Izolacja elementów regulatorowych wspomagana formaldehydem w celu pomiaru dostępności chromatyny w komórkach ssaków
2 kwietnia 2018
Plastyczność architektury jądrowej jest kontrolowana przez dynamiczne mechanizmy epigenetyczne, w tym niekodujące RNA, metylację DNA, repozycjonowanie nukleosomów, a także skład i modyfikację histonów. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji elementów regulatorowych wspomaganej formaldehydem (FAIRE), który umożliwia określenie dostępności chromatyny w powtarzalny, niedrogi i prosty sposób.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie dostępności chromatyny w locus genetycznym poprzez kowalencyjne sieciowanie DNA z powiązanymi białkami, a następnie oczyszczanie i kwantyfikację wolnego DNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chromatyny, ponieważ można określić dostępność DNA, niezależnie od typu komórki w komórkach nieleczonych, a także w komórkach poddawanych przebudowie chromatyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona użycia enzymów do rozszczepienia DNA lub przeciwciał, które muszą być miareczkowane dla każdego środowiska doświadczalnego.
Protokół ten ma tę dodatkową zaletę, że nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu poza Sonicatorem. Procedurę zademonstrują Olesja Ritter i Tabea Riedlinger, które są doktorantkami z mojego laboratorium. Aby rozpocząć protokół, dodaj formaldehyd bezpośrednio do pożywki wzrostowej komórek, które zostały wysiane dzień wcześniej, aby osiągnąć końcowe stężenie 1% objętości.
Inkubować pożywkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ręcznie obracać płytki co dwie minuty. Następnie dodaj glicynę do końcowego stężenia 0,125 mola, aby ugasić formaldehyd. Inkubuj roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ubijaj go co dwie minuty.
Zassaj pożywkę, a następnie ostrożnie dodaj lodowaty PBS na bok naczynia, aby umyć komórki. Zassać pożywkę i ostrożnie powtórzyć pranie dwukrotnie. Po trzecim praniu ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze lodowatego PBS i w razie potrzeby użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki.
Przenieś je do 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej na lodzie. Odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza w schłodzonej wirówce stołowej. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant.
Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze bufora do lizy FAIRE, kilkakrotnie ostrożnie pipetując w górę iw dół. Inkubować komórki przez 20 minut na lodzie. Po inkubacji należy poddać sonifikacji usieciowanego DNA, aby podzielić się nim do średniej wielkości od 200 do 300 par zasad i schłodzić próbki podczas sonikacji, aby uniknąć podgrzewania próbki.
Fragmentacja DNA ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu, ponieważ rozmiar fragmentów wpływa na czułość roztworu całej techniki, dlatego ważne jest, aby wcześniej dokładnie ustalić warunki sonikacji i sprawdzać rozmiar fragmentów chromatyny w każdym eksperymencie. Odwirować próbkę przez 15 minut i 13 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki reakcyjnej.
Podzielić próbki na podwielokrotności o objętości 100 mikrolitrów. Użyj podwielokrotności o pojemności 100 mikrolitrów, aby odwrócić usieciowanie krzyżowe i użyć jako odniesienia dla całkowitego DNA. Dodać 10 mikrolitrów RNazy A i inkubować próbkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie dodaj 10 mikrolitrów proteinazy K. Użyj programowalnego termobloku, aby inkubować próbkę przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie przez sześć godzin w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby rozszczepić białka i odwrócić wiązania krzyżowe. Otrzymać nową porcję o pojemności 100 mikrolitrów, dodać 10 mikrolitrów RNazy A i inkubować próbkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji należy równolegle postępować z próbką nieusieciowaną i próbką odsieciowaną z poprzedniej sekcji.
Dodaj H2O, aby osiągnąć końcową objętość 300 mikrolitrów. Następnie dodaj 300 mikrolitrów fenolowo-chloroformowo-izoamylowego alkoholu do dygestoria i energicznie wiruj. Odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza.
Następnie ostrożnie przenieś 280 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej. Upewnij się, że nie bierzesz żadnych zanieczyszczeń z interfazy, która zawiera również białka, a pozostałą dolną fazę wyrzuć jako odpad rozpuszczalnika organicznego. Powtórzyć zabieg i ostrożnie przenieść 270 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej.
Dodaj 270 mikrolitrów chloroformu do dygestorium i energicznie wiruj. Odwirować próbkę. Po odwirowaniu ostrożnie przenieść 250 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej, uważając, aby nie przenosić żadnych zanieczyszczeń z interfazy.
Pozostałą próbkę należy wyrzucić jako odpad rozpuszczalnika organicznego. Następnie dodaj 25 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu, 250 mikrolitrów izopropanolu i dodaj pięć mikrolitrów glikogenu jako nośnika DNA. Odwróć probówki i inkubuj je w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji odwirować próbkę, aby wytrącić DNA. Następnie przemyj osad DNA 400 mikrolitrami etanolu o stężeniu 70% objętości i odwiruj próbkę. Ostrożnie zassać supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej.
Po wyschnięciu osadu należy go ponownie zawiesić w 100 mikrolitrach buforu TE. Inkubuj nieusieciowaną wolną próbkę DNA przez cztery godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby usunąć wiązania krzyżowe między DNA. Na koniec określ ilościowo ilość DNA za pomocą spektrofotometru i uruchom małą porcję, aby sprawdzić rozmiar fragmentu na żelu agarozowym o stężeniu 2% wagowym.
Komórki HeLA stymulowano TNF przez godzinę i analizowano za pomocą FAIRE. Stosunek między wolnym a całkowitym DNA określono dla promotora ACTB, genu kodującego beta-aktynę i kontrolę pozytywną, region heterochromatyny na chromosomie 12, kontrolę negatywną i promotor IL8. Wygenerowano żel barwiony bromkiem etydyny o różnym czasie sonikacji, który wskazuje, że po 20 minutach sonikacji uzyskano optymalną wielkość chromatyny od 200 do 300 par zasad.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak głębokie sekwencjonowanie, w celu określenia dostępności chromatyny na poziomie całego genomu. Nie zapominaj, że praca z formaldehydem i chloroformem fenolowym może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem, noszenie rękawiczek i odpowiednia utylizacja odpadów, powinny być zapewnione podczas wykonywania tej procedury.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół określania dostępności chromatyny z wykorzystaniem metody izolacji elementów regulacyjnych wspomaganej formaldehydem (FAIRE). Technika ta jest prosta, powtarzalna i nie wymaga specjalistycznego sprzętu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Epigenetyka
- Biologia chromatyny
Wstęp
- Dostępność chromatyny ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia regulacji genów.
- Dynamiczne mechanizmy epigenetyczne wpływają na architekturę jądra komórkowego.
- Istotną rolę odgrywają niekodujące RNA, metylacja DNA oraz modyfikacje histonów.
- Protokół FAIRE umożliwia analizę struktury chromatyny w różnych typach komórek.
Cel badania
- W celu określenia dostępności chromatyny w specyficznych loci genetycznych.
- Aby dostarczyć wiarygodną metodę badania dynamiki chromatyny.
- Aby ułatwić dalsze analizy genomowe po ocenie dostępności chromatyny.
Zastosowane metody
- Kowalencyjne sieciowanie DNA z powiązanymi białkami przy użyciu formaldehydu.
- Oczyszczanie i ilościowe oznaczenie wolnego DNA.
- Sonikacja w celu fragmentacji DNA do optymalnych rozmiarów niezbędnych do analizy.
- Zastosowanie ekstrakcji fenolowo-chloroformowej do oczyszczania próbek DNA.
Główne wyniki
- Pomyślne oznaczenie dostępności chromatyny w komórkach HeLa.
- Optymalne warunki sonikacji pozwalają na uzyskanie fragmentów DNA o długości 200-300 par zasad.
- Porównanie stosunków wolnego do całkowitego DNA w obrębie specyficznych promotorów genów.
- Wykazanie możliwości zastosowania metody w różnych układach eksperymentalnych.
Wnioski
- Protokół FAIRE jest cennym narzędziem do badania dostępności chromatyny.
- Można go przeprowadzić bez specjalistycznego sprzętu, a metoda ta jest kosztowo efektywna.
- Dalsze zastosowania obejmują sekwencjonowanie głębokie w celu analizy chromatyny w całym genomie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodny pomiar dostępności chromatyny ma kluczowe znaczenie dla wczesnej walidacji celów oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego w badaniach nad regulacją genów. Protokół FAIRE umożliwia niezależną od przeciwciał, ilościową ocenę specyficznych dla locus stanów chromatyny, co zwiększa pewność prognostyczną w procesach odkrywania i przesiewowych. Jego prostota operacyjna i powtarzalność ułatwiają integrację z potokami badawczymi w skali przedsiębiorstw w obszarze badań epigenetycznych i transkrypcyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę dostępności chromatyny w konkretnych loci genetycznych w celu wyjaśnienia mechanizmów regulacyjnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez rozróżnianie otwartych i skondensowanych regionów chromatyny bez błędu wynikającego z zastosowania przeciwciał.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie ilościowych, powtarzalnych danych o stanie chromatyny w różnych typach komórek i warunkach.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane profile dostępności chromatyny do dalszych analiz qPCR lub sekwencjonowania.
- Standaryzuje pomiar stanu chromatyny, ograniczając zmienność eksperymentalną i zwiększając powtarzalność.
- Umożliwia skalowalne, niezależne od platformy workflowy do przesiewania związków chemicznych lub perturbacji genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie danych o dostępności chromatyny z modelami regulacji genów istotnymi dla danej choroby w przypadku zastosowania w odpowiednich systemach komórkowych.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając profilowanie chromatyny w skali całego genomu lub w obrębie konkretnych locusów.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy regulacji transkrypcyjnej, co pozwala na podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Protokół FAIRE wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając analizę chromatyny ukierunkowaną na hipotezy oraz wspierając procesy identyfikacji i walidacji cząsteczek wiodących.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie otwartości chromatyny w celu weryfikacji hipotez regulacyjnych i wyjaśnienia mechanizmów kontroli genów.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki dostępności chromatyny, odpowiednie do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia dane dotyczące stosunku wydajności DNA i wielkości fragmentów w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i ciągłość mechanistyczną w zastosowaniach w modelach istotnych dla danych jednostek chorobowych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje zstandaryzowany, niezależny od przeciwciał przepływ pracy, który można dostosować do różnych typów komórek i ustawień eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad regulacją genów i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki ustandaryzowanym protokołom wymagającym minimalnego zaplecza sprzętowego.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie wiarygodnych danych o stanie chromatyny na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój celów epigenetycznych i transkrypcyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu biologii chromatyny oraz ilościowego PCR lub analityki sekwencjonowania.
- Wymagany jest dostęp do sonikatora oraz standardowej aparatury do biologii molekularnej.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja parametrów sonikacji i ekstrakcji pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych typów komórek ssaków i warunków doświadczalnych po optymalizacji protokołu.
- Ze względu na stosowanie niebezpiecznych odczynników, takich jak formaldehyd i fenol-chloroform, niezbędne jest przestrzeganie zasad bezpieczeństwa.
