Izolacja elementów regulatorowych wspomagana formaldehydem w celu pomiaru dostępności chromatyny w komórkach ssaków

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie dostępności chromatyny w locus genetycznym poprzez kowalencyjne sieciowanie DNA z powiązanymi białkami, a następnie oczyszczanie i kwantyfikację wolnego DNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chromatyny, ponieważ można określić dostępność DNA, niezależnie od typu komórki w komórkach nieleczonych, a także w komórkach poddawanych przebudowie chromatyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona użycia enzymów do rozszczepienia DNA lub przeciwciał, które muszą być miareczkowane dla każdego środowiska doświadczalnego.

Protokół ten ma tę dodatkową zaletę, że nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu poza Sonicatorem. Procedurę zademonstrują Olesja Ritter i Tabea Riedlinger, które są doktorantkami z mojego laboratorium. Aby rozpocząć protokół, dodaj formaldehyd bezpośrednio do pożywki wzrostowej komórek, które zostały wysiane dzień wcześniej, aby osiągnąć końcowe stężenie 1% objętości.

Inkubować pożywkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ręcznie obracać płytki co dwie minuty. Następnie dodaj glicynę do końcowego stężenia 0,125 mola, aby ugasić formaldehyd. Inkubuj roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ubijaj go co dwie minuty.

Zassaj pożywkę, a następnie ostrożnie dodaj lodowaty PBS na bok naczynia, aby umyć komórki. Zassać pożywkę i ostrożnie powtórzyć pranie dwukrotnie. Po trzecim praniu ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze lodowatego PBS i w razie potrzeby użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki.

Przenieś je do 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej na lodzie. Odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza w schłodzonej wirówce stołowej. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze bufora do lizy FAIRE, kilkakrotnie ostrożnie pipetując w górę iw dół. Inkubować komórki przez 20 minut na lodzie. Po inkubacji należy poddać sonifikacji usieciowanego DNA, aby podzielić się nim do średniej wielkości od 200 do 300 par zasad i schłodzić próbki podczas sonikacji, aby uniknąć podgrzewania próbki.

Fragmentacja DNA ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu, ponieważ rozmiar fragmentów wpływa na czułość roztworu całej techniki, dlatego ważne jest, aby wcześniej dokładnie ustalić warunki sonikacji i sprawdzać rozmiar fragmentów chromatyny w każdym eksperymencie. Odwirować próbkę przez 15 minut i 13 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki reakcyjnej.

Podzielić próbki na podwielokrotności o objętości 100 mikrolitrów. Użyj podwielokrotności o pojemności 100 mikrolitrów, aby odwrócić usieciowanie krzyżowe i użyć jako odniesienia dla całkowitego DNA. Dodać 10 mikrolitrów RNazy A i inkubować próbkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów proteinazy K. Użyj programowalnego termobloku, aby inkubować próbkę przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie przez sześć godzin w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby rozszczepić białka i odwrócić wiązania krzyżowe. Otrzymać nową porcję o pojemności 100 mikrolitrów, dodać 10 mikrolitrów RNazy A i inkubować próbkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji należy równolegle postępować z próbką nieusieciowaną i próbką odsieciowaną z poprzedniej sekcji.

Dodaj H2O, aby osiągnąć końcową objętość 300 mikrolitrów. Następnie dodaj 300 mikrolitrów fenolowo-chloroformowo-izoamylowego alkoholu do dygestoria i energicznie wiruj. Odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

Następnie ostrożnie przenieś 280 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej. Upewnij się, że nie bierzesz żadnych zanieczyszczeń z interfazy, która zawiera również białka, a pozostałą dolną fazę wyrzuć jako odpad rozpuszczalnika organicznego. Powtórzyć zabieg i ostrożnie przenieść 270 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej.

Dodaj 270 mikrolitrów chloroformu do dygestorium i energicznie wiruj. Odwirować próbkę. Po odwirowaniu ostrożnie przenieść 250 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej, uważając, aby nie przenosić żadnych zanieczyszczeń z interfazy.

Pozostałą próbkę należy wyrzucić jako odpad rozpuszczalnika organicznego. Następnie dodaj 25 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu, 250 mikrolitrów izopropanolu i dodaj pięć mikrolitrów glikogenu jako nośnika DNA. Odwróć probówki i inkubuj je w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji odwirować próbkę, aby wytrącić DNA. Następnie przemyj osad DNA 400 mikrolitrami etanolu o stężeniu 70% objętości i odwiruj próbkę. Ostrożnie zassać supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po wyschnięciu osadu należy go ponownie zawiesić w 100 mikrolitrach buforu TE. Inkubuj nieusieciowaną wolną próbkę DNA przez cztery godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby usunąć wiązania krzyżowe między DNA. Na koniec określ ilościowo ilość DNA za pomocą spektrofotometru i uruchom małą porcję, aby sprawdzić rozmiar fragmentu na żelu agarozowym o stężeniu 2% wagowym.

Komórki HeLA stymulowano TNF przez godzinę i analizowano za pomocą FAIRE. Stosunek między wolnym a całkowitym DNA określono dla promotora ACTB, genu kodującego beta-aktynę i kontrolę pozytywną, region heterochromatyny na chromosomie 12, kontrolę negatywną i promotor IL8. Wygenerowano żel barwiony bromkiem etydyny o różnym czasie sonikacji, który wskazuje, że po 20 minutach sonikacji uzyskano optymalną wielkość chromatyny od 200 do 300 par zasad.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak głębokie sekwencjonowanie, w celu określenia dostępności chromatyny na poziomie całego genomu. Nie zapominaj, że praca z formaldehydem i chloroformem fenolowym może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem, noszenie rękawiczek i odpowiednia utylizacja odpadów, powinny być zapewnione podczas wykonywania tej procedury.