Name: Szybka i ilościowa metoda modyfikacji potranslacyjnej i wariantów umożliwiła mapowanie peptydów do genomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj narzędzie PoGo do szybkiego mapowania peptydów z modyfikacjami potranslacyjnymi na genomy referencyjne. Umożliwia integrację danych proteomicznych z sekwencjonowaniem RNA i wizualizację w przeglądarce genomowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust (WT098051) i grant NIH (U41HG007234) na projekt GENCODE.

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics+connects+somatic+mutations+to+signalling+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer.</a> Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteogenomic+characterization+of+human+high-grade+serous+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer.</a> Cell. 166 (3), 755-765 (2016).</li>
<li>Jaffe, J. D., Berg, H. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomic+mapping+as+a+complementary+method+to+perform+genome+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteogenomic mapping as a complementary method to perform genome annotation.</a> Proteomics. 4 (1), 59-77 (2004).</li>
<li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24870543">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li>
<li>Kim, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+draft+map+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A draft map of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 575-581 (2014).</li>
<li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+GENCODE+reference+gene+annotation+using+a+high-stringency+proteogenomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Improving GENCODE reference gene annotation using a high-stringency proteogenomics workflow.</a> Nature Communications. 7, 11778(2016).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nature Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Armengaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-model+organisms%2C+a+species+endangered+by+proteogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Non-model organisms, a species endangered by proteogenomics.</a> Journal of Proteomics. 105, 5-18 (2014).</li>
<li>Askenazi, M., Ruggles, K. V., Fenyo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGx%3A+putting+peptides+to+BED%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">PGx: putting peptides to BED.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 795-799 (2016).</li>
<li>Choi, S., Kim, H., Paek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACTG%3A+novel+peptide+mapping+onto+gene+models%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ACTG: novel peptide mapping onto gene models.</a> Bioinformatics. 33 (8), 1218-1220 (2017).</li>
<li>Ghali, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoAnnotator-open+source+proteogenomics+annotation+software+supporting+PSI+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">ProteoAnnotator-open source proteogenomics annotation software supporting PSI standards.</a> Proteomics. 14 (23-24), 2731-2741 (2014).</li>
<li>Has, C., Lashin, S. A., Kochetov, A. V., Allmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGMiner+reloaded%2C+fully+automated+proteogenomic+annotation+tool+linking+genomes+to+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PGMiner reloaded, fully automated proteogenomic annotation tool linking genomes to proteomes.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 13 (4), 293(2016).</li>
<li>Kuhring, M., Renard, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPiG%3A+integrating+peptide+spectrum+matches+into+genome+browser+visualizations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iPiG: integrating peptide spectrum matches into genome browser visualizations.</a> PLoS One. 7 (12), e50246(2012).</li>
<li>Pang, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+covisualize+and+coanalyze+proteomic+data+with+genomes+and+transcriptomes%3A+validation+of+genes+and+alternative+mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Tools to covisualize and coanalyze proteomic data with genomes and transcriptomes: validation of genes and alternative mRNA splicing.</a> Journal of Proteome Research. 13 (1), 84-98 (2014).</li>
<li>Sanders, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteogenomic+mapping+tool%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The proteogenomic mapping tool.</a> BMC Bioinformatics. 12 (115), (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProBAMsuite%2C+a+bioinformatics+framework+for+genome-based+representation+and+analysis+of+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">ProBAMsuite, a bioinformatics framework for genome-based representation and analysis of proteomics data.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 1164-1175 (2016).</li>
<li>Schlaffner, C. N., Pirklbauer, G. J., Bender, A., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+quantitative+and+variant+enabled+mapping+of+peptides+to+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Fast, quantitative and variant enabled mapping of peptides to genomes.</a> Cell Systems. 5 (2), 152-156 (2017).</li>
<li>Vizcaino, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PRoteomics+IDEntifications+%28PRIDE%29+database+and+associated+tools%3A+status+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Research. 41, D1063-D1069 (2013).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D635-D642 (2017).</li>
<li>Perez-Riverol, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ms-data-core-api%3A+an+open-source%2C+metadata-oriented+library+for+computational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Ms-data-core-api: an open-source, metadata-oriented library for computational proteomics.</a> Bioinformatics. 31 (17), 2903-2905 (2015).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-protease+strategy+identifies+three+PE2+missing+proteins+in+human+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-protease strategy identifies three PE2 missing proteins in human testis tissue.</a> Journal of Proteome Research. , (2017).</li>
<li>Greseth, M. D., Carter, D. C., Terhune, S. S., Traktman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+screen+for+cellular+targets+of+the+vaccinia+virus+F10+protein+kinase+reveals+that+phosphorylation+of+mDia+regulates+stress+fiber+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic screen for cellular targets of the vaccinia virus F10 protein kinase reveals that phosphorylation of mDia regulates stress fiber formation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 16 (4 Suppl 1), S124-S143 (2017).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Kent, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+genome+browser+at+UCSC%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The human genome browser at UCSC.</a> Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).</li>
<li>The R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).</li>
<li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigWig+and+BigBed%3A+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li>
<li>Down, T. A., Piipari, M., Hubbard, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dalliance%3A+interactive+genome+viewing+on+the+web%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Dalliance: interactive genome viewing on the web.</a> Bioinformatics. 27 (6), 889-890 (2011).</li>
<li>Roumeliotis, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+determinants+of+protein+abundance+variation+in+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genomic determinants of protein abundance variation in colorectal cancer cells.</a> Cell Reports. 20 (9), 2201-2214 (2017).</li>
<li>Gaudet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neXtProt+knowledgebase+on+human+proteins%3A+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The neXtProt knowledgebase on human proteins: 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 45, D177-D182 (2017).</li>
<li>Fermin, D., Walmsley, S. J., Gingras, A. C., Choi, H., Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LuciPHOr%3A+algorithm+for+phosphorylation+site+localization+with+false+localization+rate+estimation+using+modified+target-decoy+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">LuciPHOr: algorithm for phosphorylation site localization with false localization rate estimation using modified target-decoy approach.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (11), 3409-3419 (2013).</li>
<li>Fermin, D., Avtonomov, D., Choi, H., Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LuciPHOr2%3A+site+localization+of+generic+post-translational+modifications+from+tandem+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">LuciPHOr2: site localization of generic post-translational modifications from tandem mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1141-1143 (2015).</li>
<li>Hansen, T. A., Sylvester, M., Jensen, O. N., Kjeldsen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+and+high+confidence+protein+phosphorylation+site+localization+using+complementary+collision-activated+dissociation+and+electron+transfer+dissociation+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated and high confidence protein phosphorylation site localization using complementary collision-activated dissociation and electron transfer dissociation tandem mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (22), 9694-9699 (2012).</li>
<li>Taus, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+and+confident+phosphorylation+site+localization+using+phosphoRS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Universal and confident phosphorylation site localization using phosphoRS.</a> Journal of Proteome Research. 10 (12), 5354-5362 (2011).</li>
<li>Weisser, H., Wright, J. C., Mudge, J. M., Gutenbrunner, P., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+data+analysis+pipeline+for+high-confidence+proteogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Flexible data analysis pipeline for high-confidence proteogenomics.</a> Journal of Proteome Research. 15 (12), 4686-4695 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób narzędzie programowe PoGo i jego graficzny interfejs użytkownika PoGoGUI umożliwiają szybkie mapowanie peptydów na współrzędne genomu. Narzędzie oferuje unikalne funkcje, takie jak ilościowa, potranslacyjna modyfikacja i mapowanie genomów z obsługą wariantów za pomocą adnotacji referencyjnych. W artykule przedstawiono metodę na dużej skali badaniu proteogenomicznym i podkreślono jej szybkość i wydajność pamięci w porównaniu z innymi dostępnymi narzędziami18. W połączeniu z narzędziem TrackHubGenerator, które tworzy dostępne online centra danych genomicznych i powiązanych z genomem, PoGo, dzięki graficznemu interfejsowi użytkownika, umożliwia badania proteogenomiczne na dużą skalę w celu szybkiej wizualizacji danych w kontekście genomicznym. Ponadto demonstrujemy unikalne cechy PoGo za pomocą zestawów danych przeszukiwanych w bazach danych wariantów i fosfoproteomiki ilościowej22,29.
Pojedyncze pliki, takie jak plik GCT, zapewniają cenną wizualizację i powiązania między cechami peptydów a loci genomu. Należy jednak zauważyć, że interpretacja oparta wyłącznie na nich może być trudna lub myląca ze względu na ich ograniczenie do pojedynczych aspektów proteogenomiki, takich jak unikalność, modyfikacje potranslacyjne i wartości ilościowe. Dlatego ważne jest, aby starannie wybrać, które pliki wyjściowe, opcje i kombinacje są odpowiednie dla danego pytania proteogenomicznego i zmodyfikować kombinacje. Na przykład informacje o unikalności mapowania do określonego locus genomowego mogą mieć wielką wartość dla adnotacji cechy genomowej7, podczas gdy kwantyfikacja w różnych próbkach może być bardziej odpowiednia w przypadku badań wiążących cechy genomu ze zmianami liczebności białek29. Dane wyjściowe powinny być generowane przez PoGo dla każdego ustawienia. W przypadku, gdy nie są generowane żadne dane wyjściowe lub w folderze wyjściowym wyświetlane są puste pliki, zaleca się sprawdzenie plików wejściowych pod kątem żądanej zawartości i wymaganego formatu pliku. W przypadkach, gdy format lub zawartość pliku nie jest zgodna z oczekiwaniami PoGo (np. plik FASTA rzekomo zawierający sekwencje translacji transkrypcji zawiera sekwencje nukleotydowe transkrypcji), komunikaty o błędach poproszą użytkownika o sprawdzenie plików wejściowych.
Ograniczenia protokołu i narzędzia opierają się głównie na ponownym wykorzystaniu formatów plików powszechnie stosowanych w genomice. Zmianie przeznaczenia formatów plików stosowanych w genomice do zastosowań proteogenomicznych towarzyszą określone ograniczenia. Wynika to z różnych zestawów wymagań dotyczących skoncentrowanej na genomie wizualizacji danych genomicznych i proteogenomicznych, takich jak potrzeba wizualizacji modyfikacji potranslacyjnych na podstawie danych proteomicznych. Jest to ograniczone w formatach plików genomiki przez użycie pojedynczej funkcji. Opracowano wiele podejść i narzędzi dla proteomiki, aby pewnie lokalizować modyfikacje potranslacyjne w sekwencjach peptydowych 31,32,33,34. Jednak wizualizacja wielu modyfikacji w unikalny i dostrzegalny sposób na genomie jest utrudniona przez strukturę formatów plików genomowych. W związku z tym jednoblokowa wizualizacja wielu PTM tego samego typu nie stanowi żadnej niejednoznaczności miejsc modyfikacji, ale jest konsekwencją odmiennego wymagania społeczności genomicznej, aby wizualizować tylko pojedyncze cechy na raz. Niemniej jednak PoGo ma tę zaletę, że mapuje modyfikacje potranslacyjne na współrzędne genomowe, aby umożliwić badania skoncentrowane na wpływie cech genomicznych, takich jak warianty pojedynczych nukleotydów, na modyfikacje potranslacyjne. Korzystając z PoGo, mapowanie wariantów zwiększa liczbę całkowitych mapowań. Jednak unikalne kodowanie kolorami mapowanych peptydów odróżnia wiarygodne mapowania od niewiarygodnych. Mapowaniu wariantów peptydów zidentyfikowanych na podstawie znanych wariantów pojedynczego nukleotydu może towarzyszyć wizualizacja zmapowanych peptydów wraz z wariantami w formacie VCF. W ten sposób kod kolorystyczny wskazujący na niewiarygodne mapowanie wariantu peptydu jest unieważniany przez obecność znanego wariantu nukleotydu.
Kluczowym krokiem korzystania z PoGo jest użycie odpowiednich plików i formatów. Głównym kryterium jest wykorzystanie translowanych sekwencji transkryptów jako sekwencji białek towarzyszących adnotacji w formacie GTF. Kolejnym krytycznym elementem przy rozważaniu użycia PoGo do mapowania peptydów z niezgodnością aminokwasów jest pamięć. Chociaż jest to wysoce wydajne pod względem pamięci w przypadku standardowej aplikacji, znacznie i wykładniczo rosnąca liczba możliwych mapowań z jednym lub dwoma niezgodnościami prowadzi do podobnie wykładniczego wzrostu użycia pamięci18. Proponujemy mapowanie etapowe, jak opisano w niniejszym protokole, aby najpierw zmapować peptydy bez niezgodności i usunąć je ze zbioru. Kolejne, wcześniej niezmapowane peptydy mogą być następnie mapowane przy użyciu jednego niedopasowania, a procedura może być powtórzona z dwoma niedopasowaniami dla peptydów pozostających niezmapowanych.
Ponieważ przepustowość spektrometrii mas znacznie wzrosła, a badania łączące dane genomiczne i proteomiczne stają się w ostatnich latach coraz częstsze, coraz bardziej niezbędne stają się narzędzia umożliwiające łączenie tego typu danych w tym samym układzie współrzędnych. Zaprezentowane tutaj narzędzie pomoże w połączeniu danych genomicznych i proteomicznych w celu lepszego zrozumienia badań integracyjnych w małych i dużych zbiorach danych poprzez mapowanie peptydów na adnotację referencyjną. Zachęcające jest to, że PoGo zostało zastosowane do mapowania peptydów do kandydatów na geny dostarczonych w tym samym formacie, co adnotacja referencyjna, aby wesprzeć wysiłki związane z adnotacją nowych genów ulegających ekspresji w ludzkich jądrach35. Przedstawione tutaj podejście jest niezależne od baz danych wykorzystywanych do identyfikacji peptydów. Protokół może pomóc w identyfikacji i wizualizacji nowatorskich produktów translacyjnych przy użyciu dostosowanych plików wejściowych z sekwencji translacji i powiązanych plików GTF z eksperymentów sekwencyjnych RNA.
Wprowadzono kilka podejść i narzędzi z szerokim zakresem specjalnych scenariuszy zastosowań do mapowania peptydów do współrzędnych genomowych, począwszy od mapowania peptydów bezpośrednio do sekwencji genomu, a skończywszy na mapowaniu kierowanym sekwencjonowaniem RNA. 10,11,12,13,14,15,16,17. Mogą one jednak spowodować niepowodzenie w prawidłowym mapowaniu peptydów, gdy obecne są modyfikacje potranslacyjne, a błędy w podstawowym mapowaniu odczytów sekwencjonowania RNA mogą być propagowane do poziomu peptydów. PoGo zostało opracowane specjalnie w celu pokonania tych przeszkód i poradzenia sobie z szybkim wzrostem ilościowych zestawów danych proteomicznych o wysokiej rozdzielczości w celu integracji z ortogonalnymi platformami genomicznymi. Opisane tutaj narzędzie można zintegrować z przepływami pracy o wysokiej przepustowości. Dzięki interfejsowi graficznemu PoGoGUI narzędzie jest proste w obsłudze i nie wymaga specjalistycznego szkolenia bioinformatycznego.

W komórkach genom, transkryptom i proteom wpływają na siebie nawzajem, modulując reakcję na bodźce wewnętrzne i zewnętrzne oraz współdziałając ze sobą, aby wykonywać określone funkcje prowadzące do zdrowia i choroby. Dlatego charakterystyka i kwantyfikacja genów, transkryptów i białek ma kluczowe znaczenie dla pełnego zrozumienia procesów komórkowych. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest jedną z najczęściej stosowanych strategii identyfikacji i ilościowego określania ekspresji genów i transkryptów. Jednak ekspresja białek jest powszechnie oceniana za pomocą spektrometrii mas (MS). Znaczący postęp w technologii SM w ciągu ostatniej dekady umożliwił bardziej kompletną identyfikację i kwantyfikację proteomów, dzięki czemu dane są porównywalne z transkryptomiką1. Proteogenomika i multiomika jako sposoby integracji danych NGS i MS stały się potężnymi podejściami do oceny procesów komórkowych na wielu poziomach molekularnych, identyfikując podtypy raka i prowadząc do nowych potencjalnych celów leków w raku2,3. Należy zauważyć, że proteogenomika była początkowo używana do dostarczania dowodów proteomicznych dla adnotacji genów i transkryptów4. Kilka genów, które wcześniej uważano za niekodujące, zostało niedawno poddanych ponownej ocenie, biorąc pod uwagę duże zbiory danych o tkankach ludzkich5,6,7. Ponadto dane proteomiczne są z powodzeniem wykorzystywane do wspierania działań adnotacyjnych w organizmach niemodelowych8,9. Integracja danych proteogenomicznych może być jednak dalej wykorzystywana do podkreślenia ekspresji białek w odniesieniu do cech genomowych i wyjaśnienia wzajemnych oddziaływań między transkryptami a białkami poprzez zapewnienie połączonego systemu referencyjnego i metod wspólnej wizualizacji.
W celu zapewnienia wspólnego punktu odniesienia dla danych proteomicznych, transkryptomicznych i genomicznych, zaimplementowano liczne narzędzia do mapowania peptydów zidentyfikowanych przez MS na współrzędne genomu10,11,12,13,14,15,16,17. Podejścia różnią się takimi aspektami, jak odniesienie do mapowania, obsługa przeglądarek genomu i stopień integracji z innymi narzędziami proteomicznymi, jak pokazano na Rysunek 1. Podczas gdy niektóre narzędzia mapują peptydy poddane odwrotnej translacji na genome16, inne używają adnotacji w wyszukiwarce w adnotacji białka i genu, aby zrekonstruować sekwencję nukleotydów peptide15. Jeszcze inni używają 3- lub 6-ramkowej translacji genomu do mapowania peptydów przeciwko11,13. Wreszcie, kilka narzędzi pomija sekwencje nukleotydowe i wykorzystuje translacje sekwencji aminokwasów z transkryptów zmapowanych sekwencjonowaniem RNA jako produkt pośredni do mapowania peptydów do powiązanych współrzędnych genomu10,12,14,17. Jednak translacja sekwencji nukleotydowych jest powolnym procesem, a niestandardowe bazy danych są podatne na błędy, które propagują się do mapowania peptydów. W przypadku szybkiego mapowania o wysokiej przepustowości kluczowe znaczenie ma małe i kompleksowe odniesienie. Dlatego standaryzowane odniesienie do białka z powiązanymi współrzędnymi genomu jest niezbędne do dokładnego mapowania peptydu do genomu. Nowatorskie aspekty proteogenomiki, takie jak włączanie wariantów i modyfikacji potranslacyjnych (PTM)2,3, nabierają rozpędu dzięki najnowszym badaniom. Jednak na ogół nie są one obsługiwane przez obecne narzędzia do mapowania proteogenomicznego, jak pokazano na Rysunek 1. Aby poprawić szybkość i jakość mapowania, opracowano PoGo, narzędzie, które umożliwia szybkie i ilościowe mapowanie peptydów do genomów18. Ponadto PoGo umożliwia mapowanie peptydów z maksymalnie dwoma wariantami sekwencji i adnotowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi.
PoGo zostało opracowane, aby poradzić sobie z szybkim wzrostem ilościowych zestawów danych o wysokiej rozdzielczości, rejestrujących proteomy i globalne modyfikacje, i stanowi centralne narzędzie do analiz na dużą skalę, takich jak zmienność osobista i medycyna precyzyjna. W artykule opisano zastosowanie tego narzędzia do wizualizacji obecności modyfikacji potranslacyjnej w odniesieniu do cech genomowych. Ponadto w artykule tym zwrócono uwagę na identyfikację alternatywnych zdarzeń splicingu za pomocą zmapowanych peptydów oraz mapowanie peptydów zidentyfikowanych za pomocą niestandardowych baz danych wariantów do genomu referencyjnego. Protokół ten wykorzystuje publicznie dostępne zestawy danych pobrane z archiwum PRIDE19 w celu zademonstrowania tych funkcji PoGo. Ponadto protokół ten opisuje zastosowanie TrackHubGenerator do tworzenia dostępnych online węzłów peptydów zmapowanych do genomów do badań proteogenomicznych na dużą skalę.

<table><tbody><tr><td>PoGo (oprogramowanie)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://github.com/cschlaffner/PoGo</td></tr><tr><td>PoGoGUI (oprogramowanie)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://github.com/cschlaffner/PoGoGUI</td></tr><tr><td>TrackHubGenerator (oprogramowanie)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://github.com/cschlaffner/TrackHubGenerator</td></tr><tr><td>Integrative Genomics Viewer (oprogramowanie)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>UCSC genome browser (strona internetowa)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://genome.ucsc.edu/</td></tr> <tr><td>GENCODE (strona internetowa)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://gencodegenes.org</td></tr><tr><td>Ensembl (strona internetowa)</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>http://ensembl.org bedToBigBed (oprogramowanie)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/</td></tr><tr><td>fetchChromSizes.sh (oprogramowanie)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/</td></tr></tbody></table>

szybka i ilościowa metoda modyfikacji potranslacyjnej i wariantów umożliwiła mapowanie peptydów do genomów

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Wzajemne oddziaływanie między genami, transkryptami i białkami jest kluczem do odpowiedzi komórkowych; stąd analiza poziomów molekularnych jako odrębnych jednostek jest powoli rozszerzana na badania integracyjne, aby zwiększyć zrozumienie dynamiki molekularnej w komórkach. Obecne narzędzia do wizualizacji i integracji proteomiki z innymi zbiorami danych omicznych są nieodpowiednie do badań na dużą skalę. Co więcej, rejestrują tylko podstawową identyfikację sekwencji, odrzucając modyfikacje potranslacyjne i ocenę ilościową. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy PoGo do mapowania peptydów z powiązanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i kwantyfikacją w celu odniesienia adnotacji genomu. Ponadto narzędzie zostało opracowane, aby umożliwić mapowanie peptydów zidentyfikowanych na podstawie niestandardowych baz danych sekwencji zawierających warianty pojedynczych aminokwasów. Podczas gdy PoGo jest narzędziem wiersza poleceń, interfejs graficzny PoGoGUI umożliwia badaczom niezajmującym się bioinformatyką łatwe mapowanie peptydów do 25 gatunków obsługiwanych przez adnotację genomu Ensembl. Wygenerowane dane wyjściowe zapożyczają formaty plików z dziedziny genomiki, dlatego wizualizacja jest obsługiwana w większości przeglądarek genomu. W przypadku badań na dużą skalę, PoGo jest wspierane przez TrackHubGenerator w celu tworzenia dostępnych w Internecie repozytoriów danych zmapowanych do genomów, które umożliwiają również łatwe udostępnianie danych proteogenomicznych. Przy niewielkim wysiłku narzędzie to może w ciągu zaledwie kilku minut zmapować miliony peptydów w celu odniesienia do genomów referencyjnych, przewyższając inne dostępne narzędzia oparte na tożsamości sekwencji. Protokół ten demonstruje najlepsze podejścia do mapowania proteogenomiki za pomocą PoGo z publicznie dostępnymi zestawami danych ilościowych i fosfoproteomicznych, a także badaniami na dużą skalę.

Na rysunku 5 przedstawiono schematycznie, na którym etapie standardowego procesu proteomicznego stosowane jest narzędzie PoGo18, a także dostępne opcje późniejszej wizualizacji. Proteomika typu shotgun (i.e. proteolityczne trawienie białek, a następnie chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas) stanowi jeden z etapów wstępnych mapowania proteogenomicznego. Uzyskane tandemowe widma mas są powszechnie porównywane z widmami teoretycznymi pochodzącymi z baz danych sekwencji białkowych. Badania proteogenomiczne wprowadzają do bazy danych sekwencje translacyjne nowych transkryptów o potencjale kodującym oraz niesynonimiczne warianty pojedynczego nukleotydu (SNVs), co utrudnia ich łatwe powiązanie z genomem referencyjnym8. Graficzny interfejs użytkownika PoGo (PoGoGUI) obsługuje formaty plików służące do ustandaryzowanego raportowania identyfikacji peptydów z eksperymentów spektrometrii mas i konwertuje je na uproszczony, 4-kolumnowy format pogo. PoGoGUI stanowi nakładkę na narzędzie wiersza poleceń PoGo, umożliwiając tym samym mapowanie peptydów na współrzędne genomowe z wykorzystaniem referencyjnej adnotacji genów kodujących białka, zazwyczaj dostarczanej w formacie GTF, oraz przetłumaczonych sekwencji transkryptów w formacie FASTA. PoGo generuje różne formaty wyjściowe, aby umożliwić wizualizację różnych aspektów peptydów zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii mas, w tym modyfikacji potranslacyjnych oraz kwantyfikacji na poziomie peptydów. Pliki wyjściowe w formacie BED mogą być dalej konwertowane i łączone w dostępnych online katalogach zwanych track hubs. Pojedyncze pliki wyjściowe, jak i track hubs, mogą być następnie wizualizowane w przeglądarkach takich jak UCSC Genome Browser25, Ensembl Genome Browser20, IGV24 oraz Biodalliance28 (patrz rysunek 5, dół).
Zastosowaliśmy PoGo do reanalizy roboczych map proteomu ludzkiego, przefiltrowanych pod kątem wysokiej istotności, zgodnie z opisem Wright et al.7, a następnie porównaliśmy wyniki z dwoma innymi narzędziami do mapowania proteogenomicznego, mianowicie iPiG14 oraz PGx10. Zbiór danych obejmował 233 055 unikalnych peptydów z 59 tkanek dorosłych i płodowych, co dało łącznie ponad 3 miliony sekwencji. PoGo okazało się wydajniejsze od tych narzędzi zarówno pod względem czasu wykonania (odpowiednio 6,9x i 96,4x szybciej), jak i zużycia pamięci (odpowiednio o 20% i 60% mniej), co przedstawiono na Rysunku 618. Przykład pomyślnie zmapowanego peptydy przedstawiono na Rysunku 7.
Choć PoGo znacznie przewyższył inne narzędzia pod względem szybkości i zużycia pamięci, pozwala on również na mapowanie modyfikacji potranslacyjnych oraz informacji ilościowych powiązanych z peptydami na genom. Rycina 8A schematycznie przedstawia wizualizację formatu BED w przeglądarce genomu dla peptydów mapujących do jednego eksonu oraz w obrębie miejsc splicingowych. PoGo wykorzystuje opcję kolorowania, aby ułatwić wizualną ocenę unikalności mapowania peptydów w obrębie genomu. Mapowania koloru czerwonego wskazują unikalność dla pojedynczego transkryptu, natomiast kolor czarny wyróżnia mapowanie do pojedynczego genu, przy czym peptyd ten jest wspólny dla różnych transkryptów. Mapowania szare pokazują peptyd wspólny dla wielu genów. Są one, na przykład, mniej wiarygodne przy kwantyfikacji genu lub niewiarygodne do określenia ekspresji genu. Opcja PTM BED w programie PoGo redefiniuje kod kolorystyczny, aby uwzględnić różne rodzaje modyfikacji potranslacyjnych, co pokazano na Rycynie 8B. Dodatkowo modyfikacje potranslacyjne są oznaczone grubymi blokami (patrz Rycina 8B). Pojedyncza modyfikacja potranslacyjna danego typu jest wyróżniona grubym blokiem w pozycji zmodyfikowanego reszty aminokwasowej, natomiast wiele modyfikacji potranslacyjnych tego samego typu jest objętych grubym blokiem od pierwszej do ostatniej zmodyfikowanej reszty aminokwasowej.
Zastosowaliśmy narzędzia PoGo, a następnie TrackHubGenerator do zbioru danych obejmującego 50 linii komórkowych raka jelita grubego, w tym pełny proteom i fosfoproteom29. Choć hub ścieżek załadowany w przeglądarce UCSC Genome Browser pokazuje peptydy zmapowane do genomu i podkreśla unikalność mapowań oraz miejsc fosforylacji (patrz Rysunek 9), dodatkowe dane zostały udostępnione w folderze uzupełniającym. Pliki GCT umożliwiają następnie wizualizację ilościową peptydów i fosfopeptydów w kontekście genomicznym. Jednakże pliki GCT nie zapewniają łatwej wizualizacji peptydów obejmujących miejsca splicingowe (patrz Rysunek 10 góra). Peptydy obejmujące miejsca splicingowe są dzielone na poszczególne części mapujące do egzonów. Choć identyfikacja peptydów splicingowych jest możliwa dzięki identycznym wartościom ilościowym mapowań egzonowych, załadowanie plików mapowania opartych na sekwencjach, takich jak BED lub GTF, które łączą egzony cienką linią obejmującą intron, ułatwia interpretację (patrz Rysunek 10 dół).
Aby podkreślić użyteczność mapowania z uwzględnieniem wariantów, zastosowaliśmy PoGo w dwóch konfiguracjach do zbioru danych proteomu jąder człowieka, przeszukanego w bazie neXtProt w celu poszukiwania brakujących białek przy użyciu strategii wieloenzymatycznej22. Baza neXtProt zawiera, oprócz referencyjnych sekwencji białek, ponad 5 milionów pojedynczych wariantów aminokwasowych30. Mapowanie peptydów zidentyfikowanych z pojedynczym wariantem aminokwasowym nie jest wspierane przez inne narzędzia mapujące. Zidentyfikowano łącznie 177 012 unikalnych peptydów. Z tej liczby 99,8% (176 694) peptydów zostało początkowo pomyślnie zmapowanych bez dopuszczania niedopasowań. Usunięcie ich z listy zidentyfikowanych peptydów pozwoliło wyodrębnić 0,2% (318) peptydów, które następnie zmapowano, dopuszczając jedną substytucję aminokwasową. Przyniosło to 3 446 mapowań dla 162 peptydów, które nie zostałyby zmapowane do genomu referencyjnego za pomocą żadnego innego dostępnego narzędzia. Choć średnia liczba mapowań z uwzględnieniem niedopasowania jest wysoka, 62 peptydy zmapowano tylko do jednego locus, co wskazuje na rzeczywiste sekwencje wariantowe. Przykład peptydu zmapowanego z pojedynczą substytucją aminokwasową, wraz z jego sekwencją i przetłumaczoną sekwencją genomiczną, przedstawiono na Rysunku 11.
<img alt="Schemat integracji proteogenomicznej porównujący narzędzia do mapowania cech genomicznych i proteomicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wizualne porównanie różnych narzędzi do mapowania peptydów na genom. Porównanie przedstawiono w odniesieniu do różnych aspektów. Aspekty te obejmują referencję mapowania, poziom integracji z ramami systemowymi oraz wsparcie dla przeglądarek online i offline. Dodatkowo, oddzielnie wyróżniono nowe aspekty proteogenomiki i ich wspierane funkcje. PoGo, w porównaniu z innymi narzędziami, nie posiada jedynie możliwości bezpośredniego mapowania na sekwencję genomu. Wspiera jednak wszystkie nowe funkcje, których większość pozostałych narzędzi nie obsługuje. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki kwantyfikacji miejsc fosforylacji; analiza sekwencji peptydów; dane z masowej spektrometrii białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przykład pliku wejściowego do mapowania peptydów. PoGo przyjmuje dane wejściowe w formacie rozdzielanym tabulatorami z 4 kolumnami. Nagłówki kolumn w pierwszej linii to „Experiment”, „Peptide”, „PSMs” oraz „Quant”, które wskazują odpowiednio w kolejnych liniach identyfikator eksperymentu lub próbki, sekwencję peptydu, liczbę dopasowań widma do peptydów (PSM) oraz wartość ilościową dla peptydu. Obsługiwane rozszerzenia plików to *.txt, *.tsv oraz *.pogo. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania do adnotacji białek dla konfiguracji PoGo; dane wejściowe obejmują pliki FASTA, GTF oraz wybór gatunku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Interfejs PoGoGUI z zaznaczonymi krokami wyboru plików i opcjami parametrów. Rycina przedstawia kolejne kroki wyboru i przesyłania wszystkich wymaganych plików oraz wybór opcji mapowania peptydów z modyfikacjami potranslacyjnymi na referencyjny genom ludzki. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Samouczek interfejsu przeglądarki genomu; etapy przepływu pracy oprogramowania; import plików; konfiguracja wizualizacji; bioinformatyka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Zrzut ekranu procedury przesyłania danych do Integrative Genomics Viewer (IGV). Rysunek przedstawia kroki przesyłania plików wyjściowych z PoGo do przeglądarki IGV. Ponadto pokazano opcję rozwinięcia ścieżki zmapowanych peptydów w celu wyróżnienia mapowania i sekwencji. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy białek LC-MS/MS; identyfikacja peptydów, mapowanie genomowe, integracja z przeglądarką genomu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Uproszczony schemat etapów od LC-MS/MS do wizualizacji w przeglądarkach genomu. Mapowanie PoGo następuje po identyfikacji peptydów z tandemowych widm mas. Aby przeprowadzić mapowanie do genomu, PoGo wykorzystuje adnotacje referencyjne dostarczone w formie adnotacji genomowych (GTF) oraz sekwencji translacji transkryptów (FASTA). Generowane są różne formaty wyjściowe, które mogą być oddzielnie ładowane do przeglądarek genomu. Dodatkowo pliki w formacie BED mogą być łączone w huby ścieżek (track hubs) umożliwiające wizualizację wielkoskalowych zbiorów danych. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównania zużycia pamięci i czasu wykonania; analiza procesów PoGo, PGx, iPiG." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Porównanie wydajności PoGo z PGx i iPiG. PoGo przewyższa pozostałe narzędzia w testach wydajnościowych. Przy mapowaniu 233 055 unikalnych peptydów w 59 tkankach dorosłych i płodowych, co dało ponad 3 miliony sekwencji, PoGo był odpowiednio 6,9x i 96,4x szybszy niż PGx i iPiG. Co więcej, PoGo wymagał odpowiednio o 20% i 60% mniej pamięci w porównaniu do PGx i iPiG. Podczas gdy PoGo i PGx zakończyły pracę pomyślnie, w przypadku iPiG wystąpił błąd pamięci przy 16 GB. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mapowania chromosomów przedstawiający lokalizację genów i analizę regionów kodujących białka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Przykład widoku z przeglądarki genomu UCSC dla zmapowanych peptydów. Rycina przedstawia peptydy zmapowane do genu mTOR. Podczas gdy ścieżka zbiorcza pokazuje peptydy obejmujące miejsca splicingowe oraz zmapowane tylko do jednego eksonu wraz z powiązanymi sekwencjami, ścieżki specyficzne dla tkanek podkreślają mapowanie w formacie skondensowanym. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig7v2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Diagramy wizualizacji peptydów dla wariantów transkrypty i PTM; unikalne sekwencje i modyfikacje." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Schemat wizualizacji mapowania i kodowania kolorami. (A) W standardowym pliku wyjściowym BED peptydy mapujące do jednego eksonu są przedstawione jako pojedyncze bloki (lewo), natomiast peptydy mapujące na wiele eksonów zaznaczają części pokrywające eksony w formie bloków (prawo). Introny są przedstawione jako cienkie linie łączące. Program PoGo koduje kolorami unikalność mapowania lub peptydów do genów i transkryptów, stosując system trzystopniowy. (B) Oprócz struktury blokowej formatu BED, wyjście PTM BED zaznacza pozycje modyfikacji potranslacyjnych w formie grubych bloków. Obecność pojedynczej modyfikacji PTM danego typu zaznacza zmodyfikowany resztę aminokwasu grubym blokiem, natomiast wiele miejsc tej samej modyfikacji PTM jest łączonych w długie bloki rozciągające się od pierwszego do ostatniego miejsca modyfikacji. Mapowania peptydów są dodatkowo podzielone według typu PTM i kodowane kolorami na podstawie modyfikacji. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wizualizacja danych genomicznych; schemat mapowania genów; proteomika, geny UCSC, analiza chromosomalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Widok centrum ścieżek (track hub) w przeglądarce genomu UCSC dla danych proteomu i fosfoproteomu raka jelita grubego. Centrum ścieżek obejmuje dane całego proteomu oraz fosfoproteomu. Podczas gdy kolor czerwony w ścieżkach proteomu i fosfoproteomu wskazuje na unikalność mapowania do pojedynczego transkryptu SFN, ścieżki kończące się na _ptm pokazują miejsca fosforylacji w obrębie peptydów. Tutaj kolor czerwony oznacza rodzaj modyfikacji jako fosforylację. Zidentyfikowano tylko dwa peptydy, z których każdy wykazuje pojedynczą fosforylację (grube bloki). <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig9v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Diagram mapy ciepła chromosomu 1; ekspresja genów; analiza CNKSR1 w próbkach; badanie bioinformatyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10. Widok fosfopeptydów raka jelita grubego i powiązanej kwantyfikacji w IGV. Na rycinie przedstawiono podzbiór 50 linii komórkowych nowotworowych. Widoczne są ponadto cztery kolumny bloków w różnych odcieniach jasnej czerwieni. Kolor wskazuje względną obfitość od niskiej (biały) do wysokiej (czerwony). Choć cztery kolumny mogą początkowo sugerować obecność 4 peptydów, z powiązanego pliku wyjściowego GTF opartego na sekwencji wynika jasno, że w rzeczywistości są to dwa peptydy, z których każdy obejmuje miejsce złączenia splicingowego. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig10large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, należy kliknąć tutaj.</a>
<img alt="Schemat mapowania genów z dopasowaniem sekwencji DNA w chromosomie 9 dla analizy GPSM1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 11"> 
Rycina 11. Widok peptydy z wariantem aminokwasowym w IGV. Rycina przedstawia peptyd z pojedynczym wariantem aminokwasowym zmapowanym do genomu referencyjnego na początku translacji genu GPSM1. Wariant znajduje się przy 8. reszcie aminokwasowej i skutkuje substytucją alaniny na walinę (A→V). Sekwencje translacyjne adnotowanych transkrypcji (kolor niebieski) podkreślają wariant w porównaniu z sekwencją peptydu. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy narzędzie proteogenomiczne PoGo i protokoły do szybkiej, ilościowej, potranslacyjnej modyfikacji i umożliwionego mapowania wariantów peptydów zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii mas na genomy referencyjne. To narzędzie jest przydatne do integracji i wizualizacji proteogenomicznych i osobistych badań proteomicznych w połączeniu z ortogonalnymi danymi genomicznymi.

Szybka i ilościowa metoda modyfikacji potranslacyjnej i wariantów umożliwiła mapowanie peptydów do genomów

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Ogólnym celem tego protokołu oprogramowania jest zademonstrowanie wykorzystania PoGo do mapowania peptydów z powiązanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i informacjami ilościowymi z eksperymentów spektrometrii mas w celu odniesienia genomów oraz umożliwienia integracji i wizualizacji z ortogonalnymi danymi genomicznymi. Narzędzie to może pomóc w dodawaniu informacji genomicznych do list peptydów generowanych przez badania proteomiczne spektrometrii mas, dzięki czemu można ułatwić integrację z danymi sekwencjonowania RNA. Główną zaletą tego narzędzia jest to, że jest proste w użyciu, szybkie i obsługuje dodatkowe informacje, takie jak modyfikacje potranslacyjne, kwantyfikacja i wariancja aminokwasów.Aby rozpocząć, pobierz i zainstaluj oprogramowanie pokazane w tym filmie zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Po zainstalowaniu przejdź do folderu plików wykonywalnych PoGo GUI i uruchom program, klikając dwukrotnie ikonę PoGo GUI. Użyj przycisku wyboru obok pliku wykonywalnego PoGo.Następnie przejdź do folderu plików wykonywalnych do odpowiedniego podfolderu systemu operacyjnego i wybierz plik wykonywalny PoGo. Potwierdź jego wybór, klikając przycisk otwierania. Następnie wybierz referencyjny plik wejściowy dla sekwencji białek, klikając przycisk wybierz.Przejdź do folderu danych i wybierz plik z szybkim dniem tłumaczenia. Potwierdź jego wybór, klikając przycisk Otwórz. Wybierz plik adnotacji transkrypcji za pomocą przycisku wyboru.Następnie przejdź do folderu danych, wybierz plik GTF adnotacji i kliknij otwórz. Dodaj plik identyfikacyjny peptydu za pomocą przycisku dodawania obok plików peptydowych. Tutaj wybierz plik w obsługiwanym formacie MZ Tab, MZ Ident ML lub MZ ID lub w formacie czterokolumnowym rozdzielonym tabulatorami.Dodatkowo odznacz pola wyboru obok BED NGTF w wyborze formatu wyjściowego. Pozostaw zaznaczone tylko PTM BED i GCT. Następnie wybierz odpowiedni gatunek dla danych z listy rozwijanej i rozpocznij mapowanie, klikając start.Najpierw załaduj plik wyjściowy PoGo kończący się na _ptm. bed do przeglądarki integrative genomics. Powtórz tę czynność, aby załadować również plik kończący się na _noptm.bed.Ten plik zawiera wszystkie peptydy znalezione bez żadnych modyfikacji. Zmień kolejność ścieżek, przeciągając je i upuszczając w żądane miejsce na liście. Każdy plik będzie wyświetlany jako osobne ścieżki z nazwą pliku identyfikującą ścieżkę.Każdy utwór jest początkowo pokazany w sposób zwinięty. Aby je rozwinąć, kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę ścieżki i wybierz rozwinięte, aby uzyskać pełny widok peptydów, w tym sekwencji. Teraz załaduj plik kończący się na gct.Ten plik zawiera informacje o ilościowym oznaczaniu peptydów. W przeciwieństwie do wcześniej załadowanych plików, każda próbka z adnotacjami zostanie załadowana jako osobna ścieżka. Reorganizuj próbki zgodnie z potrzebami za pomocą operacji przeciągnij i upuść.Poruszaj się po genomie, wybierając chromosom z menu rozwijanego, klikając i przytrzymując sekcję chromosomu, aby powiększyć lub wpisując współrzędne genomu. Mapowanie PoGo może odbywać się za pomocą graficznego interfejsu użytkownika lub interfejsu wiersza poleceń. W tej części protokołu interfejs wiersza poleceń służy do podkreślenia wymienności.Aby zmapować warianty peptydów uzyskane w poprzednich krokach w protokole tekstowym do genomu referencyjnego, otwórz wiersz polecenia i przejdź do folderu plików wykonywalnych PoGo. Następnie wpisz pokazane tutaj polecenie. Potwierdź wykonanie, naciskając Enter i poczekaj, aż wykonanie zostanie zakończone, zanim przejdziesz dalej.Wizualizuj peptydy zmapowane bez niezgodności i z niezgodnością w przeglądarce genomiki integracyjnej. W oprogramowaniu graficznego interfejsu użytkownika PoGo dodaj pliki identyfikacyjne peptydów za pomocą przycisku dodawania obok plików peptydowych i wybierz jeden lub wiele plików, a także przeciągnij i upuść do pustego pola pod plikami peptydowymi. Następnie odznacz pola wyboru obok PTM BED, GTF i GCT w sekcji formatu wyjściowego i pozostaw zaznaczone tylko BED.Dodatkowo wybierz opcję scal wiele plików wejściowych w jedno wyjście. Spowoduje to, że pojedynczy plik wyjściowy połączy wszystkie peptydy plików wejściowych. Pozostawienie tej opcji niezaznaczonej spowoduje sekwencyjne wykonanie programu dla każdego pliku wejściowego z osobna.Następnie wybierz odpowiednie gatunki dla danych z listy rozwijanej, która jest spójna z plikami NGTF dnia postu. Po wybraniu rozpocznij mapowanie, klikając przycisk Start. Aby wygenerować koncentrator ścieżki z zamapowanych peptydów, otwórz okno terminala i wpisz następujące polecenie w wierszu polecenia.Potwierdź wykonanie, naciskając Enter. Wykonanie zajmie tylko krótki czas. Po zakończeniu przenieś wygenerowany hub ścieżek wraz z całą jego zawartością na dostępny w sieci serwer FTP lub GitHub.W przeglądarce internetowej przejdź do przeglądarki UCSC Genome i wybierz pozycję My Data Track Hubs. Następnie kliknij zakładkę Moje Huby. Skopiuj adres URL do centrum ścieżek w polu tekstowym, a następnie załaduj węzeł ścieżek, klikając przycisk Dodaj centrum.Na koniec wybierz przeglądarkę genomu, aby przejść do widoku przeglądarki. Niestandardowe centrum ścieżek zostanie wyświetlone u góry listy. Jeśli wiele plików BED zbudowało podstawę dla koncentratora ścieżek, każdy z plików będzie reprezentowany jako oddzielna ścieżka w centrum.PoGo i dwa inne narzędzia do mapowania proteogenomicznego są tutaj porównywane pod kątem ogólnego zużycia pamięci i analitycznego czasu działania. PoGo znacznie przewyższa inne narzędzia zarówno pod względem szybkości, jak i pamięci, a także jest w stanie mapować modyfikacje potranslacyjne i informacje ilościowe związane z peptydami na genomie. PoGo wykorzystuje opcję kolorowania, aby zapewnić łatwą pomoc wizualną w odniesieniu do unikalności mapowania peptydów w genomie.Mapowania w kolorze czerwonym wskazują na unikalność pojedynczego transkryptu, podczas gdy blok podkreśla mapowanie do pojedynczego genu. Szare mapowania pokazują peptydy wspólne dla wielu genów. Opcja PTM BED w PoGo na nowo definiuje kod kolorystyczny, aby dostosować go do różnych typów modyfikacji potranslacyjnych, wskazując lokalizację modyfikacji za pomocą grubego bloku na zmodyfikowanej reszcie aminokwasowej.W przedstawionych tutaj danych dotyczących proteomu reprezentujących raka jelita grubego, zidentyfikowano tylko dwa peptydy, z których każdy wykazywał pojedynczą fosforylację. Informacje zawarte w wyjściowym pliku GCT zawierają wartości ilościowe dla regionów genomu pokrytych peptydami. Peptydy rozciągające się w poprzek połączeń spawowych są dzielone na części bez łączenia.Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat łączenia, wymagany jest dodatkowo wyjściowy plik GTF. Po pobraniu i skonfigurowaniu sekwencji białek referencyjnych i adnotacji, tysiące peptydów można zmapować na współrzędne genomu w czasie krótszym niż pięć minut, jeśli nie dopuszcza się niezgodności sekwencji. Próbując mapować peptydy na genomy referencyjne za pomocą PoGo, ważne jest, aby pamiętać o użyciu translowanych sekwencji transkryptów kodujących białka i związanej z nimi adnotacji transkryptu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać PoGo i PoGo GUI do mapowania peptydów z eksperymentów proteomicznej spektrometrii mas z powiązanymi informacjami na przywoływane genomy i ich wizualizację.

a-fast-quantitative-method-for-post-translational-modification

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Ten film pokazuje oczyszczanie peptydów za pomocą procedury STAGE Tip. Miniaturowa kolumna zawierająca kulki żywicy połączone z długimi łańcuchami węglowodorowymi ułatwia oczyszczanie oparte na oddziaływaniach hydrofobowych. Po załadowaniu wstępnie strawionej próbki peptydu do kolumny, fragmenty peptydu wiążą się z kulkami żywicy, umożliwiając przejście zanieczyszczeń. W celu elucji fragmentów peptydu stosuje się bufor elucyjny, który zakłóca oddziaływanie hydrofobowe.

Procedura końcówki STAGE do odsalania i oczyszczania peptydów

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Poznaj narzędzie PoGo do szybkiego mapowania peptydów z modyfikacjami potranslacyjnymi na genomy referencyjne. Umożliwia integrację danych proteomicznych z sekwencjonowaniem RNA i wizualizację w przeglądarce genomowej.

Szybka i ilościowa metoda modyfikacji potranslacyjnej i wariantów umożliwiła mapowanie peptydów do genomów

Przeglądaj więcej filmów