Szybka i ilościowa metoda modyfikacji potranslacyjnej i wariantów umożliwiła mapowanie peptydów do genomów

Ogólnym celem tego protokołu oprogramowania jest zademonstrowanie wykorzystania PoGo do mapowania peptydów z powiązanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i informacjami ilościowymi z eksperymentów spektrometrii mas w celu odniesienia genomów oraz umożliwienia integracji i wizualizacji z ortogonalnymi danymi genomicznymi. Narzędzie to może pomóc w dodawaniu informacji genomicznych do list peptydów generowanych przez badania proteomiczne spektrometrii mas, dzięki czemu można ułatwić integrację z danymi sekwencjonowania RNA. Główną zaletą tego narzędzia jest to, że jest proste w użyciu, szybkie i obsługuje dodatkowe informacje, takie jak modyfikacje potranslacyjne, kwantyfikacja i wariancja aminokwasów.

Aby rozpocząć, pobierz i zainstaluj oprogramowanie pokazane w tym filmie zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Po zainstalowaniu przejdź do folderu plików wykonywalnych PoGo GUI i uruchom program, klikając dwukrotnie ikonę PoGo GUI. Użyj przycisku wyboru obok pliku wykonywalnego PoGo.

Następnie przejdź do folderu plików wykonywalnych do odpowiedniego podfolderu systemu operacyjnego i wybierz plik wykonywalny PoGo. Potwierdź jego wybór, klikając przycisk otwierania. Następnie wybierz referencyjny plik wejściowy dla sekwencji białek, klikając przycisk wybierz.

Przejdź do folderu danych i wybierz plik z szybkim dniem tłumaczenia. Potwierdź jego wybór, klikając przycisk Otwórz. Wybierz plik adnotacji transkrypcji za pomocą przycisku wyboru.

Następnie przejdź do folderu danych, wybierz plik GTF adnotacji i kliknij otwórz. Dodaj plik identyfikacyjny peptydu za pomocą przycisku dodawania obok plików peptydowych. Tutaj wybierz plik w obsługiwanym formacie MZ Tab, MZ Ident ML lub MZ ID lub w formacie czterokolumnowym rozdzielonym tabulatorami.

Dodatkowo odznacz pola wyboru obok BED NGTF w wyborze formatu wyjściowego. Pozostaw zaznaczone tylko PTM BED i GCT. Następnie wybierz odpowiedni gatunek dla danych z listy rozwijanej i rozpocznij mapowanie, klikając start.

Najpierw załaduj plik wyjściowy PoGo kończący się na _ptm. bed do przeglądarki integrative genomics. Powtórz tę czynność, aby załadować również plik kończący się na _noptm.bed.

Ten plik zawiera wszystkie peptydy znalezione bez żadnych modyfikacji. Zmień kolejność ścieżek, przeciągając je i upuszczając w żądane miejsce na liście. Każdy plik będzie wyświetlany jako osobne ścieżki z nazwą pliku identyfikującą ścieżkę.

Każdy utwór jest początkowo pokazany w sposób zwinięty. Aby je rozwinąć, kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę ścieżki i wybierz rozwinięte, aby uzyskać pełny widok peptydów, w tym sekwencji. Teraz załaduj plik kończący się na gct.

Ten plik zawiera informacje o ilościowym oznaczaniu peptydów. W przeciwieństwie do wcześniej załadowanych plików, każda próbka z adnotacjami zostanie załadowana jako osobna ścieżka. Reorganizuj próbki zgodnie z potrzebami za pomocą operacji przeciągnij i upuść.

Poruszaj się po genomie, wybierając chromosom z menu rozwijanego, klikając i przytrzymując sekcję chromosomu, aby powiększyć lub wpisując współrzędne genomu. Mapowanie PoGo może odbywać się za pomocą graficznego interfejsu użytkownika lub interfejsu wiersza poleceń. W tej części protokołu interfejs wiersza poleceń służy do podkreślenia wymienności.

Aby zmapować warianty peptydów uzyskane w poprzednich krokach w protokole tekstowym do genomu referencyjnego, otwórz wiersz polecenia i przejdź do folderu plików wykonywalnych PoGo. Następnie wpisz pokazane tutaj polecenie. Potwierdź wykonanie, naciskając Enter i poczekaj, aż wykonanie zostanie zakończone, zanim przejdziesz dalej.

Wizualizuj peptydy zmapowane bez niezgodności i z niezgodnością w przeglądarce genomiki integracyjnej. W oprogramowaniu graficznego interfejsu użytkownika PoGo dodaj pliki identyfikacyjne peptydów za pomocą przycisku dodawania obok plików peptydowych i wybierz jeden lub wiele plików, a także przeciągnij i upuść do pustego pola pod plikami peptydowymi. Następnie odznacz pola wyboru obok PTM BED, GTF i GCT w sekcji formatu wyjściowego i pozostaw zaznaczone tylko BED.

Dodatkowo wybierz opcję scal wiele plików wejściowych w jedno wyjście. Spowoduje to, że pojedynczy plik wyjściowy połączy wszystkie peptydy plików wejściowych. Pozostawienie tej opcji niezaznaczonej spowoduje sekwencyjne wykonanie programu dla każdego pliku wejściowego z osobna.

Następnie wybierz odpowiednie gatunki dla danych z listy rozwijanej, która jest spójna z plikami NGTF dnia postu. Po wybraniu rozpocznij mapowanie, klikając przycisk Start. Aby wygenerować koncentrator ścieżki z zamapowanych peptydów, otwórz okno terminala i wpisz następujące polecenie w wierszu polecenia.

Potwierdź wykonanie, naciskając Enter. Wykonanie zajmie tylko krótki czas. Po zakończeniu przenieś wygenerowany hub ścieżek wraz z całą jego zawartością na dostępny w sieci serwer FTP lub GitHub.

W przeglądarce internetowej przejdź do przeglądarki UCSC Genome i wybierz pozycję My Data Track Hubs. Następnie kliknij zakładkę Moje Huby. Skopiuj adres URL do centrum ścieżek w polu tekstowym, a następnie załaduj węzeł ścieżek, klikając przycisk Dodaj centrum.

Na koniec wybierz przeglądarkę genomu, aby przejść do widoku przeglądarki. Niestandardowe centrum ścieżek zostanie wyświetlone u góry listy. Jeśli wiele plików BED zbudowało podstawę dla koncentratora ścieżek, każdy z plików będzie reprezentowany jako oddzielna ścieżka w centrum.

PoGo i dwa inne narzędzia do mapowania proteogenomicznego są tutaj porównywane pod kątem ogólnego zużycia pamięci i analitycznego czasu działania. PoGo znacznie przewyższa inne narzędzia zarówno pod względem szybkości, jak i pamięci, a także jest w stanie mapować modyfikacje potranslacyjne i informacje ilościowe związane z peptydami na genomie. PoGo wykorzystuje opcję kolorowania, aby zapewnić łatwą pomoc wizualną w odniesieniu do unikalności mapowania peptydów w genomie.

Mapowania w kolorze czerwonym wskazują na unikalność pojedynczego transkryptu, podczas gdy blok podkreśla mapowanie do pojedynczego genu. Szare mapowania pokazują peptydy wspólne dla wielu genów. Opcja PTM BED w PoGo na nowo definiuje kod kolorystyczny, aby dostosować go do różnych typów modyfikacji potranslacyjnych, wskazując lokalizację modyfikacji za pomocą grubego bloku na zmodyfikowanej reszcie aminokwasowej.

W przedstawionych tutaj danych dotyczących proteomu reprezentujących raka jelita grubego, zidentyfikowano tylko dwa peptydy, z których każdy wykazywał pojedynczą fosforylację. Informacje zawarte w wyjściowym pliku GCT zawierają wartości ilościowe dla regionów genomu pokrytych peptydami. Peptydy rozciągające się w poprzek połączeń spawowych są dzielone na części bez łączenia.

Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat łączenia, wymagany jest dodatkowo wyjściowy plik GTF. Po pobraniu i skonfigurowaniu sekwencji białek referencyjnych i adnotacji, tysiące peptydów można zmapować na współrzędne genomu w czasie krótszym niż pięć minut, jeśli nie dopuszcza się niezgodności sekwencji. Próbując mapować peptydy na genomy referencyjne za pomocą PoGo, ważne jest, aby pamiętać o użyciu translowanych sekwencji transkryptów kodujących białka i związanej z nimi adnotacji transkryptu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać PoGo i PoGo GUI do mapowania peptydów z eksperymentów proteomicznej spektrometrii mas z powiązanymi informacjami na przywoływane genomy i ich wizualizację.