Name: Taśma szparkowa Tape-Peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę taśmy szparkowej do izolacji komórek ochronnych roślin. Ta technika umożliwia uzyskanie wysokiej jakości próbek do badań fizjologicznych, biochemicznych i molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Danielowi Chenowi z Zespołu Produkcji Cyfrowej Wideo w Buchholz High School za pomoc w edycji filmu. Badania nad komórkami ochrony aparatów szparkowych, proteomiką i metabolomiką w laboratorium Chen zostały wsparte grantami amerykańskiej Narodowej Fundacji Nauki (0818051, 1158000 i 1412547). Wenwen Kong jest wspierany przez Chińską Radę Stypendialną. Dr Qiuying Pang jest wspierany przez Chińską Radę Stypendialną i Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31570396).

1. Uprawa roślin
<ol>
	<li>Kiełkuj nasiona w mieszance doniczkowej. Rośliny należy uprawiać w komorze wzrostowej o natężeniu światła 140 μmol fotonów m−2 s −1 i fotoperiodzie 8 godzin światła w temperaturze 22 °C i 16 godzinach ciemności w temperaturze 18 °C przez 2 tygodnie.</li>
	<li>Przesadzaj sadzonki o podobnych rozmiarach pojedynczo do doniczek o średnicy 4 cali zawierających glebę i rosnąć przez dodatkowe 3 tygodnie w tych samych warunkach, które opisano w kroku 1.1. 
	UWAGA: Podlewaj rośliny wodą z kranu dwa razy w tygodniu, aby gleba była wilgotna.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wzbogaconych aparatów szparkowych
<ol>
	<li>Usuń liście 5-tygodniowych roślin A. thaliana pojedynczo za pomocą skalpela.</li>
	<li>Przymocuj każdy liść do dwóch kawałków przezroczystej taśmy klejącej, tak aby jeden kawałek przylegał do strony adoksjalnej (dolnej), a drugi przylegał do adaksjalnej (górnej) strony liścia. Pozostaw taśmę na liściu na 5 sekund.</li>
	<li>Delikatnie rozsuń dwa kawałki taśm za pomocą palca wskazującego i kciuka każdej ręki, aby oddzielić stronę abaksjalną z komórkami chodnikowymi i ochronnymi oraz stronę adaksjalną z komórkami mezofilu.</li>
	<li>Umieść skórki od strony abaksjalnej liści w 60 ml buforu otwierającego aparaty szparkowe (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, dostosowany do pH 6,2 z 1 M KOH) na płytkach Petriego o średnicy 40 mm × 12 mm podczas ich zbierania.
	<ol>
		<li>Powtarzaj powyższe kroki, aż wszystkie skórki próbki zostaną zebrane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić szalki Petriego zawierające skórki w komorze wzrostowej w warunkach oświetleniowych określonych w kroku 1.1. Pozostaw skórki pod światłem na 2 godziny, aby aparaty szparkowe całkowicie się otworzyły.</li>
	<li>Umieść skórki na szalce Petriego o wymiarach 150 mm x 20 mm zawierającej 50 ml mieszaniny enzymów trawiących ścianę komórkową (0,7% celulazy R-10, 0,025% macerozymu R-10, 0,1% (w/v) poliwinylopirolidonu-40 i 0,25% (m/v) albuminy surowicy bydlęcej w 55% roztworze zasadowym (0,55 M sorbitolu, 0,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM kwasu askorbinowego, 10 μM KH2PO4, 5 mM kwas 4-morfolinoetanosulfonowy (MES) o pH 5,7 skorygowany za pomocą 1 M KOH).</li>
	<li>Potrząsaj skórkami na wytrząsarce przeciwstawnej na szalce Petriego z prędkością 50 obr./min przez 20 minut.</li>
	<li>Po 20 minutach usuń skórki z roztworu enzymu za pomocą pęsety. Przenieś skórki na szalkę Petriego o wymiarach 150 mm x 20 mm zawierającą 50 ml wody.</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej płukać skórki przez 15 s dwukrotnie 10 ml wody, aby usunąć resztki roztworu enzymu.</li>
	<li>Za pomocą pęsety umieść skórki na szalce Petriego o wymiarach 150 mm x 20 mm z 50 ml świeżego buforu do otwierania aparatów szparkowych, jak opisano w kroku 2.4. Inkubować przez 1 godzinę w warunkach świetlnych określonych w kroku 1.1, aby umożliwić aparatom szparkowym regenerację.</li>
</ol>
3. Leczenie kwasem abscysynowym (ABA) i test ruchów aparatów szparkowych
<ol>
	<li>W szalce Petriego o wymiarach 150 mm x 20 mm. Wzbogacone skórki aparatów szparkowych inkubować w temperaturze 30°C przez 15 minut w 50 ml buforu do otwierania aparatów szparkowych lub w 50 ml buforu do otwierania aparatów szparkowych o końcowym stężeniu 10 μM ABA przez odpowiedni czas leczenia.</li>
	<li>Umieść peelingi na shakerze z prędkością 50 obr./min na 5, 15 i 30 minut. Po każdym przedziale czasu usuń skórkę pęsetą i postępuj zgodnie z instrukcjami obrazowania opisanymi w kroku 3.3.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia aparatów szparkowych przed leczeniem ABA i w różnych punktach czasowych po leczeniu ABA za pomocą mikroskopu świetlnego.
	<ol>
		<li>Weź skórkę i umieść ją na szklanym szkiełku mikroskopowym.</li>
		<li>Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wyreguluj stolik tak, aby można było zobrazować obraz skórki.</li>
		<li>Dostosuj precyzyjną i kursową ostrość na mikroskopie, aby uzyskać wyraźny obraz komórek ochronnych.</li>
		<li>Zrób kilka zdjęć wielu aparatów szparkowych w 40-krotnym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz 60 otworów szparkowych za pomocą ImageJ8.</li>
	<li>Oblicz błąd standardowy i istotność przy wartości p < 0,05 z 60 pomiarów apertury szparkowej.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja białek i separacja stron SDS
<ol>
	<li>Miel skórki przez 15 s w wystarczającej ilości ciekłego azotu, aby pokryć skórki za pomocą schłodzonego moździerza i tłuczka.</li>
	<li>Na 50 skórek dodać pipetą do moździerza 3 ml fenolu nasyconego Tris (pH 8,8) i 3 ml buforu do ekstrakcji białek (0,9 M sacharozy, 0,1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4% 2-merkaptoetanolu, 10 μl 1 mM proteazy i inhibitora fosfatazy) pipetą, a następnie mielić skórki przez dodatkowe 5 minut w dygestorium.</li>
	<li>Przenieść ekstrakt za pomocą pipety, a skórki za pomocą metalowej pęsety do probówki wirówkowej Oakridge i mieszać na wytrząsarce z prędkością 50 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń skórki z probówki wirówkowej Oakridge i odwiruj ekstrakt o stężeniu 5 000 x g przez 10 minut. Następnie przenieś górną fazę fenolową do nowej, czystej probówki mikrowirówki za pomocą pipety.</li>
	<li>Wytrącić białka wyekstrahowane fenolem, dodając 5 objętości lodowatego octanu 0,1 M amonu w 100% metanolu. Krótko wirować i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odwirować przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, zdekantować supernatant powoli wylewając go z probówki i zatrzymać osad białkowy w probówce.</li>
	<li>Przemyć osad białkowy dwukrotnie 0,1 M octanem amonu w metanolu, a następnie dwukrotnie 80% acetonem i raz 100% zimnym acetonem. 
	UWAGA: Mycie odbywa się poprzez dodanie 10 ml określonego odczynnika do probówki z białkiem. Mieszać na wytrząsarce przy 50 obr./min przez 5 min, a następnie odwirować przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Następnie wylej odczynnik z probówki, zachowując tylko osad białka.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 100% zimnego acetonu do osadu i ponownie zawiesij, powoli pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę białkową za pomocą pipety do probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml, a następnie odwirować w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń aceton, dekantując go z rurki i susz granulki w dygestorium przez 10 minut.</li>
	<li>Rozpuścić białko w probówce do mikrowirówki z 200 μl buforu do rozpuszczania (8 M mocznika, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl o pH 8,5) i wirować przez 30 minut. Wirować w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 15 °C przez 20 minut i zebrać supernatant do nowej probówki.</li>
	<li>Określ ilościowo stężenie białka zgodnie z protokołem kwantyfikacji białka9.</li>
	<li>Użyj próbek białek do separacji białek za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie z protokołem10.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Komórki ochronne są modelowym systemem do badania mechanizmów transdukcji sygnału u roślin i ważne jest, aby upewnić się, że przygotowanie próbek użytych w badaniu jest najbardziej odpowiednie do udzielenia odpowiedzi na pytania biologiczne. Pomimo rosnącego zainteresowania komórkami ochronnymi w środowisku badaczy roślin, nie ma uniwersalnej metody przygotowania komórek ochronnych aparatów szparkowych, która pozwoliłaby na badanie zarówno ruchu szparkowego i fizjologii, jak i zmian molekularnych w jednym systemie. Wyzwa...

Aparaty szparkowe odgrywają ważną rolę w ogólnej fizjologii i sprawności roślin. Te maleńkie struktury specyficzne dla roślin są tworzone przez dwie wyspecjalizowane komórki naskórka znane jako komórki ochronne i występują najobficiej na powierzchni liści. Aparaty szparkowe są niezbędne do wymiany gazów między rośliną a atmosferą, a także do kontroli utraty wody w wyniku transpiracji. Komórki ochronne regulują otwór aparatu szparkowego poprzez integrację różnych bodźców zewnętrznych (np. światła, wilgotności, kontaktu z patogenami, poziomu dwutlenku węgla) i wewnętrznych (np. hormonów endogennych)1,2. W ciągu ostatnich 20 lat ten typ komórek stał się modelowym systemem do badania procesów sygnalizacji komórkowej w roślinach. Komórki te stanowią niewielki ułamek wszystkich komórek liścia; Dlatego, aby zbadać ich unikalne właściwości komórkowe, biochemiczne i molekularne w sposób jednokomórkowy, konieczne jest wyizolowanie ich od innych typów komórek liści. W przeszłości badania nad komórkami ochronnymi często obejmowały przygotowanie protoplastów komórek ochronnych (GCP)3,4,5. Zazwyczaj wymaga to użycia dużych ilości enzymów rozkładających ścianę komórkową i/lub mechanicznego rozerwania poprzez mieszanie i okazało się kosztowne i czasochłonne, ponieważ przygotowanie próbki GCP zajmuje zwykle wiele godzin, często z niewielką wydajnością. Co ważniejsze, ponieważ komórki ochronne działają jak kompletne pary regulujące aperturę aparatów szparkowych, zastosowanie GCP może być postrzegane jako sztuczny system do badania sygnalizacji komórek ochronnych. 
Tutaj opracowaliśmy metodę przygotowania aparatów szparkowych, w których nienaruszone komórki ochronne są wzbogacone i utrzymują fizjologiczne reakcje na bodźce. Metoda ta została zainspirowana metodą, która została użyta do wyizolowania protoplastów komórek mezofilu6,7. W naszej metodzie aparaty szparkowe są przygotowywane przy użyciu przezroczystej taśmy klejącej, aby najpierw oddzielić większość komórek mezofilu przyczepionych do warstwy adaksjalnej liścia od warstwy abaksjalnej zawierającej nawierzchnię i komórki ochronne. Odbywa się to poprzez przyklejenie kawałka taśmy z każdej strony liścia i oderwanie ich. Komórkom z warstwy abaksjalnej pozostawia się regenerację pod wpływem światła w buforze otwierającym aparaty szparkowe. Później pozostałe komórki chodnika są usuwane za pomocą niewielkiej ilości enzymów rozkładających ścianę komórkową, pozostawiając komórkę ochronną, która jest wzbogacana na taśmie. 
W tej prostej metodzie, komórki stomatalne ochronne, które są zarówno żywotne, jak i responsywne, mogą być szybko i efektywnie przygotowane, co zajmuje mniej niż godzinę, aby uzyskać wzbogacone komórki ochronne aparatów szparkowych z 50 peelingów przy minimalnych kosztach. Metoda ta powoduje mniejsze uszkodzenia komórek roślinnych niż poprzednie metody, w których przygotowywane są protoplasty. Ponadto materiały pobrane tą metodą dają pożądane ilości białka. Co najważniejsze, ponieważ liść nie jest poddawany mieszaniu ani długiemu trawieniu, a komórki ochronne pozostają nienaruszone, wyniki badań będą bardziej adekwatne do naturalnej biologii komórki ochronnej. Dzięki tej metodzie ruchy aparatów szparkowych mogą być skorelowane w czasie rzeczywistym ze zmianami na poziomie molekularnym. W związku z tym wiedza uzyskana z badań z wykorzystaniem tej metody przygotowania byłaby ważna dla bardziej wszechstronnego zrozumienia sygnalizacji komórek ochronnych. 
Użyliśmy rośliny Arabidopsis thaliana jako modelu; jednak ten protokół może być zastosowany do wzbogacania komórek ochronnych aparatów szparkowych u innych gatunków roślin, takich jak Brassica napus, z niewielkimi modyfikacjami czasu trawienia. Jako dowód słuszności koncepcji wykazaliśmy, że komórki ochronne aparatów szparkowych wzbogacone tą metodą są żywotne i reagują na bodźce, jak wykazano odpowiednio w teście dioctanu fluoresceiny (FDA) i badaniach z wykorzystaniem hormonu roślinnego kwasu abscysynowego (ABA). Ponadto wykazaliśmy, że z tych komórek ochronnych można wyizolować wysokiej jakości białka. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół tego procesu.

<table><tbody><tr><td>Pióro skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>NC9999403 Taśma klejąca (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>celulaza (Onozuka R-10)&nbsp;</td><td>Yakult Przemysł farmaceutyczny Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop DM6000B&nbsp;</td>Koktajle inhibitorów proteaz i fosfatazy <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>PI78443</tr><tr><td>Szybkie probówki wirówkowe PPCO Oak Ridge Zestaw do</td> oznaczania ilości białek <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>EZQ Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Dioctan fluoresceiny (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Kwas abscysynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Firmy&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Bufor do próbek</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek (2 ml)</td> <td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td> Pęseta <td>Narodowego Instytutu Zdrowia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

taśma szparkowa tape-peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Badanie komórek ochronnych jest niezbędne do poznania specyficznego wkładu tego typu komórek w ogólną funkcję roślin. Jednak często trudno jest je wyizolować, a zatem ich badanie często stanowi wyzwanie. 
To badanie ustanawia metodę wzbogacania komórek ochronnych aparatów szparkowych. Protokół wykorzystuje taśmę klejącą do izolowania komórek ochronnych i ekstrakcji białek z komórek. Metoda ta poprawia integralność i wydajność komórki ochronnej podczas izolacji i zapewnia wiarygodną próbkę do badania procesów sygnalizacji komórkowej i ich korelacji z fenotypami ruchu aparatów szparkowych. W tej metodzie liście rośliny zostały podzielone na dwie części taśmy i oderwane, aby usunąć stronę abaksjalną. Protokół ten zastosowano do tkanki liścia rzodkiewnika w celu wyizolowania komórek ochronnych. Komórki potraktowano dioctanem fluoresceiny (FDA) w celu określenia żywotności oraz kwasem abscysynowym (ABA) w celu oceny ruchu aparatów szparkowych w odpowiedzi na ABA. Podsumowując, protokół ten okazuje się przydatny do przygotowania wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych i izolacji białek. Jakość uzyskanych tu komórek i białek umożliwia prowadzenie badań fizjologicznych i innych badań biologicznych.

Reprezentatywny obraz komórek szparkowych Arabidopsis przed i po trawieniu komórek mezofylu oraz epidermy przedstawiono na Rysunku 1. Żywotność komórek szparkowych przed i po usunięciu komórek mezofylu i epidermy można zaobserwować, wykorzystując FDA do pomiaru aktywności enzymatycznej i integralności błony komórkowej (Rysunek 1B oraz 1D). Rysunek 2 ilustruje ruch szparek Arabidopsis...

Ten protokół opisuje metodę przygotowania wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych, która jest przydatna do badań fizjologicznych i innych badań biologicznych.

Taśma szparkowa Tape-Peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przygotowanie wysokiej jakości wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych do analiz fizjologicznych, biochemicznych i molekularnych, takich jak transkryptomika, proteomika i metabolomika. Cześć, nazywam się Sheldon Lawrence. Jestem doktorantem w laboratorium dr Chena na Wydziale Biologii Uniwersytetu Florydy.Dzisiaj pokażę Ci, jak wyizolować komórki ochronne z tkanki liści roślin, które są przydatnym materiałem do badania zarówno fizjologii, jak i biologii aparatów szparkowych. Ta metoda jest uważana za nowatorską metodę izolowania komórek ochronnych. W szczególności pozwala na wzbogacenie nienaruszonych komórek ochronnych i zapewnia wiarygodne próbki do badania procesów sygnalizacji komórek szparkowych.Zastosowanie tej metody może zostać rozszerzone na rośliny Brassicaceae i inne gatunki roślin, z niewielkimi modyfikacjami protokołu. Demonstracja jest ważna, ponieważ główny krok w kierunku wzbogacenia komórek ochronnych może okazać się wyzwaniem. Na początek wybierz dojrzałe, pięciotygodniowe rośliny Arabidopsis.Ostrożnie usuń liść skalpelem, odcinając liść u podstawy. Weź dwa kawałki taśmy klejącej i umieść między nimi wycięty liść. Delikatnie dociśnij obie strony, upewniając się, że koniec kawałków taśmy nie przylega.Można to zrobić, wkładając między nie palec. Delikatnie odsuń od siebie dwa kawałki taśmy i natychmiast przenieś skórkę pobraną od strony abaksjalnej liścia do bufora otwierającego aparaty szparkowe. Po zebraniu wszystkich skórek umieść je pod światłem.Zostaw je tam na dwie godziny. Weź kilka skórek i umieść je na szkiełkach mikroskopowych. Za pomocą mikroskopu świetlnego wyreguluj soczewki, aby view komórki ochronne i upewnij się, że są otwarte.Umieść skórki w 50 ml roztworu enzymu trawiącego ścianę komórkową. Pływaj i inkubuj je w temperaturze 26 stopni Celsjusza. Po 20 minutach usuń skórki z roztworu enzymu i dwukrotnie krótko spłucz wodą dejonizowaną, a następnie umieść w świeżym buforze do otwierania aparatów szparkowych.Zmiel skórki w moździerzu z ciekłym azotem za pomocą tłuczka. Następnie wykonaj ekstrakcję fenolową zgodnie z opisem w tekście. Po zmieleniu skórek w moździerzu za pomocą tłuczka, przenieś ekstrakt wraz ze skórkami do probówki wirówkowej Oak Ridge i mieszaj na shakerze przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wytrącić białka wyekstrahowane fenolem, dodając pięć objętości lodowatego octanu amonu o stężeniu 0,1 mola w 100% metanolu. Po wytrąceniu białka przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza, zbierz białko przez odwirowanie i wykonaj płukanie granulek, jak opisano w tekście. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze zimnego acetonu i przenieść do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej.Po odwirowaniu wyrzucić supernatant acetonu i suszyć osad przez dziesięć minut. Rozpuścić próbkę białka w buforze do rozpuszczania. Po wirowaniu i odwirowaniu zebrać supernatant i zmierzyć stężenie białka.Uruchom żel SDS-PAGE. Wizualizuj oddzielne pasma białkowe i obserwuj względną jakość białka. Jest to reprezentatywny obraz komórek ochronnych rzodkiewnika przed i po trawieniu enzymatycznym komórek mezofilu i naskórka.Żywotność komórek ochronnych przed i po usunięciu mezofilu i komórek naskórka można zaobserwować za pomocą dioctanu fluoresceiny, który mierzy aktywność enzymatyczną i integralność błony komórkowej. Jak widać, komórki ochronne są nadal żywotne po peelingu i trawieniu enzymatycznym. Ten przykład ilustruje ruchy aparatów szparkowych Arabidopsis w odpowiedzi na leczenie ABA.Komórki ochronne reagują na leczenie, a otwór aparatu szparkowego zmniejsza się o ponad 50% po 30 minutach leczenia ABA. Oto przebieg ruchu aparatów szparkowych w czasie. Ponadto wyświetlany jest reprezentatywny obraz otworu aparatów szparkowych w każdym punkcie czasowym.Wykrywanie, separację i względną obfitość białek obserwuje się za pomocą SDS-PAGE. Pasma są wyraźne i wyraźne. Uwzględniono cztery powtórzenia biologiczne, aby podkreślić odtwarzalność ekstrakcji białek tą metodą.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy skorelować zmiany molekularne komórek ochronnych w czasie rzeczywistym z ruchem aparatów szparkowych. Po opanowaniu próbkę białka z komórek chroniących aparaty szparkowe można przygotować w ciągu kilku godzin i można ją wykorzystać w wielu eksperymentach. Ważne jest, aby pamiętać, aby nie zadawać dużych uszkodzeń komórkom ochronnym podczas obierania i przenoszenia.Zgodnie z tą metodą, inne techniki mogą być stosowane do badania sygnalizacji komórek ochronnych, takie jak znakowanie izobaryczne w celu zbadania odpowiedzi redux białek u roślin w warunkach normalnych i stresowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i wzbogacać nienaruszone i żywotne komórki ochronne, a także ekstrahować wysokiej jakości białko odpowiednie do dalszych badań.

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Ten artykuł opisuje metody badania przesiewowego genów kontrolujących przepuszczalność plazmodalną, a tym samym gradient auksyny podczas odpowiedzi tropikalnej. Obejmuje to pomiar stopnia odpowiedzi tropikalnej u hipokotylu Arabidopsis thaliana i sprawdzenie przepuszczalności plazmodalnej przez obciążenie kwasem 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowym (HPTS) i wreszcie ocenę poziomu kalozy.

Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

Zegar okołodobowy reguluje około jednej trzeciej transkryptomu Arabidopsis, ale procent genów, które wracają do pomiaru czasu, pozostaje nieznany. Tutaj wizualizujemy metodę szybkiej oceny fenotypów okołodobowych w dowolnej zmutowanej linii Arabidopsis przy użyciu obrazowania luminescencyjnego reportera okołodobowego przejściowo ulegającego ekspresji w protoplastach.

Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym

Istniejące metody modyfikacji roślin mają ograniczone zastosowanie. Zaproponowana tu nowatorska technologia oparta na peptydach obiecuje zarówno prostotę, jak i skuteczność we wprowadzaniu egzogennych białek lub genów do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych nienaruszonych roślin.

Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak indukować skupione aparaty szparkowe w liścieniach siewek Arabidopsis thaliana poprzez zanurzenie roztworu pożywki zawierającej cukier oraz jak obserwować struktury wewnątrzkomórkowe, takie jak chloroplasty i mikrotubule w zgrupowanych komórkach ochronnych za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej.

System indukcyjny do grupowania aparatów szparkowych za pomocą zanurzenia w roztworze cukru w siewkach rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana)

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Protokół ten przedstawia porównawczą metodę oceny cech szparkowych i naskórkowych u dwóch odrębnych gatunków za pomocą peelingów naskórnych, technik oczyszczania oraz analizy obrazowej wspomaganej przez AI. Celem jest umożliwienie wysokoprzepustowej, powtarzalnej ilościowej identyfikacji struktur komórkowych leżących u podstaw funkcji szparków szparkowych dla zastosowań rolniczych oraz szerokich badań roślinnych.

Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

Poznaj ulepszoną metodę taśmy szparkowej do izolacji komórek ochronnych roślin. Ta technika umożliwia uzyskanie wysokiej jakości próbek do badań fizjologicznych, biochemicznych i molekularnych.

Taśma szparkowa Tape-Peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych

Przeglądaj więcej filmów