Name: Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy złożoności arboryzacji dendrytycznej u Drosophila w kontekście rozwoju neuronów. Technika ta umożliwia badanie wpływu genu SOX5 na morfogenezę dendrytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Williamowi A. Eimerowi za pomoc techniczną w zakresie obrazowania. Praca ta była wspierana przez Cure Alzheimer's Fund [do R.E.T], National Institute of Health [R01AG014713 i R01MH60009 do R.E.T.; R03AR063271 i R15EB019704 do A.L.] oraz National Science Foundation [NSF1455613 do A.L.].

1. Przygotowanie do eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotować następujące odczynniki: sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS); Tryton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldehyd (PFA), rozcieńczony do 4% przed użyciem; baza z elastomeru silikonowego i utwardzacz; medium mocujące zapobiegające blaknięciu (np. ProLong Gold); i lakier do paznokci.</li>
	<li>Przygotuj następujący sprzęt: mikroskop preparacyjny, dwa ostre kleszcze i nożyczki do mikropreparacji, kilka szpilek do mikrodysekcji, szalkę Petriego do wykonania naczynia preparacyjnego, szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe, mikroskop konfokalny oraz komputer z zainstalowanym oprogramowaniem Fiji ImageJ.</li>
</ol>
2. Kolekcja larw
<ol>
	<li>Mate UAS-Sox102F-RNAi lata odpowiednio z muchami typu dzikiego UAS-GFP, ppk-GAL4 lub W1118. Hodowla leci w standardowych warunkach w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>W ciągu ~ 5 - 6 dni zbierz larwy trzeciego stadium rozwojowego UAS-Sox102F-RNAi/ ppk-GAL4, UAS-GFP lub UAS-GFP i ppk-GAL4 /+ ostrożnie kontroluj kleszczami do sekcji.</li>
</ol>
3. Sekcja larw
UWAGA: Wszystkie procedury w tej sekcji są wykonywane pod mikroskopem mikrodyparacyjnym. Powiększenie zależy od badaczy. Spróbuj dostosować się do optymalnego widoku. Zalecane jest powiększenie ~4 - 6X.
<ol>
	<li>Umieścić larwę na naczyniu preparacyjnym wykonanym na bazie elastomeru silikonowego i szalce Petriego z kulturą tkankową.</li>
	<li>Przypnij haczyk do ust larwy, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a następnie przypnij ogon larwy. Umieść stronę grzbietową pośrodku tak bardzo, jak to możliwe, aby odsłonić linię środkową, która będzie znacznikiem otwartym.</li>
	<li>Dodaj 200 μl PBS do larwy, aby utrzymać wilgotność ciała.</li>
	<li>Wykonaj cięcie nożyczkami wzdłuż grzbietowej linii środkowej między dwiema tchawicami, od ogona do rostralu. Wykonaj małe nacięcie w każdym z czterech rogów ciała larwy.</li>
	<li>Umieść szpilkę w każdym z czterech rogów ciała, tak aby ciało leżało płasko.</li>
	<li>Umocuj ścianę ciała larwy w 4% PFA na 25 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć w PBST przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Usuń szpilki z tkanki. Następnie przenieś chusteczkę na szkiełko podstawowe, przykryj medium mocującym zapobiegającym blaknięciu i zamocuj za pomocą szkiełka nakrywkowego. Suszyć na powietrzu przez 1 godzinę i uszczelnić krawędzie lakierem do paznokci.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazowania
UWAGA: Zdjęcia zostały wykonane za pomocą systemu odwróconego mikroskopu konfokalnego. Użytkownik może sfotografować próbkę za pomocą obiektywu 20X (zalecane).
<ol>
	<li>Przechwytywanie obrazów z serii Z. Otwórz okno dialogowe "Przechwyć serię Z" w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego. Określ zakres przechwytywania obrazów z serii Z.
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk "Góra i dół". Określ górną i dolną pozycję, a następnie wprowadź wartości w polach "Dół:" i "Góra:". Ustaw "Krok" w oknie dialogowym "Przechwyć serię Z" na 0,5 μm. Następnie kliknij przycisk "Uruchom teraz", aby pobrać obrazy z serii Z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskane obrazy zapisujemy jako pliki *.tiff lub *.nd2.</li>
	<li>Po obrazowaniu preparaty należy przechowywać w ciemnym uchwycie w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Ocena dendrytu
Uwaga: białko GFP uległo nadekspresji u muszek UAS-GFP i ppk-GAL4 w neuronach da do analizy obrazowania fluorescencji GFP. Określono ilościowo długość, rozgałęzienie i strukturę neuronów da u larw trzeciego stadium rozwojowego. Parametry analizy obejmują długość dendrytów (μm), pole powierzchni (μm2), całkowitą liczbę rozgałęzień i strukturę rozgałęzień (%). Rysunek 1 pokazuje szczegółowo parametry analizy.
<ol>
	<li>Długość dendrytów 
	UWAGA: Długość dendrytów jest sumą wszystkich dendrytów oznaczonych we wtyczce tracer.
	<ol>
		<li>Zainstaluj i uruchom oprogramowanie Fiji ImageJ (https://fiji.sc/)20. Następnie podziel obrazy na osobne kanały, jeśli jest kilka kanałów images. 
		UWAGA: Obraz w tym protokole ma tylko jeden kanał GFP.</li>
		<li>Uruchom "Obraz | Stosy | Projekt Z", aby uzyskać rzut Z; pojawi się nowe okno o nazwie "Projekcja Z". Kliknij "maksymalna intensywność" dla typu projekcji i uporządkuj liczby między wycinkiem początkowym i końcowym w zależności od indywidualnych preferencji. Kliknij "OK". Pojawi się obraz projekcji Z, który wyraźnie przedstawia projekcję dendrytów.</li>
		<li>Śledź neuryty.
		<ol>
			<li>Wybierz "Wtyczki | Segmentacja | Simple Neurites Tracer" w oknie, aby prześledzić dendryty. Znajdź neuron soma, a następnie kliknij jeden punkt na dendrycie, zaczynając od ciała komórki, a drugi punkt na końcu tego dendrytu. 
			UWAGA: Program połączy oba punkty niebieską linią.</li>
			<li>Naciśnij "Y" w oknie wtyczki, jeśli ścieżka jest czysta; ścieżka dendrytowa jest śledzona aż do punktów końcowych wybranej ścieżki na widocznych obrazach. Kliknij "pełna ścieżka" w tym samym oknie wtyczki; segment jest zakończony (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
			UWAGA: Niektóre dendryty kończyły się dalej od punktów początkowych, w których ścieżka była podzielona na mniejsze segmenty. Segmenty zostały połączone, aby zapewnić kompletną ścieżkę dla znacznika.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po utworzeniu ścieżki wróć do nowego punktu, w którym znajdują się gałęzie. Na nowej ścieżce można budować; w oknie "Wszystkie ścieżki" pojawią się wartości długości wszystkich ścieżek (Rysunek 3). Zapisz plik śledzenia i kontynuuj z niedokończonymi śladami, jak pokazano na rysunku Rysunek 2.</li>
		<li>Wyeksportuj dane o długości dendrytów, klikając "Plik | Eksportuj jako *.cvs" w oknie "Wtyczka". Następnie zsumuj wszystkie długości ścieżek i wyeksportuj dane do oprogramowania do analizy danych/arkusza kalkulacyjnego. (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powierzchnia neuronów da
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie do rysowania odręcznego w oknie "Fiji ImageJ". Prześledź ścieżkę, a następnie połącz punkty końcowe. Z menu "Analizuj" wybierz "Ustaw pomiary | Obszar." Kliknij "zmierz" w menu "Analizuj". Wynik pojawi się w nowym polu z wartością dla wybranego obszaru (Rysunek 4). Skopiuj go do oprogramowania do analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowita liczba rozgałęzień i struktura rozgałęzień neuronów da
	<ol>
		<li>Oblicz całkowitą liczbę gałęzi, otwierając "Analiza", a następnie "Renderuj | Analyze Skeletonized Paths" w oknie śledzenia wtyczki (Rysunek 5). 
		UWAGA: Struktura altany jest sumą poziomów gałęzi. Ścieżka została zdefiniowana między ciałem komórki a końcówkami dendrytów, a jedna ścieżka może zawierać wiele rozgałęzień, takich jak pierwotne altany to dendryty z ciała komórki neuronu. Altany drugorzędne są gałęziami od altany pierwszorzędowej i tak dalej z altanami trzeciorzędowymi, czwartorzędowymi i pięciorzędowymi. Struktura rozgałęzień dendrytowych jest oddzielona w zależności od poziomów rozgałęzień. Na przykład podstawowy % to liczba gałęzi podzielona przez całkowitą liczbę rozgałęzień i tak dalej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li>
<li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li>
<li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li>
<li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li>
<li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+through+Dishevelled%2C+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li>
<li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li>
<li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase%2FFurry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li>
<li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li>
<li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li>
<li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).</li>
<li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+reversal+of+Alzheimer%27s+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li>
<li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Neurite+Tracer%3A+open+source+software+for+reconstruction%2C+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dendryty, które unerwiają naskórek, są regionami wejściowymi neuronów, a ich morfologie określają, w jaki sposób informacje są odbierane i przetwarzane przez poszczególne neurony. Rozwój morfologii dendrytów odzwierciedla modulację genów organizacji dendrytów. Larwy Drosophila da neuron obwodowego układu nerwowego są ważnym modelem do badania rozwoju dendrytów ze względu na: 1) funkcjonalne podobieństwo do ssaków 11,12; 2) cztery wyróżnienia klasowe opar...

Dendryty, które są rozgałęzionymi wypustkami neuronu, pokrywają pole, które obejmuje sensoryczne i synaptyczne wejścia neuronu od innych neuronów1,2. Dendryty są ważnym składnikiem tworzenia synaps i odgrywają kluczową rolę w integracji wejść synaptycznych, a także w propagowaniu stymulacji elektrochemicznej w neuronach. Arboryzacja dendrytyczna (da) to proces, w którym neurony tworzą nowe drzewa i gałęzie dendrytyczne, tworząc nowe synapsy. Rozwój i morfologia da, takie jak gęstość gałęzi i wzorce grupowania, wynikają z wieloetapowych procesów biologicznych i są silnie skorelowane z funkcją neuronów. Celem tego protokołu jest zapewnienie metody analizy ilościowej złożoności dendrytrycznej arboryzacji neuronalnej u Drosophila. 
Złożoność dendrytów determinuje typy synaptyczne, połączenia i dane wejściowe z neuronów partnerskich. Wzorce rozgałęzień i gęstość dendrytów biorą udział w przetwarzaniu sygnałów, które zbiegają się w polu dendrytycznym3,4. Dendryty mają elastyczność w dostosowywaniu się w rozwoju. Na przykład sygnalizacja synaptyczna ma wpływ na organizację dendrytów w neuronach somatosensorycznych w fazie rozwojowej oraz w dojrzałym układzie nerwowym5. Ustanowienie połączeń neuronalnych opiera się na morfogenezie i dojrzewaniu dendrytów. Wady rozwojowe dendrytów są związane z upośledzeniem funkcji neuronów. Badania wykazały, że nieprawidłowość morfogenezy neuronów da może przyczyniać się do etiologii wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD), choroby Parkinsona (PD), choroby Huntingtona (HD) i choroby Lou Gehriga/stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)6,7,8. Zmiany synaptyczne pojawiają się we wczesnym stadium choroby Alzheimera, w połączeniu ze spadkiem i upośledzeniem funkcji neuronów7,8. Jednak szczegóły dotyczące tego, w jaki sposób patologia dendrytów przyczynia się do patogenezy tych chorób neurodegeneracyjnych, pozostają nieuchwytne.
Rozwój dendrytów jest regulowany przez geny, które kodują złożoną sieć regulatorów, takich jak rodzina białek Wnt9,10, czynniki transkrypcyjne i ligandy na powierzchni komórki receptory11,12. Neurony Drosophila da składają się z czterech klas (klasa I, II, III, IV), z których neurony klasy IV da mają najbardziej złożone wzorce rozgałęzień i zostały wykorzystane jako potężny system eksperymentalny do lepszego zrozumienia morfogenezy13,14. Podczas wczesnej morfogenezy nadekspresja i/lub wyciszenie RNAi genów w neuronach da klasy IV powoduje zmiany we wzorcach rozgałęzień i przycinanie dendrytów13. Ważne jest opracowanie praktycznej metody analizy ilościowej neuronalnej arboryzacji dendrytycznej.
Wcześniej wykazaliśmy, że wyciszenie ortologa Drosophila SOX5, Sox102F, doprowadziło do skrócenia dendrytów neuronów da i zmniejszenia złożoności neuronów da klasy IV15. W niniejszym artykule przedstawiono procedurę analizy ilościowej złożoności neuronalnej arborycji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila. Protokół ten, zaadaptowany z poprzednio opisanej metodologii, zapewnia krótką metodę oznaczania rozwoju neuronów czuciowych. Ilustruje solidne etykietowanie obrazu i neuron da w ścianie ciała larw trzeciego stadium rozwojowego16,17,18,19. Jest to cenny protokół dla badaczy, którzy chcą zbadać NDAC i różnice rozwojowe in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>Gibco Life Sciences</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td> <td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 baza i utwardzacz z elastomeru silikonowego</td><td>Dow Corning Corportation</td><td>3097366-0516; 3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci&nbsp;</td><td>CVS</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki&nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5611</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów&nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-6082-25</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-188-52</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendryty są rozgałęzionymi wypustkami neuronu, a morfologia dendrytyczna odzwierciedla organizację synaptyczną podczas rozwoju układu nerwowego. Arboryzacja neuronalna neuronów dendrytycznych (da) larw Drosophila jest idealnym modelem do badania morfogenezy dendrytów nerwowych i funkcji genów w rozwoju układu nerwowego. Istnieją cztery klasy neuronów da. Klasa IV jest najbardziej złożona z rozgałęzionym wzorem, który obejmuje prawie całą powierzchnię ściany ciała larwy. Wcześniej scharakteryzowaliśmy wpływ wyciszenia ortologa Drosophila SOX5 na złożoność neuronalnej arboryzacji dendrytycznej klasy IV (NDAC) za pomocą czterech parametrów: długości dendrytów, powierzchni pokrycia dendrytami, całkowitej liczby gałęzi i struktury rozgałęzień. Protokół ten przedstawia przebieg analizy ilościowej NDAC, składający się z sekcji larw, mikroskopii konfokalnej i procedur analizy obrazu przy użyciu oprogramowania ImageJ. Dalsze badania nad rozwojem neuronalnym da i jego mechanizmami leżącymi u jego podstaw pozwolą lepiej zrozumieć funkcje neuronów i dostarczą wskazówek na temat podstawowych przyczyn zaburzeń neurologicznych i neurorozwojowych.

Dendryty neuronów da oznakowano poprzez koekspresję GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) w somach i drzewach dendrytycznych neuronów da w celu analizy obrazowania fluorescencyjnego GFP. Morfologię dendrytów neuronów da obrazowano za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego (Rysunek 2).
Dendryty neuronów da śledzono przy użyciu oprogramowania Fiji ImageJ. Plik ten posłużył do oszacowania długości dendrytów (<st...

Ten protokół skupia się na ilościowej analizie złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila, która może być wykorzystana do badań morfogenezy dendrytycznej.

Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu genu SOX5 na złożoność neuronów arboryzacji dendrytycznej podczas rozwoju neuronalnego u Drosophila. Metoda ta może pomóc w badaniu morfogenezy neurodendrytów i funkcji genów w rozwoju układu nerwowego, aby lepiej zrozumieć geny chorób neurodegeneracyjnych. Ostatecznie technika ta zapewnia ilościową analizę złożoności dendrytów, która może być stosowana w wielu różnych typach neurodendrytów.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku genetycznego mechanizmu choroby neurodegeneracyjnej, ponieważ mutacja jest kluczem do zrozumienia funkcji genów. Zakładanie krzyżówek UAS-GFP; ppk-GAL4 z muchami szczepu UAS-Sox102F-RNAi lub kontrolami W118. Hoduj muchy w standardowych warunkach w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Za około pięć do sześciu dni użyj kleszczy, aby ostrożnie zebrać larwy trzeciego stadium do sekcji. Umieścić larwę w naczyniu preparacyjnym wykonanym na bazie elastomeru silikonowego i na szalce Petriego do hodowli tkankowej. Następnie umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym.Teraz przypnij ogon larwy, aby odsłonić linię środkową. Następnie przypnij haczyki do ust larwy tak, aby grzbietowa strona larwy była skierowana do góry. Teraz dodaj 200 mikrolitrów PBS do naczynia, aby zanurzyć larwę w roztworze.Następnie odetnij ogon i pysk larwy małymi nacięciami. Następnie rozetnij larwę wzdłuż grzbietowej linii środkowej i między dwiema tchawicami, przechodząc od ogona do rostralu. Następnie umieść szpilkę w każdym z czterech rogów ciała, tak aby ciało leżało płasko.Teraz przymocuj ścianę ciała larwy w czterech procentach PFA przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj larwę PBS trzy razy przez pięć minut na pranie. Po umyciu usuń szpilki i przenieś chusteczkę na szkiełko podstawowe.Następnie zanurz chusteczkę w podłożu mocującym zapobiegającym blaknięciu i zamocuj ją za pomocą szkiełka nakrywkowego. Pozostaw zamontowaną chusteczkę do wyschnięcia na powietrzu przez godzinę przed uszczelnieniem szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Przechowuj te szkiełka w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Rejestruj obrazy z serii Z za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu obiektywu 20X. Najpierw ustaw zakres kroków z tak, aby obejmował wszystkie neurony DA w ścianie ciała larwy i ustaw rozmiar kroku na pół mikrometra. Następnie zapisz obrazy jako pliki TIF lub ND2 do przetworzenia.Następnie oceń liczbę i morfologię dendrytów na neuronach DA. Zacznij od oceny ich długości. Po pierwsze, w Fiji ImageJ, w razie potrzeby podziel obrazy na osobne kanały.Ocenie podlega jedynie kanał GFP. Następnie wykonaj projekcję z. W nowym oknie wybierz maksymalną intensywność dla typu projekcji, a następnie wybierz plasterki początkowe i końcowe.Następnie kliknij przycisk OK, aby utworzyć obraz z projekcją z wyraźnymi projekcjami dendrytowymi. Teraz prześledź neuryty za pomocą narzędzia wtyczki. Najpierw udaj się do somy interesującego neuronu i kliknij w miejsce, w którym jeden dendryt wyłania się z ciała komórki.Następnie kliknij na czubek tego dendrytu. Jeśli niebieska linia łącząca te dwa punkty biegnie przez całą długość neurytu, naciśnij Y, aby tak. Następnie, jeśli ta linia pasuje do pełnej ścieżki neurytu, kliknij pełną ścieżkę.Jeśli linia nie pasuje do ścieżki, kliknij punkty dalej wzdłuż tego neurytu, aby zagiąć ścieżkę w wiele segmentów linii, które będą pasować do długości neurytu. Następnie kliknij pełną ścieżkę i kontynuuj zaznaczanie ścieżki dla następnego neurytu. Po wykonaniu wszystkich ścieżek śledzenia wybierz opcję Analiza, Zmierz ścieżki, aby wyeksportować ścieżki do pliku CSV.Dane te służą do obliczania i uśredniania wartości długości ścieżek do analizy. Następnie oblicz pole powierzchni neuronu. Najpierw wybierz narzędzie do rysowania odręcznego z okna Fiji ImageJ.Następnie połącz punkty końcowe neuronu zainteresowania. Następnie wybierz opcję Zmierz w oknie Analizuj. Wynik pojawi się w nowym polu z wartością dla wybranego obszaru.Skopiuj tę wartość do oprogramowania do analizy danych. Na koniec oblicz łączną liczbę gałęzi za pomocą wtyczki Analyze Skeletonized Paths. Dendryty neuronów DA zostały oznaczone przez nadekspresję GFP w ich somach i dendrytach w celu analizy obrazowania kwiatowości GFP.Morfologię dendrytów zobrazowano za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Dendryty neuronów DA zostały prześledzone zgodnie z opisem. Plik posłużył do oszacowania długości dendrytów.Wyciszenie Sox102F w neuronach DA u larwy trzeciego stadium rozwojowego doprowadziło do znacznego zmniejszenia całkowitej liczby dendrytów o długości około połowy długości gałęzi i o prostszej strukturze, wykazując tylko połowę liczby gałęzi. Logicznie rzecz biorąc, doprowadziło to do zmniejszenia powierzchni altany. Protokół ten zapewnia szybką metodę oceny rozwoju neuronów czuciowych DA.Próbując wykonać tę procedurę, upewnij się, że wykonałeś wystarczającą liczbę zdjęć każdej grupy neuronów DA, aby uzyskać dobre pokrycie. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza dendrytów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące rozwoju dendrytów. Od momentu powstania technika ta pomogła naukowcom w dziedzinie neuronauk w wyciąganiu wniosków na temat chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, przy użyciu systemów modelowych.

quantitative-analysis-neuronal-dendritic-arborization-complexity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Źródło: Ting, C., et al., Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje procedurę przygotowania mózgu Drosophila, przechwytywania poziomych i czołowych stosów obrazów dendrytów rdzenia znakowanych GFP pod mikroskopem konfokalnym oraz tworzenia rekonstrukcji 3D w celu analizy ich morfologii w warstwach i kolumnach.

Analiza morfologii dendrytycznej w warstwach i kolumnach rdzenia Drosophila

Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Dwa algorytmy analizy obrazu, "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" zostały stworzone, aby automatycznie określić ilościowo dziewięć cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Dwa algorytmy wysokoprzepustowej i wieloparametrycznej kwantyfikacji morfologii połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila

Tutaj pokazujemy, jak analizować dendrytyczne kierowanie neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach. Przepływ pracy obejmuje technikę obrazowania w podwójnym widoku w celu poprawy jakości obrazu oraz narzędzia obliczeniowe do śledzenia, rejestrowania trzpieni dendrytycznych do układu kolumn referencyjnych oraz do analizy struktur dendrytycznych w przestrzeni 3D.

Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach

Tutaj prezentujemy szczegółowo protokół Golgi-Cox. Ta niezawodna metoda barwienia tkanek pozwala na wysokiej jakości ocenę cytoarchitektury w hipokampie i w całym mózgu, przy minimalnym rozwiązywaniu problemów.

Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

Tutaj opisujemy metodę, którą zastosowaliśmy do zobrazowania wysoce ruchliwych filopodiów dendrytycznych w żywym przygotowaniu mózgu larwy Drosophila, oraz opracowany przez nas protokół do ilościowego oznaczania zestawów danych obrazowania 3D w celu ilościowej oceny dynamiki dendrytów w rozwijających się neuronach.

Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila

Poznaj metodę ilościowej analizy złożoności arboryzacji dendrytycznej u Drosophila w kontekście rozwoju neuronów. Technika ta umożliwia badanie wpływu genu SOX5 na morfogenezę dendrytów.

Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów