Name: Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę śledzenia tymocytów in vivo w przedniej komorze oka myszy za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej. Technika umożliwia rejestrację rekrutacji progenitorów i emigracji dojrzałych limfocytów T w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) i R21ES025673 (AC), oraz przez grant BEST/2015/043 (Consellería de Educació, cultura i esport, Generalitat valenciana, Walencja, Hiszpania) (EO). Autorzy dziękują zespołowi SENT z Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Walencja, Hiszpania oraz Alberto Hernandezowi z Centro de Investigación Príncipe Felipe, Walencja, Hiszpania za pomoc w filmowaniu i montażu wideo.

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (IACUC) Uniwersytetu w Miami zatwierdził wszystkie eksperymenty zgodnie z wytycznymi IACUC.
1. Izolacja i przycinanie noworodków
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie odczynniki i narzędzia w autoklawie lub innymi metodami, zapewniając sterylne warunki.</li>
	<li>Aby zminimalizować zanieczyszczenia, wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać pod kapturem z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Przed eutanazją myszy dawców napełnij sterylne naczynie o średnicy 60 mm sterylnym, wstępnie schłodzonym 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4) i umieść ją na lodzie. Będzie on służył do płukania i przechowywania wyciętej thymi od myszy dawców przed przeszczepem.</li>
	<li>Przystąp do eutanazji nowonarodzonych myszy dawców przez ścięcie, zgodnie z wytycznymi etycznymi.</li>
	<li>Umieść mysz na sterylnych, chłonnych ręcznikach papierowych w pozycji grzbietowej pionowej i spryskaj, a następnie przetrzyj brzuch myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Odsłoń klatkę piersiową, wykonując powierzchowne nacięcie w kształcie litery V na poziomie dolnej części brzucha i przeciąć skórę prostymi 10-centymetrowymi nożyczkami preparacyjnymi wzdłuż brzusznej linii środkowej, aby pozostawić otwór około 0,5-1 cm na poziomie klatki piersiowej. Zawiń skórę z każdej strony klatki piersiowej, aby odsłonić klatkę piersiową.</li>
	<li>Wykonaj dwa głębsze 0,5-1 cm boczne nacięcia przez przeponę i klatkę piersiową tym samym typem nożyczek, aby uzyskać dostęp do górnego śródpiersia w przedniej części klatki piersiowej. Grasica powinna pojawić się jako dwa blade płaty tuż nad sercem.</li>
	<li>Umieść zestaw zakrzywionych kleszczy pod grasicą i pociągnij pionowo, aby wydobyć cały narząd. Zapobiegaj zagięciu klatki piersiowej za pomocą kleszczy. W razie potrzeby użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie rozerwać tkankę łączną otaczającą narząd, nie naruszając kapsułki przed ekstrakcją narządu. 
	UWAGA: Ten krok jest ułatwiony dzięki użyciu lunety sekcyjnej.</li>
	<li>Zanurz wyizolowaną grasicę w zimnym sterylnym 1x PBS (pH 7,4) wcześniej wystawionym w sterylnym naczyniu o średnicy 60 mm i przetnij przesmyk łączny skalpelem, aby oddzielić płaty grasicy. Usuń wszelkie zanieczyszczenia z naczynia, nie uszkadzając kapsułki. Aby zminimalizować czas ekspozycji, należy przyciąć płatki tymianku tuż przed implantacją. 
	UWAGA: Każda izolowana grasica nowonarodzonego zwykle renderuje sześć segmentów o szerokości około 1 mm dla maksymalnie trzech myszy gospodarzy podczas otrzymywania implantów w obu oczach.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.4-1.9 dla każdej myszy dawcy. Aby zminimalizować czas, w którym te grasice są narażone, izoluj jedną grasicę na raz.</li>
</ol>
2. Zagnieżdżenie się grasicy w przedniej komorze oka
<ol>
	<li>Przed przeszczepem należy oznaczyć i zważyć każdą mysz biorcę.</li>
	<li>Użyj dawki od 1 do 2% oparów izofluoranu, aby znieczulić mysz biorcy. Zapewnij odpowiednie znieczulenie poprzez brak odruchu po uszczypnięciu palca u nogi przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.</li>
	<li>Postępuj z przeszczepem segmentów grasicy w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Umieść mysz w bocznej pozycji leżącej tak, aby jedno oko było skierowane do góry, bezpośrednio wystawione na soczewkę lunety.</li>
		<li>Wyciąć jeden z izolowanych płatów grasicy leżących w zimnym naczyniu 60 mm wypełnionym PBS (pH 7,4) na kawałki o szerokości do 1 mm pod implant. Postępuj zgodnie z zygzakowatym wzorem, aby upewnić się, że każdy segment zawiera korę grasicy i rdzeń. Do przycinania używaj nożyczek vannas zgodnie ze wskazówkami podanymi w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. 
		UWAGA: Przycinanie grasicy powinno być wykonane tuż przed implantacją, aby zoptymalizować wszczepienie tkanki.</li>
		<li>Zaczynając od podstawy rogówki odpowiadającej obszarowi chirurgicznemu, wprowadź końcówkę igły G18 o średnicy 40 mm, aby wykonać małe nacięcie w zewnętrznych warstwach rogówki, tak aby można było wprowadzić końcówkę nożyczek preparacyjnych.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie boczne o średnicy 5-10 mm bezpośrednio wokół podstawy rogówki za pomocą nożyczek vannas, mocno przytrzymując otwór rogówki, aby zapobiec ponownemu uszczelnieniu. Używaj kleszczy z płaskimi końcami, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.</li>
		<li>Chwyć przecięty nabłonek rogówki i odsłoń otwór, przytrzymując rogówkę parą płaskich kleszczy, jednocześnie wpychając segment grasicy przez otwór. W razie potrzeby zwilż oko sterylnym 1x PBS (pH 7,4) lub sztucznymi łzami, aby zapobiec wysuszeniu tkanek do czasu zakończenia manipulacji.</li>
		<li>Delikatnie dociśnij powierzchnię oka, aby przesunąć wprowadzony segment tkanki do pozycji bocznej w stosunku do źrenicy, aby zachować funkcję oka. Upewnij się, że przeszczep leży w miejscu przeciwległym do otworu oka, aby zapobiec tylnej ingerencji w obrazowanie przez zmętnienie.</li>
		<li>Za pomocą płaskich kleszczy mocno dociśnij przez około 3-5 sekund obie strony otworu rogówki do siebie, aby ułatwić samouszczelnienie. Zabieg nie wymaga zszywania ani szycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli przeszczepy są wykonywane na obu oczach, obróć mysz na przeciwną boczną stronę, aby bezpośrednio wystawić drugie oko na soczewkę mikroskopu preparacyjnego i powtórzyć kroki 2.3.2-2.3.7.</li>
	<li>Po zakończeniu operacji umieść mysz z powrotem w pustej klatce ogrzanej lampą grzewczą.</li>
	<li>Upewnij się, że każda przeszczepiona mysz odzyska pełną mobilność i świadomość przed umieszczeniem jej w klatce dzielonej z innymi zwierzętami. Odbywa się to zwykle w ciągu 1 godziny po zabiegu.</li>
	<li>Po przeszczepie należy w razie potrzeby potraktować myszy środkami przeciwbólowymi i podać myszom paracetamol w stężeniu 1,6 mg/ml w wodzie pitnej.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.2-2.9 dla każdej myszy odbiorcy.</li>
	<li>Monitoruj pooperacyjną aktywność zwierząt, a także wygląd wszczepionych oczu, aby wykryć potencjalne komplikacje zdrowotne.</li>
</ol>
3. Obrazowanie konfokalne wszczepionego thymi za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D z fluorescencją pojedynczych fotonów
<ol>
	<li>Znieczulić mysz biorcę za pomocą dawki od 1 do 2% oparów izofluoranu. Upewnij się, że znieczulenie jest prawidłowe dzięki braku odruchu po uszczypnięciu palca u nogi przed rozpoczęciem procedury obrazowania</li>
	<li>Umieść mysz na stałej platformie mikroskopu stage w bocznej pozycji leżącej, tak aby jedno oko było skierowane do góry. Na platformie mikroskopowej umieszczona jest poduszka grzewcza, która zapewnia stałą temperaturę ciała myszy podczas zapisów. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje można znaleźć na rysunku uzupełniającym 1.</li>
	<li>Włóż główkę myszy do stereotaktycznego uchwytu na głowę i wyreguluj pokrętło, aby unieruchomić główkę myszy w bocznej pozycji, umożliwiając bezpośredni dostęp obiektywu mikroskopu do oka trzymającego przeszczep grasicy.</li>
	<li>Umieść pysk myszy w masce gazowej, aby zwierzę było znieczulone przez cały czas trwania zabiegu. Pozwala to na regulację oparów izofluoranu w zależności od potrzeb.</li>
	<li>Aby ułatwić stabilizację oka podczas nagrań, unikając jednocześnie cofnięcia powiek, odciągnij powieki, trzymając oko na brzegu rogówki za pomocą pęsety, której końcówki są zakryte rurką polietylenową, która jest przymocowana do solidnego przegubu uniwersalnego UST-2. Taki układ pozwala na stabilne unieruchomienie głowy i oka oraz zapewnia elastyczność bez zakłóceń przepływu krwi w oku, jak opisano wcześniej22. 
	UWAGA: Rysunki uzupełniające 1B, C pokazują kompletny zespół.</li>
	<li>Dodaj kilka kropli sterylnej soli fizjologicznej lub sztucznych łez jako płyn zanurzeniowy między rogówką a soczewką, przed umieszczeniem obiektywu mikroskopu na oku myszy. 
	UWAGA: Dodatkowe krople są dozowane w razie potrzeby przez cały czas trwania zabiegu, aby utrzymać ścieżkę mikroskopu i zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Najpierw użyj soczewki o małym powiększeniu (5X), aby zlokalizować grasicę w polu mikroskopu. Następnie przełącz się na obiektywy zanurzeniowe o wyższej rozdzielczości (10, 20 i 40X) z dużą odległością roboczą. Unikaj fotouszkodzeń LSM i wybielania implantu grasicy, stosując minimalną moc lasera i maksymalnie skracając czas skanowania. Osiąga się to za pomocą skanera rezonansowego mikroskopu. 
	UWAGA: Używany przez nas mikroskop konfokalny jest wyposażony w rezonansowe zwierciadła skanujące, które są w stanie zbierać obrazy z prędkością 25 klatek/s. Inne marki mają własne mikroskopy ze skanerami rezonansowymi.</li>
	<li>Wybierz tryb akwizycji za pomocą oprogramowania mikroskopu i uruchom tryb skanera rezonansowego. Następnie wybierz tryb obrazowania XYZT i skonfiguruj ustawienia akwizycji w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Włącz laser argonowy i ustaw moc na 30% w celu wzbudzenia fluorescencji.</li>
		<li>Wybierz linię lasera wzbudzającego i ustaw sterowanie akustyczno-optycznym rozdzielaczem wiązki (AOBS) dla różnych długości fal emisji. Ponadto, aby wykryć rozproszenie wsteczne i wyznaczyć strukturę tkanki, należy jednocześnie użyć detekcji odbicia. 
		UWAGA: Po wybraniu zestawu kolorów do wzbudzenia (GFP i RFP), AOBS jest automatycznie programowany do kierowania tych linii wzbudzenia na próbkę i przesyłania emisji między nimi. Na przykład dla GFP i RFP używamy wąskich pasm odbicia dla światła wzbudzającego około odpowiednio 488 nm i 561 nm. Pozostawia to szerokie pasma do zbierania emitowanych fotonów fluorescencyjnych, zmniejszając w ten sposób zapotrzebowanie na moc lasera i czas akwizycji. W trybie odbicia AOBS jest używany jako rozdzielacz wiązki 50/50 do obrazowania światła odbitego o dowolnej długości fali od tych używanych do wykrywania emisji fluorescencyjnej.</li>
		<li>Zbierz emisję na wybranej długości fali, a następnie wybierz rozdzielczość 512×512 pikseli i rozpocznij obrazowanie na żywo, naciskając przycisk Na żywo, dostosowując poziomy wzmocnienia w razie potrzeby (typowe wzmocnienie wynosi około 600 V).</li>
		<li>Zdefiniuj początek i koniec stosu z, skupiając się na górnej części implantu grasicy i wybierz pozycję Początek, a następnie przejdź do ostatniej płaszczyzny, która może być zogniskowana w wszczepionej grasicy, i wybierz pozycję Koniec. Użyj kroku Z o rozmiarze 5 μm. Oprogramowanie automatycznie obliczy liczbę płaszczyzn konfokalnych.</li>
		<li>Wybierz przedział czasu akwizycji każdego stosu z (zwykle od 1,5 do 2 sekund) i wybierz opcję Pobieraj do momentu zatrzymania dla ciągłego obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naciśnij przycisk Start, aby zainicjować.</li>
	<li>Zobrazuj przeszczepy wielokrotnie w różnym czasie od tego samego zwierzęcia, powtarzając kroki 3.1-3.9. 
	UWAGA: Jeśli zwierzę trzyma przeszczepy na obu oczach, nagrania z obu oczu można wykonać, powtarzając kroki 3.2-3.9 po zmianie pionowej strony głowy myszy.</li>
</ol>

<ol><li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li>
<li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+find+your+way+through+the+thymus%3A+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li>
<li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+egress+from+the+thymus%3A+Should+I+stay+or+should+I+go%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li>
<li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration%3A+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li>
<li>Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoned+out%3A+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li>
<li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li>
<li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652(2008).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li>
<li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li>
<li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160(2005).</li>
<li>Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development%3A+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).</li>
<li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaggregate+thymus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905(2008).</li>
<li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li>
<li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504(2012).</li>
<li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li>
<li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li>
<li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li>
<li>Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li>
<li>Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li>
<li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemestry%22%5BJournal%5D)">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li>
<li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li>
<li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na znaczenie procesu dojrzewania limfocytów T dla indywidualnej kompetencjiimmunologicznej4 oraz przypuszczalny wpływ dynamiki komórek prekursorowych na dojrzałe limfocyty T wytwarzane przez grasicę 2,3, zainwestowano szeroko zakrojone wysiłki w celu opracowania alternatyw dla klasycznego podejścia opartego na migawkach tkanek stałych.
Chociaż wycinki tkanek i inne eksplantaty są wyraźnie lepsze w odt...

Wewnątrzgrasicze różnicowanie limfocytów T i selekcja subpopulacji komórek T stanowią kluczowe procesy dla rozwoju i utrzymania odporności komórkowej u kręgowców1. Proces ten obejmuje złożoną sekwencję ściśle zorganizowanych zdarzeń, w tym rekrutację komórek progenitorowych z krwiobiegu, proliferację i migrację komórek, różnicową ekspresję białek błonowych i masową zaprogramowaną śmierć komórki w celu selekcji podzbiorów. Rezultatem jest uwolnienie dojrzałych limfocytów T reagujących na szerokie spektrum obcych antygenów, wykazując jednocześnie zminimalizowane odpowiedzi na własne peptydy, które ostatecznie kolonizują obwodowe narządy limfatyczne osobnika2,3. Nieprawidłowa selekcja tymocytów z repertuaru αβTCR prowadzi do chorób autoimmunologicznych lub zaburzeń równowagi immunologicznej4, które wynikają głównie z defektów podczas procesów odpowiednio negatywnej lub dodatniej selekcji prekursorów.
Kierunkowa migracja tymocytów przez grasicę jest nieodłącznym elementem wszystkich etapów dojrzewania limfocytów T i jest przewidziana jako seria jednoczesnych lub sekwencyjnych wielu bodźców, w tym chemokin, adhezji i deadhezji interakcji białkowych z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)3,5. Badania nad utrwalonymi tkankami dostarczyły krytycznych informacji dotyczących wzorców ekspresji sygnałów migracyjnych tymocytów w zdefiniowanych mikrośrodowiskach grasicy5,6, podczas gdy badania ex vivo ujawniły dwa powszechne zachowania migracyjne tymocytów w dwóch histologicznie odrębnych obszarach narządu: powolne ruchy stochastyczne w korze i szybka, ograniczona ruchliwość w rdzeniu7,8,9,10,11,12,13. Zwiększone wskaźniki migracji korelują z pozytywną selekcją grasicy13, a selekcja negatywna jest związana z zachowaniem pełzania, co potwierdza hipotezę, że kinetyka podróży przez grasicę determinuje prawidłowe dojrzewanie tymocytów. Pomimo ich znaczenia, topologia interakcji tymocyt-zręb komórek i dynamika ruchliwości tymocytów w mikrośrodowiskach narządowych podczas dojrzewania limfocytów T pozostają słabo zdefiniowane.
Większość badań ex vivo przeprowadzonych do tej pory obejmuje hodowle narządów grasicy płodu lub reagregacji14,15, wycinki tkanek lub nienaruszone eksplantaty płata grasicy, gdzie ruchy tymocytów są wizualizowane za pomocą dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej (TPLSM)8, technika obrazowania przyżyciowego z ograniczoną maksymalną odległością roboczą i głębokością obrazowania 1 mm zgodnie z badaną tkanką16. W przeciwieństwie do pracochłonnych kultur narządów grasicy, które polegają na wydłużonym czasie inkubacji do tworzenia struktur 3D, zarówno technika plastrów grasicy, jak i podejście oparte na nienaruszonym płacie grasicy pozwalają na kontrolowane wprowadzanie określonych podzbiorów wstępnie znakowanych tymocytów do środowiska natywnej architektury tkankowej. Ponieważ jednak w tych modelach nie ma przepływu krwi, są one wyraźnie ograniczone do badania procesu rekrutacji komórek progenitorowych osadzania grasicy (TSP) do miąższu grasicy lub dynamiki wychodzenia grasicy dojrzałych limfocytów T.
Modele in vivo do badania fizjologii dojrzewania limfocytów T grasicy u myszy obejmują przeszczepy fragmentów lub całych płatów narządowych umieszczone wewnątrz torebki nerkowej17 lub śródskórnie18. Chociaż opcje te wykazały swoją przydatność w badaniu ogólnoustrojowego funkcjonalnego wszczepienia tkanki, położenie przeszczepów grasicy głęboko w zwierzęciu lub pokrytych warstwami nieprzezroczystej tkanki ogranicza ich zastosowanie do badania in vivo implantów za pomocą TPLSM.
Przednia komora oka zapewnia łatwo dostępną przestrzeń do bezpośredniego monitorowania każdej przeszczepionej tkanki dzięki przezroczystości warstw rogówki. Zaletą jest to, że podstawa komory utworzonej przez tęczówkę jest bogata w naczynia krwionośne i autonomiczne zakończenia nerwowe, co umożliwia szybką rewaskularyzację i ponowne unerwienie przeszczepów19,20. Dr Caicedo z powodzeniem wykorzystał tę anatomiczną przestrzeń do konserwacji i badania podłużnego wysp trzustkowych w przeszłości21. Tutaj pokazujemy, że strategia ta nie tylko stanowi ważne podejście do badania dynamiki tymocytów w natywnej strukturze narządu, ale także w unikalny sposób pozwala na rozszerzenie zapisów podłużnych in vivo na badanie etapów rekrutacji progenitorów i egresji dojrzałych komórek T u myszy.

<table><tbody><tr><td>Waporyzator izofluoranu z izofluoranem</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>VetFlo-1215</td><td></td></tr><tr><td>Luneta sekcyjna ze źródłem światła</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do precyzyjnego wypreparowania</td><td>WPI</td><td>500455</td><td></td></tr><tr><td>Średnie kleszczyki preparacyjne</td><td>WPI</td><td>501252</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki preparacyjne z zakrzywioną końcówką</td><td>WPI</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas</td><td>WPI</td><td>503371</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>WPI</td><td>503243</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>WPI</td><td>500353</td><td></td></tr><tr><td>40 mm Igły 18G</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta transferowa</td><td>Thermofisher</td><td>201C</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza i lampa grzewcza</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>Podczerwień</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>VWR</td><td>83,813,360</td><td></td></tr><tr><td>60 mm sterylne naczynie</td><td>SIGMA</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 1x PBS pH(7,4)</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne chusteczki</td><td>Kimberly-Clark</td><td>LD004</td><td></td></tr><tr><td>Leki przeciwbólowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3035-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej lub Viscotears</td><td>Novartis</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ FLIII</td><td></td></tr><tr><td>Adapter do trzymania głowicy</td><td>Narishige</td><td>SG-4N-S</td><td></td></tr><tr><td>Maska przeciwgazowa</td><td>Narishige</td><td>GM-4_S</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Telstar</td><td>BIO IIA</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Celem prezentowanej metody jest pokazanie, po raz pierwszy, przeszczepu nowonarodzonego thymi do przedniej komory oka izogenicznych dorosłych myszy w celu in vivo podłużnego monitorowania dynamiki tymocytów w czasie rzeczywistym w unaczynionym segmencie grasicy. Po przeszczepie laserowa mikroskopia skaningowa (LSM) przez rogówkę umożliwia nieinwazyjne wielokrotne obrazowanie in vivo na poziomie rozdzielczości komórkowej. Co ważne, podejście to dodaje do wcześniejszych modeli obrazowania dojrzewania limfocytów T przyżyciowych możliwość ciągłej rekrutacji komórek progenitorowych i rejestracji wyjścia dojrzałych komórek T u tego samego zwierzęcia. Dodatkowymi zaletami systemu są przezroczystość przeszczepionego obszaru, pozwalająca na makroskopowe szybkie monitorowanie wszczepionej tkanki oraz dostępność do implantu pozwalająca na miejscowe i dodatkowo ogólnoustrojowe leczenie. Głównym ograniczeniem jest objętość tkanki, która mieści się w zmniejszonej przestrzeni komory oka, co wymaga przycinania płata. Integralność narządów jest maksymalizowana poprzez preparowanie płatów grasicy we wzorcach, które wcześniej okazały się funkcjonalne dla produkcji dojrzałych komórek T. Technika ta jest potencjalnie odpowiednia do badania środowiska istotnych z medycznego punktu widzenia pytań związanych z funkcją grasicy, które obejmują autoimmunizację, niedobór odporności i tolerancję centralną; procesy, które pozostają mechanicznie słabo zdefiniowane. Dokładna analiza mechanizmów kierujących migracją, różnicowaniem i selekcją tymocytów powinna doprowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na rozwijające się limfocyty T.

grasiczkę od noworodków myszy izolowano z myszy B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/Jas zgodnie z opisem w niniejszym protokole (kroki 1.1-1.9). U tych myszy transgenicznych promotor beta-aktyny kurczaka kieruje ekspresją wariantu czerwonego białka fluorescencyjnego DsRed. MST, pod wpływem wczesnego wzmacniacza cytomegalowirusa (CMV), ułatwia śledzenie implantów.
Aby zapobiec odrzuceniu tkanki, jako gospodarzy wybrano osobniki...

Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii dotyczące mechanizmów autoimmunizacji, niedoboru odporności, tolerancji centralnej i inwolucji grasicy. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona podłużne rejestrowanie in vivo rekrutacji progenitorów i ewakuacji dojrzałych komórek T w unaczynionych i przeszczepionych segmentach grasicy myszy. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozwój i funkcję grasicy, może być również stosowana do innych tkanek, takich jak wyspy trzustkowe lub kłębuszki nerkowe.Aby wyizolować grasicę, umieść mysz na sterylnych, chłonnych ręcznikach papierowych w pozycji grzbietowej pionowej w kapturze z przepływem laminarnym i spryskaj i przetrzyj brzuch myszy 70% etanolem. Wykonaj powierzchowne nacięcie w kształcie litery V w dolnej części brzucha, aby odsłonić klatkę piersiową i użyj prostych 10-centymetrowych nożyczek preparacyjnych, aby wykonać nacięcie od 0,5 do jednego centymetra w klatce piersiowej wzdłuż brzusznej linii środkowej. Zawiń skórę po każdej stronie klatki piersiowej, aby odsłonić klatkę piersiową i wykonaj dwa dodatkowe głębsze nacięcia boczne o długości od 0,5 do jednego centymetra przez przeponę i

real-time-vivo-tracking-thymocytes-anterior-chamber-eye-laser

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania chimer noworodkowych, a także sekcji i przygotowania grasicy do obrazowania ex vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Obrazowanie in situ grasicy myszej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Ten film opisuje obrazowanie rezydentów infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8 znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w ludzkich wycinkach guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Analiza w czasie rzeczywistym migracji rezydentnych limfocytów T w różnych regionach guza przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Nowe podejście łączące przeszczep wewnątrzgałkowy i mikroskopię konfokalną umożliwia podłużne, nieinwazyjne obrazowanie w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek w przeszczepionych tkankach in vivo.  Pokazujemy, jak przeszczepić wyspy trzustkowe do przedniej komory oka myszy.

Przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Poznaj metodę śledzenia tymocytów in vivo w przedniej komorze oka myszy za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej. Technika umożliwia rejestrację rekrutacji progenitorów i emigracji dojrzałych limfocytów T w czasie rzeczywistym.

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

Przeglądaj więcej filmów