Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii dotyczące mechanizmów autoimmunizacji, niedoboru odporności, tolerancji centralnej i inwolucji grasicy. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona podłużne rejestrowanie in vivo rekrutacji progenitorów i ewakuacji dojrzałych komórek T w unaczynionych i przeszczepionych segmentach grasicy myszy. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozwój i funkcję grasicy, może być również stosowana do innych tkanek, takich jak wyspy trzustkowe lub kłębuszki nerkowe.

Aby wyizolować grasicę, umieść mysz na sterylnych, chłonnych ręcznikach papierowych w pozycji grzbietowej pionowej w kapturze z przepływem laminarnym i spryskaj i przetrzyj brzuch myszy 70% etanolem. Wykonaj powierzchowne nacięcie w kształcie litery V w dolnej części brzucha, aby odsłonić klatkę piersiową i użyj prostych 10-centymetrowych nożyczek preparacyjnych, aby wykonać nacięcie od 0,5 do jednego centymetra w klatce piersiowej wzdłuż brzusznej linii środkowej. Zawiń skórę po każdej stronie klatki piersiowej, aby odsłonić klatkę piersiową i wykonaj dwa dodatkowe głębsze nacięcia boczne o długości od 0,5 do jednego centymetra przez przeponę i klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do górnego śródpiersia w przedniej części klatki piersiowej.

Grasica powinna pojawić się jako dwa blade płaty tuż nad sercem. Umieść zakrzywione końcówki kleszczy pod grasicą i pociągnij pionowo, aby wydobyć cały narząd, zapobiegając odchyleniu się klatki piersiowej za pomocą pary prostych kleszczy. Następnie zanurz wyizolowaną grasicę w sterylnym 60-mililitrowym naczyniu zawierającym zimny sterylny PBS na lodzie i użyj skalpela, aby przeciąć przesmyk łączny w celu oddzielenia płatów grasicy.

Przed przeszczepem należy oznaczyć i zważyć każdą mysz biorcę, a następnie umieścić pierwsze zwierzę w bocznej pozycji leżącej z jednym okiem bezpośrednio wystawionym na soczewkę mikroskopu preparacyjnego. Za pomocą nożyczek Vannas wytnij jeden z izolowanych płatów grasicy o szerokości do jednego milimetra zgodnie z zygzakowatym wzorem, aby upewnić się, że każdy segment zawiera trochę kory grasicy i tkanki rdzenia. Bardzo ważne jest, aby przyciąć grasicę tuż przed implantacją, ponieważ duże kawałki mogą nie zszczepiać się prawidłowo.

Następnie, zaczynając od podstawy rogówki pola operacyjnego, użyj końcówki 40-milimetrowej igły o rozmiarze 18, aby wykonać małe nacięcie w zewnętrznych warstwach rogówki, aby można było wprowadzić końcówkę nożyczek preparacyjnych. Użyj nożyczek, aby wykonać od pięciu do 10 milimetrowych nacięć z boku bezpośrednio wokół podstawy rogówki, używając płaskich kleszczy, aby mocno utrzymać rogówkę otwartą, aby zapobiec ponownemu uszczelnieniu. Chwytając przecięty nabłonek rogówki płaskimi szczypcami, utrzymuj otwór w rogówce, jednocześnie wprowadzając segment grasicy przez otwór.

Ważne jest, aby szybko wprowadzić kawałek grasicy przez otwór rogówki, aby zapobiec spontanicznemu ponownemu uszczelnieniu przed wprowadzeniem tkanki. Na tym etapie należy zachować integralność tkanki. Delikatnie dociśnij powierzchnię oka, aby przesunąć wprowadzony segment tkanki do pozycji bocznej w stosunku do źrenicy, aby zachować funkcję oka.

I użyj płaskich kleszczy, aby mocno docisnąć obie strony otworu rogówki do siebie przez trzy do pięciu sekund, aby ułatwić samouszczelnienie. Jeśli przeszczep ma być wykonany na obu oczach, obróć mysz na przeciwną boczną stronę w celu drugiej implantacji, jak pokazano poniżej. Po zakończeniu operacji umieść mysz z powrotem w pustej klatce wstępnie ogrzanej lampą grzewczą z monitorowaniem aż do pełnego leżenia.

W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym umieść znieczuloną mysz biorcy na platformie mikroskopu o stałym stoliku w bocznej pozycji leżącej na poduszce grzewczej z jednym okiem skierowanym do góry. I włóż głowę myszy do stereotaktycznego uchwytu na głowę. Wyreguluj pokrętło, aby unieruchomić głowę myszy w pozycji bocznej, aby umożliwić bezpośredni dostęp obiektywu mikroskopu do oka trzymającego przeszczep grasicy i odciągnij powieki, trzymając oko na brzegu rogówki za pomocą pary końcówek pęsety pokrytych rurką polietylenową przymocowaną do solidnego przegubu uniwersalnego UST-2.

Dodaj kilka kropli sterylnej soli fizjologicznej lub sztucznych łez między rogówkę a soczewkę przed umieszczeniem obiektywu mikroskopu 5X na oku myszy i zlokalizuj grasicę w polu mikroskopu. Następnie przełącz się na obiektyw zanurzeniowy o wyższej rozdzielczości i dużej odległości roboczej i wybierz tryb akwizycji w oprogramowaniu mikroskopu. Uruchom tryb skanera rezonansowego i wybierz tryb obrazowania XYZT.

Włącz laser argonowy i ustaw moc na 30% w celu wzbudzenia fluorescencji. Wybierz odpowiednią linię lasera wzbudzającego i ustaw sterowanie rozdzielaczem wiązki akustyczno-optycznej dla odpowiednich długości fal emisji, wykorzystując jednocześnie detekcję odbicia w celu wykrycia rozproszenia wstecznego i wyznaczenia struktury tkanki. Zbierz emisję na wybranej długości fali i ustaw rozdzielczość 512 na 512 pikseli.

Następnie kliknij na żywo, aby rozpocząć obrazowanie, dostosowując poziomy wzmocnienia w razie potrzeby. Skoncentruj się na górnej części implantu grasicy i wybierz początek, aby zdefiniować początek stosu Z. Następnie skoncentruj się na ostatniej płaszczyźnie wszczepionej grasicy, którą można zobrazować, i wybierz koniec, aby zdefiniować koniec stosu Z przy użyciu kroku Z o rozmiarze pięciu mikrometrów.

Ustaw interwał czasu akwizycji każdego stosu Z na 1,5 do dwóch sekund i wybierz opcję akwizycji do momentu zatrzymania dla obrazowania ciągłego. Następnie kliknij start, aby zainicjować nagranie. W tym miejscu pokazano obrazy jasnego pola i fluorescencji tego samego obszaru implantu grasicy, które mogą służyć do podwójnej makroskopowej obserwacji wzrostu i inwolucji tkanki oraz badań kontynuacyjnych.

Obraz w jasnym polu ułatwia również wizualizację unaczynienia wszczepionej tkanki, co pozwala na unikalne badanie zależności fizjologii grasicy od ukrwienia w czasie. Model ten umożliwia wizualizację transmigracji komórek z potoku krwi do wszczepionej grasicy, śledzenie kontaktów między komórkami progenitorowymi GFP-dodatnimi wchodzącymi do implantu grasicy z rezydującymi komórkami nabłonka grasicy i zrębu znakowanymi RFP podczas procesów różnicowania i selekcji, a także monitorowanie egresywnych komórek odpornościowych z grasicy do obwodowych naczyń krwionośnych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu ekspozycji tkanki w celu optymalnego wszczepienia, a także o ograniczeniu wielkości nacięcia w oku, aby umożliwić nieuszkodzone wycięcie fragmentu przez rogówkę, jednocześnie zmniejszając zwłóknienie podczas gojenia.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak miejscowe zabiegi kontrolne i nacięcie innych tkanek w przeciwległym oku, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące dysfunkcji immunologicznych związanych z infekcjami, determinantami inwolucji i mechanizmami tolerancji przeszczepu. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania rozwoju komórek T, w tym rekrutacji progenitorów, dynamiki grasicy-oka i etapów egresji dojrzałych komórek T in vivo.