danio pręgowanego. Układ naczyniowy siatkówki w ogniskowej płaszczyźnie powyżej GCL (A)Naczynia krwionośne siatkówki (biała ramka) wykazujące zielony sygnał EGFP oraz warstwy siatkówki wykazujące silną autofluorescencję (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ponieważ prawidłowe przygotowanie naczyń krwionośnych siatkówki danio-pręgowanego wymaga wcześniejszego przeszkolenia, głównym ograniczeniem tej techniki jest niewielka wielkość próby w przypadku niedoświadczonych operatorów oraz znaczne zróżnicowanie wyników preparacji. Mimo że przygotowanie oczu ryb zebrafish linii tg(fli:EGFP) pozwala na szybki wgląd w stan naczyń krwionośnych, technika ta wciąż wymaga około 20 min pracy nad jedną siatkówką w przypadku doświadczonego badacza. Wszystkie etapy preparacji naczyń siatkówki muszą być wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym, a operator musi zachować pełną koncentrację przez cały czas, ponieważ jeden nieuwaga może doprowadzić do przerwania naczyń. Operator powinien regularnie ćwiczyć, gdyż długa przerwa w wykonywaniu preparacji zmniejsza prawdopodobieństwo zachowania integralności naczyń.
Ponadto dodatkowa analiza za pomocą immunohistochemii (IHC) jest wciąż ograniczona, ponieważ tylko niewielka liczba przeciwciał zwalidowanych na tkankach ludzkich i gryzoni działa u danio pręgowanego. Badaczom zainteresowanym IHC zaleca się poszukiwanie przeciwciał specyficznych dla danio pręgowanego, szczególnie w przypadku pracy z nowymi celami. Alternatywnie zaleca się stosowanie dodatkowych linii reporterowych danio pręgowanego, które są przydatne do badania komórek poza naczyniami krwionośnymi w oku. Strategia ta jest jednak czasochłonna, ponieważ wygenerowanie dorosłych linii danio pręgowanego przenoszących wiele reporterów transgenicznych zajmuje kilka miesięcy.
Niemniej jednak rybka danio oferuje szereg unikalnych zalet. Są one stosunkowo małe i łatwo się rozmnażają. Szybko osiągają stadia dorosłe, a ich embriony są optymalne do przesiewania leków. Dziedzina ta dynamicznie się rozwija i coraz więcej literatury staje się dostępnych. Dzięki możliwości szybkiego generowania nokautów genowych oraz obfitości linii z fluorescencyjnymi reporterami transgenicznymi, wybór rybki danio ogranicza jedynie obrany problem badawczy.

Cukrzyca jest chorobą metaboliczną definiowaną przez hiperglikemię, która wynika z dysfunkcyjnej sekrecji insuliny lub niewłaściwej odpowiedzi tkanek na wydzielaną insulinę. WHO szacuje, że w 2014 roku 42 miliony dorosłych żyło z cukrzycą1, a przewiduje się, że do 2035 roku zapadalność na cukrzycę na całym świecie wzrośnie do 8–10% populacji2, co sprawia, że cukrzyca stanie się jedną z kluczowych dziedzin badawczych w nadchodzących dziesięcioleciach. Życie z chronicznie wysokim poziomem cukru we krwi prowadzi do długoterminowych powikłań mikronaczyniowych, w tym do retinopatii, nefropatii i polineuropatii cukrzycowej. Zarządzanie tymi powikłaniami i ich zapobieganie są trudne; w rzeczywistości cukrzyca staje się najczęstszą przyczyną schyłkowej niewydolności nerek (ESRD), prowadzącej do dializ2, oraz jest główną przyczyną ślepoty wśród osób w średnim wieku3.
Pierwotnymi przyczynami uszkodzeń mikronaczyniowych w oku pacjenta z cukrzycą są przewlekła hiperglikemia, zmiany metaboliczne oraz określone czynniki ryzyka (np. nadciśnienie tętnicze, dyslipidemia), prowadzące do dysfunkcji śródbłonka naczyniowego, zaniku perycytów i regresji kapilarnej, co skutkuje powstaniem bezkomórkowych rękawów naczyniowych. Wynikająca z tego niedokrwienność siatkówki jest przyczyną neowaskularyzacji i zwiększonej przepuszczalności naczyniowej, co sprzyja rozwojowi proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR)4. Retinopatia cukrzycowa była ogólnie wykrywana u 37% pacjentów z cukrzycą, natomiast retinopatia cukrzycowa zagrażająca wzrokowi stwierdzona została u 12% przebadanej białej kohorty europejskiej w badaniu UKADS5. Obecne leczenie pozwala jedynie zapobiegać dalszym powikłaniom i nie jest w stanie w pełni odwrócić już powstałych uszkodzeń. Fotokoagulacja panretinalna, poza kontrolą glikemii, jest standardową terapią w proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR), lecz oddziałuje ona również na sąsiednie zdrowe tkanki. Interwencje z użyciem przeciwciał anty-VEGF wykazują obiecujące wyniki jako alternatywa dla leczenia laserowego6,7, jednak w ostateczności niezbędna jest specjalistyczna, celowana terapia oraz nowe leki, aby zarządzać rosnącą liczbą pacjentów zagrożonych utratą wzroku.
Ustanowione modele badań zwierzęcych nad retinopatią cukrzycową nie odzwierciedlają każdego aspektu ludzkiej patofizjologii. Dobór odpowiedniego gatunku, aby sprostać konkretnym wymaganiom naukowego pytania badawczego, jest jednym z najważniejszych elementów projektu eksperymentalnego. Zarodek rybki zebrafish (Danio rerio) jest już szeroko stosowany w badaniach nad rozwojem i zapewnia optymalne praktyczne tło do wyciszania (knockdown) lub usuwania (knockout) specyficznych genów za pomocą morfolino lub techniki CRISPR/Cas98. Metody te mogą być łatwo wykorzystane u rybek zebrafish do badania genów zidentyfikowanych w szeroko zakrojonych badaniach asocjacyjnych całego genomu (GWAS), co pozwala uzyskać wgląd w konkretne mechanizmy progresji choroby i podatności na nią9. Krótki czas generacji, duża liczba potomstwa, łatwa i niedroga obsługa oraz rosnące wsparcie dla testów diagnostycznych zwiększyły znaczenie modelu zebrafish, zwłaszcza biorąc pod uwagę jego ogromny potencjał w modelowaniu chorób metabolicznych. Wykazano, że zachowanie mechanizmów biologicznych u rybek zebrafish stanowi podstawę dla rozwoju terapii farmakologicznych. Na przykład wykazano, że lek przeciwcukrzycowy metformina i obniżająca poziom cholesterolu simwastatyna „leczą” stany w modelach wysokiej ekspresji PEPCK indukowanej cAMP/deksametazonem oraz hipercholesterolemii indukowanej dietą wysokocholesterolemową10,1,12. To rosnące zrozumienie nadrzędnych, zachowanych mechanizmów metabolicznych jest dodatkowo wspierane przez zwiększającą się liczbę modeli cukrzycy u rybek zebrafish, obejmujących eksperymenty takie jak: naprzemienna inkubacja w roztworach glukozy, ablacja komórek beta indukowana streptozotocyną, ablacja komórek beta za pośrednictwem nitroreduktazy z użyciem proleku metronidazolu, cukrzyca monogeniczna indukowana przez knockdown lub knockout genu pdx1, a także modele zwiększonej insulinooporności w mięśniach szkieletowych12. Te już ustanowione protokoły, wspomniana specyfika gatunkowa oraz możliwość efektywnej manipulacji genomem w dużej liczbie próbek demonstrują zalety rybek zebrafish w badaniu mechanizmów napędzających złożone procesy chorobowe, a także możliwość przesiewania interwencji farmakologicznych.
Ogólna znajomość podstawowej anatomii oka zebrafish (Rycina 1) jest niezbędna dla osoby wykonującej preparację, aby móc wykorzystać zebrafish jako model angiopatii siatkówki. Oko zebrafish posiada sześć mięśni pozagałkowych: cztery mięśnie proste i dwa mięśnie skośne, które przyczepiają się do zewnętrznej strony gałki ocznej na poziomie twardówki13. Rogówka to przezroczysta tkanka pokrywająca soczewkę, która przechodzi bezpośrednio w twardówkę tworzącą zewnętrzną powłokę oka. Twardówka jest nieprzezroczysta, posiada częściowo odbijającą światło powierzchnię i jest silnie pigmentowana. Sama soczewka ma bardziej kulisty kształt niż jej ludzki odpowiednik. Siatkówka składa się z trzech warstw jądrowych komórek neuronalnych, natomiast doprowadzające tlen naczynia siatkówki są ściśle powiązane z wewnętrzną warstwą komórek zwojowych, ale nie tworzą sieci podsiatkówkowej. Naczynia naczyniówkowe natomiast znajdują się pomiędzy twardówką a siatkówką i są powiązane z nabłonkiem pigmentowym siatkówki (RPE). Ta sieć kapilarna dostarcza tlen do zewnętrznych części siatkówki14.
<img alt="Schemat anatomii oka, rogówka, siatkówka, nerw wzrokowy, soczewka, twardówka; wizualizacja struktury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie oka dorosłego danio pręgowanego. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Prostą wizualizację naczyń krwionośnych siatkówki można osiągnąć dzięki zastosowaniu transgenicznej linii danio-ostrobłotników tg(fli:EGFP)15. Zielone białko fluorescencyjne, ekspresowane pod kontrolą promotora fli w komórkach śródbłonka naczyń, stanowi podstawę wizualizacji za pomocą skaningowego mikroskopu laserowego w kolejnych etapach. Osiąga się to poprzez wypreparowanie siatkówki danio-ostrobłotnika i przygotowanie preparatu całego tkankowego (whole-mount). Ten model transgeniczny zapewnia szybki odczyt naczyniowy bez konieczności stosowania znakowania wewnątrznaczyniowego lub immunohistochemii całych tkanek. Aby analizować retinopatię cukrzycową u danio-ostrobłotników, każdy operator powinien stosować ustandaryzowaną procedurę preparowania krok po kroku. Poniższy protokół preparowania umożliwia innym grupom badawczym łatwą ocenę zmian naczyniowych w odsłoniętych naczyniach oka dorosłego danio-ostrobłotnika oraz służy jako wytyczna do ustanowienia zoptymalizowanej rutyny preparowania siatkówki danio-ostrobłotnika.

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Roth</td><td>6771.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*6H20</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H20</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Sód diwodorofosforan</td><td>Roth</td><td>2370.1</td><td></td></tr><tr><td>Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (MS-222,Trikaina)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo-Fischer</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Greiner Bio one</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Płytka sześciodołkowa</td><td>StarLab</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>BD 300900</td><td></td></tr><tr><td>Mikro pęseta</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikrodysekcji</td><td>World Precyzyjne instrumenty</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Carl Roth</td><td>H872.1</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 22mmx22mm</td><td>neoLab</td><td></td><td></td>103512222</tr><tr><td>Skalpel</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>FEA111</td><td></td></tr><tr><td>Epi-Illumination</td><td>Leica</td><td>10446389</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy MZ10 F</td><td></td><td></td> Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop skaningowy Leica NA <td></td></tr><tr><td>SP5 DS</td> Mikroskop stereoskopowy <td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Linia danio pręgowanego: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype</td><td>NA</td><td>NA</td><td>patrz Odniesienie 15</td></tr><tr><td>Mayer' s hematoksylina</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml; hne</td><td>0088663</td><td></td></tr><tr><td>0,5% eozyny</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml; hne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>99,9% etanol</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Merck</td><td>1,071,501,000</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Roth</td><td>4436.2</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Emsure</td><td>606-001-00-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom RM 2165</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:egfp) danio pręgowanego

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Retinopatia cukrzycowa jest główną przyczyną ślepoty wśród dorosłych w średnim wieku. Rosnąca częstość występowania cukrzycy na całym świecie sprawi, że zapobieganie cukrzycowym powikłaniom mikronaczyniowym stanie się jednym z kluczowych kierunków badań w nadchodzących dziesięcioleciach. Specjalistyczna, celowana terapia i nowatorskie leki terapeutyczne są potrzebne, aby poradzić sobie z rosnącą liczbą pacjentów zagrożonych utratą wzroku. Danio pręgowany jest uznanym modelem zwierzęcym dla badań rozwojowych o rosnącym znaczeniu dla modelowania metabolicznych wieloczynnikowych procesów chorobowych. Zalety tego gatunku pozwalają na optymalną wizualizację i wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków, w połączeniu z silną zdolnością do eliminowania interesujących genów. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego danio pręgowanego tg (fli: EGFP) jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą lub uszkodzeniem naczyń. Osiąga się to poprzez rozwarstwienie siatkówki danio pręgowanego i całkowite zamontowanie tkanki. Wizualizację odsłoniętych naczyń uzyskuje się następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej zielonego reportera EGFP wyrażonego w unaczynieniu siatkówki dorosłego. Prawidłowe obchodzenie się z tkanką doprowadzi do lepszych wyników i mniejszego pękania naczyń wewnętrznych, aby zapewnić wizualizację niezmienionej struktury naczyniowej. Metoda ta może być stosowana w modelach waskulopatii siatkówki danio pręgowanego związanych ze zmianami w architekturze naczyń krwionośnych, a także neoangiogenezą.

Prezentujemy tutaj dwa typowe przykłady morfologiczne naczyń krwionośnych siatkówki u dorosłych rybek zebrafish tg(fli:EGFP): jeden obrazowany za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 9A) oraz drugi za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (Rysunek 9B). Ujawniona struktura siatkówki wykazuje wysoce zorganizowany wzorzec. Przy obrazowaniu siatkówki zebrafish za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego widoczna jest silna autofluorescencja. W związku z tym, w celu zmniejszenia fluorescencji tła i zwiększenia kontrastu, zaleca się wizualizację wyłącznie warstwy naczyniowej za pomocą skanowania konfokalnego. W przypadku potrzeby szybszego pozyskania obrazów lub w sytuacjach, gdy dane jakościowe są wystarczające, mikroskop fluorescencyjny stanowi atrakcyjną alternatywę.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna płatków kwiatowych; wzorce naczyniowe w analizie optycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Reprezentatywne zdjęcia naczyń krwionośnych siatkówki dorosłych rybek zebrafish tg(fli:EGFP). Przedstawiono dwa typowe przykłady morfologiczne naczyń krwionośnych siatkówki: centralna tętnica oczna rozgałęzia się na 5–7 głównych naczyń, które następnie dzielą się na kolejne arkady. Wszystkie pozostałe naczynia odprowadzają krew do żyły obwodowej (CV), ograniczającej zewnętrzną część każdego płatka. Wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy powiększeniu 2,5x. (A)Wizualizacja unaczynienia siatkówki za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej z wykorzystaniem połączonego skanu kafelkowego pojedynczego obrazu 5x5 (B). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Tętnica oczna penetruje siatkówkę w obrębie głowy nerwu wzrokowego i w większości próbek rozdziela się na 5-7 głównych naczyń (Rysunek 10A). Główne naczynia rozgałęziają się następnie w serii arkad i łączą z wewnętrznym kręgiem naczyniowym (IOC), zwanym również żyłą obwodową (CV), która otacza tarczę nerwu wzrokowego na peryferiach siatkówki zamontowanej na płasko (patrz Rysunek 10B). IOC jest naczyniem żylnym, które odprowadza krew tętniczą z wewnętrznej krawędzi gałki ocznej (bulbus oculi). Układ naczyniowy siatkówki danio-ostrosejana wykazuje również obszary wysokiej aktywności naczyniowej z rozgałęzieniami kapilar i pęczkowaniem angiogennym (Rysunek 10C). Aktywność naczyniowa ta jest zlokalizowana głównie w bezpośrednim sąsiedztwie IOC. Należy zauważyć, że to samo oko może wykazywać zarówno wysoką, jak i niską aktywność naczyniową w różnych regionach siatkówki (porównać Rysunek 10B i Rysunek 10C). Ogólnie rzecz biorąc, układ naczyniowy siatkówki danio-ostrosejana wykazuje więcej przestrzeni anaczyniowej i mniej kapilar pomiędzy głównymi odgałęzieniami w porównaniu na przykład do siatkówki myszy17. Należy analizować oba oczy każdej próbki, ponieważ układ naczyniowy może się między nimi różnić, a badanie tylko jednego oka może prowadzić do błędów systematycznych.
<img alt="Obraz mikroskopowy: struktura sieci neuronowej, barwienie fluorescencyjne, analiza biologiczna, wskaźnik skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10: Powiększone obszary wizualizacji naczyń krwionośnych siatkówki dorosłych danio pręgowanych tg(fli:EGFP). Tętnica oczna rozgałęziająca się na główne naczynia (A)Naczynia włosowate siatkówki w obszarze o niskiej aktywności naczyniowej, łączące się z wewnętrznym kręgiem nerwu wzrokowego (IOC) w dolnej części zdjęcia (B)Naczynia włosowate siatkówki w obszarze wysokiej aktywności naczyniowej łączące się z IOC (C). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Wysoce konserwatywna architektura warstw neuronalnych występuje u danio przeżebrowanego już od około 72 h po zapłodnieniu (hpf)18. Siatkówka dorosłego osobnika danio przeżebrowanego wykazuje następujące warstwy, licząc od wewnątrz na zewnątrz (Rycina 11): warstwę komórek zwojowych (GCL), wewnętrzną warstwę splotowatą (IPL), wewnętrzną warstwę jądrową (INL), zewnętrzną warstwę splotowatą (OPL), zewnętrzną warstwę jądrową (ONL), warstwę fotoreceptorów (PL) oraz nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE). Szacowanie parametrów naczyniowych na podstawie wizualizacji naczyń siatkówki przedstawiono na Rycini 12. Wewnętrzne naczynia siatkówki znajdują się na warstwie komórek zwojowych (GCL) (Rycina 13B, biała ramka), natomiast kapilary chłonoidalne są powiązane z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE).
<img alt="Histologia, mikroskopowe obrazy przekroju warstw siatkówki; porównanie struktur z etykietami; skala 10 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Barwienie HE oka dorosłego danio pręgowanego. Przekrój poprzeczny całego oka po usunięciu soczewki (A)Warstwy siatkówki oka dorosłej danio pręgowanej19 (B)Wskazanie (czarna strzałka) naturalnego punktu pęknięcia w PL (C). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj omawiamy protokół metody, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego dg(fli:EGFP) danio pręgowanego jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi.

Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Ogólnym celem tego protokołu preparacji dla unaczynienia siatkówki dorosłego danio pręgowanego jest zapewnienie szybkiego odczytu w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi za pomocą fluorescencji lub laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w zakresie powikłań mikronaczyniowych, takich jak rozwój retinopatii cukrzycowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że cała siatkówka może być prezentowana i analizowana w procesach fizjologicznych i chorobowych bez stosowania fluorescencji międzynaczyniowej w stosunkowo szybki i ustandaryzowany sposób.Na początek przenieś sześć mililitrów świeżo przygotowanego czteroprocentowego roztworu PBS PFA na próbkę do dołków z sześcioma płytkami. Po eutanazji dorosłego danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym połóż je na świeżych ręcznikach papierowych i osusz. Użyj skalpela i odetnij głowy za wieczkiem.Następnie przenieś głowice bezpośrednio do dołków świeżo przygotowanego utrwalacza. Płytki zawierające głowy ryb należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny, aby upewnić się, że utrwalacz wnika w głębsze warstwy siatkówki. Podgrzaną dwuprocentową agarozą napełnij szalkę Petriego do jednej trzeciej i poczekaj, aż agar będzie twardy.Przykryj płytkę agarową jednym X PBS, aby stworzyć przestrzeń roboczą do wypreparowania oczu. Przenieść utrwaloną próbkę na szalkę Petriego. I przytrzymując głowę na powierzchni cięcia jedną pęsetą, włóż drugą, spiętą ze sobą pęsetę poniżej gałki ocznej w jamie oczodołu.Powoli otwórz pęsetę pod okiem i chwyć nerw wzrokowy. Następnie ostrożnie oderwij i odłącz oko. Aby usunąć którykolwiek z czterech mięśni prostych i dwóch skośnych mięśni zewnątrzgałkowych połączonych z okiem, a także pozostałą tkankę zewnątrzgałkową łączącą oko z jamą oczodołu, przytrzymaj oko za pomocą półzamkniętej pęsety i chwytając strukturę drugą pęsetą, użyj diametralnego ruchu, aby delikatnie ją oderwać.Następnie użyj jednorazowej igły o rozmiarze 27, aby nakłuć rogówkę w zewnętrznym zakresie. Przez ten otwór użyj obu pęset, aby przytrzymać rogówkę i lekko ją rozerwij. Następnie ostrożnie pracuj, aby utworzyć wyśrodkowaną łzę o wielkości odpowiedniej źrenicy.Wywieraj nacisk na stronę rogówki gałki ocznej na zewnętrznej krawędzi rogówki nad tęczówką. Spowoduje to powstanie małego wgniecenia i popchnie soczewkę na wysokość rozdarcia rogówki. Następnie wsuń pęsetę pod soczewkę i wyjmij ją.Następnie odwróć oko do góry nogami z nerwem wzrokowym skierowanym do góry. Należy pamiętać, że twardówka i rogówka są połączone i tworzą włóknistą tunikę bańki oka, aby chronić siatkówkę w kształcie miseczki. Ta powłoka, zwana rogówką, oszczędza obszar wokół nerwu wzrokowego.Wbij igłę w tym przerwaniu, aby utworzyć otwór między twardówką a siatkówką. Następnie, korzystając z tego dostępu za pomocą obu pęset, ostrożnie rozerwij twardówkę osiowo na paski, aby zwiększyć otwór wokół nerwu wzrokowego. Należy uważać, aby twardówka rogówki pozostała nienaruszona przy przejściu na obwód strony rogówki.Przed usunięciem rogówki z pozostałej tkanki wewnątrzgałkowej postaraj się uszkodzić wszelkie połączenia, ponieważ przyczepienie się do innych struktur będzie punktem krytycznym. Następnie przytrzymaj twardówkę jedną pęsetą, a drugą chwytając nerw wzrokowy i odciągając, całkowicie usuń rogówkę z oka i wyrzuć ją. Ten krok zapewni strukturę w kształcie miseczki składającą się z błony naczyniowej oka i siatkówki zawierającej unaczynienie siatkówki.Następnie należy utworzyć pęknięcie w warstwie naczyniówki i RPE, przytrzymując igłę o rozmiarze 27 bokiem do pozostałej miseczki, jednocześnie skrobając zewnętrzną powierzchnię krawędzią końcówki igły. Użyj pęknięcia jako punktu dostępu, aby chwycić warstwę naczyniówki i RPE, a następnie użyj obu pęset, aby rozerwać ją na paski, zachowując nienaruszone połączenie z tęczówką. Następnie uruchom jedną pęsetę pod tęczówką i przesuwaj ją w obwodzie od zewnątrz, tworząc napięcie, ciągnąc za przerwaną warstwę naczyniówki i RPE i odłącz połączoną strukturę.Jeśli części tęczówki nie mogą zostać usunięte i pozostać połączone z siatkówką w kształcie miseczki po usunięciu warstwy naczyniówki i RPE, wykorzystaj inny naturalny punkt złamania, który oko dorosłego danio pręgowanego wykazuje wewnątrz warstwy fotoreceptorów. W podobny sposób pokazano, jak usunąć tęczówkę. Zeskrob pozostałą siatkówkę w kształcie miseczki, aby wywołać przerwanie w warstwie fotoreceptorów.Następnie użyj utworzonego dostępu, aby usunąć warstwę, zachowując możliwe połączenie z tęczówką w stanie nienaruszonym. Następnie uruchom pęsetę pod tęczówką i kontynuuj w obwodzie, jak pokazano wcześniej w tym filmie, aby odłączyć połączoną strukturę. Bardzo ważne jest, aby w rozsądny sposób odłączyć tęczówkę od leżącej pod nią tkanki, ponieważ będzie ona blokować fluorescencję bezpośrednio nad wewnętrznym okręgiem wzrokowym podczas wizualizacji naczyń.Zbyt bezpośrednie podejście może prowadzić do pęknięcia naczynia. Następnie użyj nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji z prostą, dwupunktową, pięciomilimetrową krawędzią tnącą, aby przeciąć nerw wzrokowy jak najbliżej siatkówki. Pozwoli to na lepsze płaskie mocowanie tkanki.Aby zamontować i uwidocznić unaczynienie siatkówki, użyj jednego X PBS, aby przemyć wypreparowaną siatkówkę dwa razy przez pięć minut każdy. Umieść kroplę PBS na szkiełku podstawowym. Następnie za pomocą szpatułki laboratoryjnej z końcówką mikrołyżeczkową przenieś siatkówkę do kropli.Za pomocą pęsety utrzymuj tkankę na miejscu, używając skalpela do przecięcia struktury w kształcie miseczki, aby stworzyć płaski kształt czterech lub pięciu płatków, w zależności od rozmiaru siatkówki. Za pomocą cienkiego kawałka papieru zassaj resztki PBS, uważając, aby nie dotknąć siatkówki. Następnie pokryj płaską siatkówkę w podłożu montażowym i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym.Uważaj, aby nie tworzyć piany, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą zniekształcać wizualizację naczyń siatkówki. Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić okładkę. Na koniec przeprowadź fluorescencję lub laserową mikroskopię skaningową, aby uwidocznić unaczynienie siatkówki.Pokazano tutaj morfologiczny przykład unaczynienia siatkówki u dorosłej transgenicznej muchy EGFP zebry uwidoczniony za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i drugi przykład zobrazowany za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, który zmniejsza fluorescencję tła. Odsłonięta struktura siatkówki wykazuje wysoce zorganizowany wzór. Tętnica wzrokowa przenika do siatkówki w głowie nerwu wzrokowego i w większości próbek rozprzestrzenia się na pięć do siedmiu głównych naczyń.Główne naczynia rozgałęziają się następnie w szereg arkad i łączą się z wewnętrznym okręgiem wzrokowym lub IOC, zwanym również żyłą obwodową, otaczającym dysk wzrokowy na obrzeżach płasko zamontowanej siatkówki. Siatkówka dorosłego danio pręgowanego składa się od wewnątrz z następujących warstw. Warstwa komórek zwojowych, wewnętrzna warstwa splotowata, wewnętrzna warstwa jądrowa, zewnętrzna warstwa splotowata, zewnętrzna warstwa jądrowa, warstwa fotoreceptorów i nabłonek barwnikowy siatkówki.Oszacowanie parametrów naczyniowych na podstawie wizualizacji unaczynienia siatkówki przedstawiono tutaj. Wewnętrzne unaczynienie siatkówki znajduje się na warstwie komórek zwojowych, podczas gdy naczynia włosowate serca byłyby związane z pigmentowanym nabłonkiem siatkówki. Po przeszkoleniu tę technikę można wykonać w mniej niż 20 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o regularnym ćwiczeniu, ponieważ długotrwała nieobecność w przygotowaniu zmniejsza wynik integralności naczynia. Po tej procedurze można przeanalizować cukrzycę i patologie nerwowo-naczyniowe u dorosłych danio pręgowanego.

studying-diabetes-through-eyes-fish-microdissection-visualization

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Pamięć metaboliczna to zjawisko, dzięki któremu powikłania cukrzycowe utrzymują się i postępują bez przeszkód, nawet po osiągnięciu euglikemii farmaceutycznie. W tym miejscu opisujemy model danio pręgowanego z cukrzycą, który jest wyjątkowy, ponieważ pozwala na badanie mitotycznie przenoszonych składników epigenetycznych pamięci metabolicznej in vivo.

Model danio pręgowanego cukrzycy i pamięci metabolicznej

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Danio pręgowany jest popularnym modelem zwierzęcym do badania mechanizmów degeneracji/regeneracji siatkówki u kręgowców. Protokół ten opisuje metodę wywoływania miejscowego urazu zakłócającego zewnętrzną siatkówkę przy minimalnym uszkodzeniu wewnętrznej siatkówki. Następnie monitorujemy in vivo morfologię siatkówki i odpowiedź glejową Müllera przez cały okres regeneracji siatkówki.

Aktywacja komórek glejowych Müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego

Obrazowanie tkanki siatkówki może dostarczyć informacji o pojedynczej komórce, której nie można uzyskać tradycyjnymi metodami biochemicznymi. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków siatkówki od danio pręgowanego do obrazowania konfokalnego. Fluorescencyjne czujniki kodowane genetycznie lub barwniki wskaźnikowe umożliwiają wizualizację wielu procesów biologicznych w różnych typach komórek siatkówki.

Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

Ten protokół nieinwazyjnie wywołuje hiperglikemię u danio pręgowanego przez okres do 8 tygodni. Korzystając z tego protokołu, można przeprowadzić dogłębne badanie niekorzystnych skutków hiperglikemii.

Naprzemienne zanurzanie w glukozie w celu wytworzenia przedłużonej hiperglikemii u danio pręgowanego

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Poznaj metodę mikrodysekcji siatkówki dorosłego danio pręgowanego tg(fli:EGFP) do analizy naczyń krwionośnych. Technika umożliwia szybką ocenę patologii naczyniowych związanych z neowaskularyzacją w badaniach cukrzycy.

Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów