Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila
7 stycznia 2019
Ten protokół skupia się na ilościowej analizie złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila, która może być wykorzystana do badań morfogenezy dendrytycznej.
Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu genu SOX5 na złożoność neuronów arboryzacji dendrytycznej podczas rozwoju neuronalnego u Drosophila. Metoda ta może pomóc w badaniu morfogenezy neurodendrytów i funkcji genów w rozwoju układu nerwowego, aby lepiej zrozumieć geny chorób neurodegeneracyjnych. Ostatecznie technika ta zapewnia ilościową analizę złożoności dendrytów, która może być stosowana w wielu różnych typach neurodendrytów.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku genetycznego mechanizmu choroby neurodegeneracyjnej, ponieważ mutacja jest kluczem do zrozumienia funkcji genów. Zakładanie krzyżówek UAS-GFP; ppk-GAL4 z muchami szczepu UAS-Sox102F-RNAi lub kontrolami W118. Hoduj muchy w standardowych warunkach w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Za około pięć do sześciu dni użyj kleszczy, aby ostrożnie zebrać larwy trzeciego stadium do sekcji. Umieścić larwę w naczyniu preparacyjnym wykonanym na bazie elastomeru silikonowego i na szalce Petriego do hodowli tkankowej. Następnie umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym
.Teraz przypnij ogon larwy, aby odsłonić linię środkową. Następnie przypnij haczyki do ust larwy tak, aby grzbietowa strona larwy była skierowana do góry. Teraz dodaj 200 mikrolitrów PBS do naczynia, aby zanurzyć larwę w roztworze.
Następnie odetnij ogon i pysk larwy małymi nacięciami. Następnie rozetnij larwę wzdłuż grzbietowej linii środkowej i między dwiema tchawicami, przechodząc od ogona do rostralu. Następnie umieść szpilkę w każdym z czterech rogów ciała, tak aby ciało leżało płasko.
Teraz przymocuj ścianę ciała larwy w czterech procentach PFA przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj larwę PBS trzy razy przez pięć minut na pranie. Po umyciu usuń szpilki i przenieś chusteczkę na szkiełko
podstawowe.Następnie zanurz chusteczkę w podłożu mocującym zapobiegającym blaknięciu i zamocuj ją za pomocą szkiełka nakrywkowego. Pozostaw zamontowaną chusteczkę do wyschnięcia na powietrzu przez godzinę przed uszczelnieniem szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Przechowuj te szkiełka w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Rejestruj obrazy z serii Z za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu obiektywu 20X. Najpierw ustaw zakres kroków z tak, aby obejmował wszystkie neurony DA w ścianie ciała larwy i ustaw rozmiar kroku na pół mikrometra. Następnie zapisz obrazy jako pliki TIF lub ND2 do przetworzenia.
Następnie oceń liczbę i morfologię dendrytów na neuronach DA. Zacznij od oceny ich długości. Po pierwsze, w Fiji ImageJ, w razie potrzeby podziel obrazy na osobne kanały.
Ocenie podlega jedynie kanał GFP. Następnie wykonaj projekcję z. W nowym oknie wybierz maksymalną intensywność dla typu projekcji, a następnie wybierz plasterki początkowe i końcowe.
Następnie kliknij przycisk OK, aby utworzyć obraz z projekcją z wyraźnymi projekcjami dendrytowymi. Teraz prześledź neuryty za pomocą narzędzia wtyczki. Najpierw udaj się do somy interesującego neuronu i kliknij w miejsce, w którym jeden dendryt wyłania się z ciała komórki.
Następnie kliknij na czubek tego dendrytu. Jeśli niebieska linia łącząca te dwa punkty biegnie przez całą długość neurytu, naciśnij Y, aby tak. Następnie, jeśli ta linia pasuje do pełnej ścieżki neurytu, kliknij pełną ścieżkę.
Jeśli linia nie pasuje do ścieżki, kliknij punkty dalej wzdłuż tego neurytu, aby zagiąć ścieżkę w wiele segmentów linii, które będą pasować do długości neurytu. Następnie kliknij pełną ścieżkę i kontynuuj zaznaczanie ścieżki dla następnego neurytu. Po wykonaniu wszystkich ścieżek śledzenia wybierz opcję Analiza, Zmierz ścieżki, aby wyeksportować ścieżki do pliku CSV.
Dane te służą do obliczania i uśredniania wartości długości ścieżek do analizy. Następnie oblicz pole powierzchni neuronu. Najpierw wybierz narzędzie do rysowania odręcznego z okna Fiji ImageJ.
Następnie połącz punkty końcowe neuronu zainteresowania. Następnie wybierz opcję Zmierz w oknie Analizuj. Wynik pojawi się w nowym polu z wartością dla wybranego obszaru.
Skopiuj tę wartość do oprogramowania do analizy danych. Na koniec oblicz łączną liczbę gałęzi za pomocą wtyczki Analyze Skeletonized Paths. Dendryty neuronów DA zostały oznaczone przez nadekspresję GFP w ich somach i dendrytach w celu analizy obrazowania kwiatowości GFP.
Morfologię dendrytów zobrazowano za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Dendryty neuronów DA zostały prześledzone zgodnie z opisem. Plik posłużył do oszacowania długości dendrytów.
Wyciszenie Sox102F w neuronach DA u larwy trzeciego stadium rozwojowego doprowadziło do znacznego zmniejszenia całkowitej liczby dendrytów o długości około połowy długości gałęzi i o prostszej strukturze, wykazując tylko połowę liczby gałęzi. Logicznie rzecz biorąc, doprowadziło to do zmniejszenia powierzchni altany. Protokół ten zapewnia szybką metodę oceny rozwoju neuronów czuciowych DA.
Próbując wykonać tę procedurę, upewnij się, że wykonałeś wystarczającą liczbę zdjęć każdej grupy neuronów DA, aby uzyskać dobre pokrycie. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza dendrytów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące rozwoju dendrytów. Od momentu powstania technika ta pomogła naukowcom w dziedzinie neuronauk w wyciąganiu wniosków na temat chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, przy użyciu systemów modelowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół ilościowej analizy złożoności ułożenia dendrytów neuronowych (NDAC) u Drosophila, ze skupieniem na wpływie genu SOX5 na rozwój neuronowy. Badając morfogenezę dendrytów, ta technika ma na celu zwiększenie zrozumienia mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Rozwój neuronowy
- Genetyka
Tło
- Rozumienie złożoności ułożenia dendrytów jest kluczowe w badaniach neurorozwojowych.
- Gen SOX5 odgrywa istotną rolę w rozwoju neuronowym.
- Drosophila służy jako ważny organizm modelowy do badania funkcji genetycznych w układzie nerwowym.
- Wgląd w morfogenezę dendrytów może prowadzić do postępów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Cel badania
- Ocenić zmiany morfologiczne w ułożeniu dendrytów z powodu manipulacji genem SOX5.
- Umożliwić ilościową porównanie złożoności dendrytów w różnych kontekstach genetycznych.
- Dostarczyć ram dla badania rozwoju neuronowego i chorób neurogennych.
Zastosowane metody
- Wykorzystano larwy Drosophila w trzecim stadium do sekcjonowania i obrazowania.
- Zastosowano mikroskopio skanującą konfokalną do szczegółowego obrazowania struktur dendrytowych.
- Włączyło to fiksację tkanek i obrazowanie fluorescencji GFP dla analizy.
- Szczegółowe kroki sekcjonowania larw i późniejszej obróbki w celu uwidocznienia złożoności dendrytów.
- Analiza danych obejmowała śledzenie dendrytów i obliczanie długości, powierzchni i złożoności rozgałęzień.
Główne wyniki
- Wyciszenie SOX5 spowodowało znaczne zmniejszenie liczby i długości dendrytów.
- Zauważalne zmiany w strukturze dendrytów, wskazując na krytyczną rolę genu w rozwoju dendrytów.
- Dostarczyło metody ilościowej oceny zmian morfologicznych w neuronach DA.
- Wyniki podkreślają związek między manipulacją genetyczną a złożonością dendrytów.
Wnioski
- Ten protokół umożliwia głębsze zrozumienie rozwoju dendrytów i jego implikacji dla chorób neurodegeneracyjnych.
- Podkreśla znaczenie genu SOX5 w architekturze neuronowej.
- Prosuwa potencjalne strategie terapeutyczne poprzez wyjaśnienie mechanizmów morfogenezy dendrytów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of dendritic arborization complexity in Drosophila provides a robust framework for interrogating gene function and neuronal morphogenesis in early discovery neuroscience. This workflow enables predictive confidence in linking genetic perturbations, such as SOX5 silencing, to measurable changes in neuronal architecture, supporting mechanistic de-risking at the target validation stage. The approach is directly relevant for portfolio decisions in neurodevelopmental and neurodegenerative disease research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of neurodevelopmental gene targets through quantitative morphological endpoints.
- Supports mechanistic de-risking by linking genetic manipulation to neuronal phenotype changes.
- Facilitates triage of candidate targets based on measurable impact on dendritic complexity.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized imaging and analysis workflows for reproducible quantification of neuronal morphology.
- Generates quantitative outputs—dendrite length, surface area, and branch number—suitable for downstream screening.
- Prepares validated biological systems for compound or genetic modifier evaluation in scalable formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological phenotypes with disease-relevant neuronal dysfunction for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical model validation in neurodegeneration research.
- Enables risk-adjusted advancement of targets with demonstrated impact on neuronal structure.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting hypothesis testing and mechanistic validation in neurobiology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of gene function in neuronal morphogenesis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative morphological readouts for comparative analysis.
- Analytics: Provides statistical outputs—length, area, branch count—for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects genetic perturbation to disease-relevant neuronal phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse neurogenetic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neurogenetics.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by focusing on validated neuronal phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental and neurodegenerative targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging, neuronal dissection, and quantitative image analysis.
- Depends on access to advanced microscopy and computational analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and data processing protocols.
- Adaptable to other genetic backgrounds or neuronal classes with protocol optimization.
- Practical limitations include imaging throughput and potential variability in sample preparation.
