Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu genu SOX5 na złożoność neuronów arboryzacji dendrytycznej podczas rozwoju neuronalnego u Drosophila. Metoda ta może pomóc w badaniu morfogenezy neurodendrytów i funkcji genów w rozwoju układu nerwowego, aby lepiej zrozumieć geny chorób neurodegeneracyjnych. Ostatecznie technika ta zapewnia ilościową analizę złożoności dendrytów, która może być stosowana w wielu różnych typach neurodendrytów.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku genetycznego mechanizmu choroby neurodegeneracyjnej, ponieważ mutacja jest kluczem do zrozumienia funkcji genów. Zakładanie krzyżówek UAS-GFP; ppk-GAL4 z muchami szczepu UAS-Sox102F-RNAi lub kontrolami W118. Hoduj muchy w standardowych warunkach w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Za około pięć do sześciu dni użyj kleszczy, aby ostrożnie zebrać larwy trzeciego stadium do sekcji. Umieścić larwę w naczyniu preparacyjnym wykonanym na bazie elastomeru silikonowego i na szalce Petriego do hodowli tkankowej. Następnie umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym

Teraz przypnij ogon larwy, aby odsłonić linię środkową. Następnie przypnij haczyki do ust larwy tak, aby grzbietowa strona larwy była skierowana do góry. Teraz dodaj 200 mikrolitrów PBS do naczynia, aby zanurzyć larwę w roztworze.

Następnie odetnij ogon i pysk larwy małymi nacięciami. Następnie rozetnij larwę wzdłuż grzbietowej linii środkowej i między dwiema tchawicami, przechodząc od ogona do rostralu. Następnie umieść szpilkę w każdym z czterech rogów ciała, tak aby ciało leżało płasko.

Teraz przymocuj ścianę ciała larwy w czterech procentach PFA przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj larwę PBS trzy razy przez pięć minut na pranie. Po umyciu usuń szpilki i przenieś chusteczkę na szkiełko

Następnie zanurz chusteczkę w podłożu mocującym zapobiegającym blaknięciu i zamocuj ją za pomocą szkiełka nakrywkowego. Pozostaw zamontowaną chusteczkę do wyschnięcia na powietrzu przez godzinę przed uszczelnieniem szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Przechowuj te szkiełka w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Rejestruj obrazy z serii Z za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu obiektywu 20X. Najpierw ustaw zakres kroków z tak, aby obejmował wszystkie neurony DA w ścianie ciała larwy i ustaw rozmiar kroku na pół mikrometra. Następnie zapisz obrazy jako pliki TIF lub ND2 do przetworzenia.

Następnie oceń liczbę i morfologię dendrytów na neuronach DA. Zacznij od oceny ich długości. Po pierwsze, w Fiji ImageJ, w razie potrzeby podziel obrazy na osobne kanały.

Ocenie podlega jedynie kanał GFP. Następnie wykonaj projekcję z. W nowym oknie wybierz maksymalną intensywność dla typu projekcji, a następnie wybierz plasterki początkowe i końcowe.

Następnie kliknij przycisk OK, aby utworzyć obraz z projekcją z wyraźnymi projekcjami dendrytowymi. Teraz prześledź neuryty za pomocą narzędzia wtyczki. Najpierw udaj się do somy interesującego neuronu i kliknij w miejsce, w którym jeden dendryt wyłania się z ciała komórki.

Następnie kliknij na czubek tego dendrytu. Jeśli niebieska linia łącząca te dwa punkty biegnie przez całą długość neurytu, naciśnij Y, aby tak. Następnie, jeśli ta linia pasuje do pełnej ścieżki neurytu, kliknij pełną ścieżkę.

Jeśli linia nie pasuje do ścieżki, kliknij punkty dalej wzdłuż tego neurytu, aby zagiąć ścieżkę w wiele segmentów linii, które będą pasować do długości neurytu. Następnie kliknij pełną ścieżkę i kontynuuj zaznaczanie ścieżki dla następnego neurytu. Po wykonaniu wszystkich ścieżek śledzenia wybierz opcję Analiza, Zmierz ścieżki, aby wyeksportować ścieżki do pliku CSV.

Dane te służą do obliczania i uśredniania wartości długości ścieżek do analizy. Następnie oblicz pole powierzchni neuronu. Najpierw wybierz narzędzie do rysowania odręcznego z okna Fiji ImageJ.

Następnie połącz punkty końcowe neuronu zainteresowania. Następnie wybierz opcję Zmierz w oknie Analizuj. Wynik pojawi się w nowym polu z wartością dla wybranego obszaru.

Skopiuj tę wartość do oprogramowania do analizy danych. Na koniec oblicz łączną liczbę gałęzi za pomocą wtyczki Analyze Skeletonized Paths. Dendryty neuronów DA zostały oznaczone przez nadekspresję GFP w ich somach i dendrytach w celu analizy obrazowania kwiatowości GFP.

Morfologię dendrytów zobrazowano za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Dendryty neuronów DA zostały prześledzone zgodnie z opisem. Plik posłużył do oszacowania długości dendrytów.

Wyciszenie Sox102F w neuronach DA u larwy trzeciego stadium rozwojowego doprowadziło do znacznego zmniejszenia całkowitej liczby dendrytów o długości około połowy długości gałęzi i o prostszej strukturze, wykazując tylko połowę liczby gałęzi. Logicznie rzecz biorąc, doprowadziło to do zmniejszenia powierzchni altany. Protokół ten zapewnia szybką metodę oceny rozwoju neuronów czuciowych DA.

Próbując wykonać tę procedurę, upewnij się, że wykonałeś wystarczającą liczbę zdjęć każdej grupy neuronów DA, aby uzyskać dobre pokrycie. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza dendrytów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące rozwoju dendrytów. Od momentu powstania technika ta pomogła naukowcom w dziedzinie neuronauk w wyciąganiu wniosków na temat chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, przy użyciu systemów modelowych.