Taśma szparkowa Tape-Peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przygotowanie wysokiej jakości wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych do analiz fizjologicznych, biochemicznych i molekularnych, takich jak transkryptomika, proteomika i metabolomika. Cześć, nazywam się Sheldon Lawrence. Jestem doktorantem w laboratorium dr Chena na Wydziale Biologii Uniwersytetu Florydy.

Dzisiaj pokażę Ci, jak wyizolować komórki ochronne z tkanki liści roślin, które są przydatnym materiałem do badania zarówno fizjologii, jak i biologii aparatów szparkowych. Ta metoda jest uważana za nowatorską metodę izolowania komórek ochronnych. W szczególności pozwala na wzbogacenie nienaruszonych komórek ochronnych i zapewnia wiarygodne próbki do badania procesów sygnalizacji komórek szparkowych.

Zastosowanie tej metody może zostać rozszerzone na rośliny Brassicaceae i inne gatunki roślin, z niewielkimi modyfikacjami protokołu. Demonstracja jest ważna, ponieważ główny krok w kierunku wzbogacenia komórek ochronnych może okazać się wyzwaniem. Na początek wybierz dojrzałe, pięciotygodniowe rośliny Arabidopsis.

Ostrożnie usuń liść skalpelem, odcinając liść u podstawy. Weź dwa kawałki taśmy klejącej i umieść między nimi wycięty liść. Delikatnie dociśnij obie strony, upewniając się, że koniec kawałków taśmy nie przylega

Można to zrobić, wkładając między nie palec. Delikatnie odsuń od siebie dwa kawałki taśmy i natychmiast przenieś skórkę pobraną od strony abaksjalnej liścia do bufora otwierającego aparaty szparkowe. Po zebraniu wszystkich skórek umieść je pod światłem.

Zostaw je tam na dwie godziny. Weź kilka skórek i umieść je na szkiełkach mikroskopowych. Za pomocą mikroskopu świetlnego wyreguluj soczewki, aby view komórki ochronne i upewnij się, że są otwarte.

Umieść skórki w 50 ml roztworu enzymu trawiącego ścianę komórkową. Pływaj i inkubuj je w temperaturze 26 stopni Celsjusza. Po 20 minutach usuń skórki z roztworu enzymu i dwukrotnie krótko spłucz wodą dejonizowaną, a następnie umieść w świeżym buforze do otwierania aparatów szparkowych.

Zmiel skórki w moździerzu z ciekłym azotem za pomocą tłuczka. Następnie wykonaj ekstrakcję fenolową zgodnie z opisem w tekście. Po zmieleniu skórek w moździerzu za pomocą tłuczka, przenieś ekstrakt wraz ze skórkami do probówki wirówkowej Oak Ridge i mieszaj na shakerze przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wytrącić białka wyekstrahowane fenolem, dodając pięć objętości lodowatego octanu amonu o stężeniu 0,1 mola w 100% metanolu. Po wytrąceniu białka przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza, zbierz białko przez odwirowanie i wykonaj płukanie granulek, jak opisano w tekście. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze zimnego acetonu i przenieść do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Po odwirowaniu wyrzucić supernatant acetonu i suszyć osad przez dziesięć minut. Rozpuścić próbkę białka w buforze do rozpuszczania. Po wirowaniu i odwirowaniu zebrać supernatant i zmierzyć stężenie białka.

Uruchom żel SDS-PAGE. Wizualizuj oddzielne pasma białkowe i obserwuj względną jakość białka. Jest to reprezentatywny obraz komórek ochronnych rzodkiewnika przed i po trawieniu enzymatycznym komórek mezofilu i naskórka.

Żywotność komórek ochronnych przed i po usunięciu mezofilu i komórek naskórka można zaobserwować za pomocą dioctanu fluoresceiny, który mierzy aktywność enzymatyczną i integralność błony komórkowej. Jak widać, komórki ochronne są nadal żywotne po peelingu i trawieniu enzymatycznym. Ten przykład ilustruje ruchy aparatów szparkowych Arabidopsis w odpowiedzi na leczenie ABA.

Komórki ochronne reagują na leczenie, a otwór aparatu szparkowego zmniejsza się o ponad 50% po 30 minutach leczenia ABA. Oto przebieg ruchu aparatów szparkowych w czasie. Ponadto wyświetlany jest reprezentatywny obraz otworu aparatów szparkowych w każdym punkcie czasowym.

Wykrywanie, separację i względną obfitość białek obserwuje się za pomocą SDS-PAGE. Pasma są wyraźne i wyraźne. Uwzględniono cztery powtórzenia biologiczne, aby podkreślić odtwarzalność ekstrakcji białek tą metodą.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy skorelować zmiany molekularne komórek ochronnych w czasie rzeczywistym z ruchem aparatów szparkowych. Po opanowaniu próbkę białka z komórek chroniących aparaty szparkowe można przygotować w ciągu kilku godzin i można ją wykorzystać w wielu eksperymentach. Ważne jest, aby pamiętać, aby nie zadawać dużych uszkodzeń komórkom ochronnym podczas obierania i przenoszenia.

Zgodnie z tą metodą, inne techniki mogą być stosowane do badania sygnalizacji komórek ochronnych, takie jak znakowanie izobaryczne w celu zbadania odpowiedzi redux białek u roślin w warunkach normalnych i stresowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i wzbogacać nienaruszone i żywotne komórki ochronne, a także ekstrahować wysokiej jakości białko odpowiednie do dalszych badań.