Name: Znakowanie i obrazowanie blaszek amyloidowych w tkance mózgowej przy użyciu naturalnej kurkuminy polifenolowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę znakowania blaszek amyloidowych kurkuminą w tkance mózgowej myszy modelowej choroby Alzheimera. Ta technika oferuje ekonomiczną i efektywną alternatywę dla kosztownych metod opartych na przeciwciałach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie dla tego badania przyszło z Instytutu Neuronauk Terenowych w Ascension of St. Mary's.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (ACUC) Uniwersytetu Stanowego Saginaw Valley. Ludzka tkanka została pozyskana z założonego banku mózgu w Banner Sun Health Institute w Arizonie15,16.
1. Perfuzja zwierząt
<ol>
	<li>Przygotować utrwalające i perfuzyjne.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,1 M bufor fosforanu sodu, dodając 80 g chlorku sodu (NaCl), 2 g chlorku potasu (KCl), 21,7 g wodorofosforanu disodowego (Na2HPO4·7H2O), 2,59 g diwodorofosforanu potasu (KH2PO4) i wody podwójnie destylowanej, aby uzyskać w sumie 1 l.</li>
		<li>Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA).
		<ol>
			<li>Dodać 40 g paraformaldehydu do 1 l PBS (0,1 M, pH 7,4).</li>
			<li>Podgrzej roztwór PFA do temperatury 60−65 °C i wymieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego. 
			UWAGA: Temperatura nie powinna przekraczać 65 °C.</li>
			<li>Dodać kilka kropli NaOH (1 N) za pomocą zakraplacza, aby całkowicie rozpuścić PFA.</li>
			<li>Przefiltrować roztwór PFA za pomocą średniej lub drobnej bibuły filtracyjnej i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
			UWAGA: Roztwór jest dobry przez miesiąc.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj znieczulenie zwierzęce i perfuzję. 
	UWAGA: Dwunastomiesięczne myszy kontrolne B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J (5×FAD) w tym samym wieku (n = 6 na grupę) zostały zakupione od sprzedawców i wyhodowane w domu dla zwierząt Uniwersytetu Stanowego Saginaw Valley. Genotypowanie zostało potwierdzone za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), jak opisano wcześniej7. Ludzka tkanka mózgowa AD obejmuje pośmiertną tkankę mózgową AD i tkankę kontrolną dopasowaną do wieku.
	<ol>
		<li>Znieczulić zwierzę odpowiednim środkiem znieczulającym, takim jak pentobarbital sodu (390 mg/kg masy ciała) lub mieszanina ketaminy/ksylazyny (do 80 mg/kg masy ciała ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (igła 27 g i strzykawka 1 ml). Sprawdź poziom znieczulenia, szczypiąc palec u nogi. Jeśli zwierzę nie reaguje, jest gotowe do operacji perfuzji.</li>
		<li>Umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na tacce do operacji perfuzji i za pomocą małych nożyczek do tęczówki wykonaj nacięcie do tylnego końca lewej komory.</li>
		<li>Włóż igłę perfuzyjną 22 G do lewej komory i wykonaj małe nacięcie w prawej małżowinie usznej, aby usunąć płyn perfuzyjny z organizmu. Użyj grawitacyjnego systemu perfuzyjnego, aby umożliwić przepływ lodowatego płynu perfuzyjnego (0,1 M PBS, pH 7,4) przez 5-6 minut (natężenie przepływu 20-25 ml/min). 
		UWAGA: Czysta wątroba jest wskaźnikiem optymalnej perfuzji.</li>
		<li>Przełącz zawór buforowy na lodowaty 4% roztwór paraformaldehydu w celu utrwalenia i pozwól mu płynąć przez 8−10 min. 
		UWAGA: Drżenie, po którym następują stwardniałe lub sztywne kończyny, są wskaźnikami dobrej fiksacji.</li>
		<li>Usuń mózg z czaszki za pomocą nożyczek. Za pomocą szpatułki zebrać mózg i umieścić go w fiolce z 4% PFA (co najmniej 10 razy większa objętość mózgu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Wytnij sekcje kriostatu.
	<ol>
		<li>Przenieść mózg do stopniowanych roztworów sacharozy (10%, 20% i 30%) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny każdy, aż do użycia.</li>
		<li>Za pomocą kriostatu w temperaturze -22 °C wyciąć odcinki o grubości 40 μm. Zbierz 10-20 skrawków na studzienkę na 6-dołkowej płytce wypełnionej PBS i azydkiem sodu (0,02%).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parafina osadza skrawki dla mysiej i ludzkiej tkanki mózgowej.
	<ol>
		<li>W przypadku skrawków parafinowych należy odwodnić perfundowaną i 24-godzinną tkankę mózgową za pomocą stopniowanych alkoholi (50%, 70%, 90%) przez 2 godziny, a następnie 100% alkoholu 2x po 1 godzinie), a następnie ksylenem 2x po 1 godzinie) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Penetrować tkankę ksylenem parafinowym (1:1) 2x przez 1 godzinę w temperaturze 56 °C w szklanej kolbie stożkowej pokrytej folią aluminiową.</li>
		<li>Zanurz tkankę w stopionej parafinie (56 °C) na 4−6 godzin.</li>
		<li>Wyciąć odcinki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu obrotowego w temperaturze pokojowej i umieścić je w łaźni wodnej tkankowej o temperaturze 45 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Histochemicznie oznaczyć blaszki Aβ w skrawkach kriostatu za pomocą Cur.
	<ol>
		<li>Przepłukać skrawki z kroku 2.1.2 PBS (pH 7,4) 3x przez 5 minut każda.</li>
		<li>Zanurz sekcje w 70% etanolu na 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Rozpuścić materiał Cur (1 mM) w metanolu i rozcieńczyć 70% etanolem do uzyskania końcowego stężenia roboczego 10 μM.</li>
		<li>Zanurz sekcje w roboczym roztworze Cur na 1-5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 150 obr./min.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór Cur i przemyj 70% etanolem 3x przez 2 minuty każdy.</li>
		<li>Umieść sekcje na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną i zamontuj za pomocą szkiełka nakrywkowego za pomocą organicznych mediów montażowych, takich jak plastyfikator distyrenowy ksylen (DPX).</li>
		<li>Widok pod mikroskopem fluorescencyjnym z wykorzystaniem filtrów wzbudzenia/emisji 480/550 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Histochemicznie oznacz blaszki Aβ w zatopionych w parafinie sekcjach mózgu myszy i człowieka za pomocą Cur.
	<ol>
		<li>Odparafinować skrawki tkanek z kroku 2.2.4 ksylenem 2x po 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Hydrate za pomocą stopniowanych roztworów alkoholu (100%, 80%, 70%, 50% przez 1 minutę każdy) i wodą destylowaną 2x po 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Plamić skrawki za pomocą Cur (10 μM) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, wstrząsając z prędkością 150 obr./min. Myć alkoholem 70%, 90% i 100% przez 2 minuty każde.</li>
		<li>Wyczyść ksylenem 2x przez 5 minut każdy i szkiełko nakrywkowe z DPX.</li>
		<li>Wizualizuj pod mikroskopem fluorescencyjnym, jak wspomniano w kroku 2.3.7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolokalizuj Cur z przeciwciałem Aβ w blaszkach Aβ i oligomerach.
	<ol>
		<li>Przemyć skrawki kriostatu z kroku 2.1.2 za pomocą PBS 3x w płytce 12-dołkowej.</li>
		<li>Zablokować skrawki 10% normalną surowicą kozią (NGS) rozpuszczoną w PBS z 0,5% Triton-X-100 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór blokujący. Inkubować skrawki z przeciwciałami specyficznymi dla Aβ (6E10 lub A11, rozcieńczonymi w stosunku 1:200) rozpuszczonymi w świeżym roztworze blokującym zawierającym 10% NGS i 0,5% Triton-X100 przez noc w temperaturze 4 °C w wytrząsarce przy 150 obr./min.</li>
		<li>Wyrzucić roztwór przeciwciała i przemyć skrawki PBS 3x przez 10 minut każda.</li>
		<li>Inkubować z drugorzędowym znacznikiem przeciwciała z czerwonym fluoroforem (np. Alexa 594) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Myć PBS 3x przez 10 min każdy.</li>
		<li>Umyć 70% alkoholem 1x.</li>
		<li>Inkubować skrawki z Cur (10 μM) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Myć 70% alkoholem 3x po 1 min.</li>
		<li>Odwodnić 90% i 100% alkoholem przez 1 minutę każde, oczyścić ksylenem 2x przez 5 minut i zamontować na szkiełkach za pomocą DPX.</li>
		<li>Wizualizacja za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami wzbudzenia/emisji dla sygnałów czerwonego i zielonego.</li>
		<li>W celu wewnątrzkomórkowej kolokalizacji Aβ wybarwić skrawki za pomocą przeciwciała Aβ (6E10), odpocząć z Cur w temperaturze pokojowej w ciemności z wytrząsaniem przy 150 obr./min i wybarwić przeciwstawnie za pomocą Hoechst-33342 (1 mg / ml) i / lub DAPI (1 ug / ml) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z wytrząsaniem przy 150 obr./min. Umyć PBS 3x.</li>
		<li>Rób zdjęcia z filtrami czerwonym, zielonym i niebieskim z obiektywem 100x (całkowite powiększenie 1,000x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz tabliczki Aβ za pomocą Thio-S, CR i FJC. 
	UWAGA: Szczegółowe protokoły oznaczania Thio-S i CR były wcześniej raportowane7.
	<ol>
		<li>W przypadku barwienia metodą FJC należy umyć swobodnie pływające sekcje uzyskane w kroku 2.1.2 za pomocą PBS 3x przez 5 minut każda.</li>
		<li>Umieść skrawki na płytce 12-dołkowej i zabarwij FJC (0,001%) przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór FJC i myj PBS 3x przez 5 minut.</li>
		<li>Inkubować z chlorkiem amonu (NH4Cl, 50 mM rozpuszczony w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Roztwór NH4Cl należy wyrzucić i przemywać roztworem PBS 3x przez 5 minut.</li>
		<li>Postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 2.4, odwodnić stopniowanymi roztworami alkoholu, oczyścić, zamontować i obejrzeć pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu filtrów wzbudzenia/emisji 450/520 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cummings, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).</li>
<li>Jack, C. R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarker+modeling+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Biomarker modeling of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).</li>
<li>Tarawneh, R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+problem+of+symptomatic+Alzheimer+disease+and+mild+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+protein+misfolding%3A+the+examples+of+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).</li>
<li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+curcumin+in+diagnosis%2C+prevention%2C+and+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease.</a> Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).</li>
<li>Maiti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+dietary+curcumin%2C+nanocurcumin%2C+and+other+classical+amyloid-binding+dyes+for+labeling+and+imaging+of+amyloid+plaques+in+brain+tissue+of+5x-familial+Alzheimer%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).</li>
<li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Curcumin%2C+a+Natural+Polyphenol+for+Targeting+Molecular+Pathways+in+Treating+Age-Related+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).</li>
<li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Neuroprotective+Effects+of+Dietary+Curcumin+and+Solid+Lipid+Curcumin+Particles+in+Cultured+Mouse+Neuroblastoma+Cells+after+Exposure+to+Abeta42%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).</li>
<li>den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+curcumin+forms+selectively+bind+fibrillar+amyloid+beta+in+post+mortem+Alzheimer%27s+disease+brains%3A+Implications+for+in-vivo+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75(2018).</li>
<li>Koronyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+amyloid+pathology+and+proof-of-concept+imaging+trial+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease.</a> JCI Insight. 2 (16), (2017).</li>
<li>Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+in+the+retina%3A+imaging+retinal+abeta+plaques+for+early+diagnosis+and+therapy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegenerative+Diseases%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment.</a> Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).</li>
<li>Koronyo-Hamaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+amyloid+plaques+in+retinas+from+Alzheimer%27s+patients+and+noninvasive+in+vivo+optical+imaging+of+retinal+plaques+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model.</a> NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).</li>
<li>Ran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis%2C+and+testing+of+difluoroboron-derivatized+curcumins+as+near-infrared+probes+for+in+vivo+detection+of+amyloid-beta+deposits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).</li>
<li>Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sun+Health+Research+Institute+Brain+Donation+Program%3A+Description+and+Experience%2C+1987-2007%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007.</a> Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).</li>
<li>Green, S. J., Killiany, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subregions+of+the+inferior+parietal+lobule+are+affected+in+the+progression+to+AD%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD.</a> Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).</li>
<li>Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+has+potent+anti-amyloidogenic+effects+for+Alzheimer%27s+beta-amyloid+fibrils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro.</a> Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).</li>
<li>Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+labels+amyloid+pathology+in+vivo%2C+disrupts+existing+plaques%2C+and+partially+restores+distorted+neurites+in+an+Alzheimer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model.</a> Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).</li>
<li>Mutsuga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+curcumin+to+senile+plaques+and+cerebral+amyloid+angiopathy+in+the+aged+brain+of+various+animals+and+to+neurofibrillary+tangles+in+Alzheimer%27s+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).</li>
<li>Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+of+curcumin+to+various+types+of+canine+amyloid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).</li>
<li>Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+amyloid+beta+protein+misfolding+and+fibrillogenesis+by+a+lipid+oxidation+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product.</a> Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).</li>
<li>Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Congo+red+to+amyloid+protofibrils+of+the+Alzheimer+Abeta%289-40%29+peptide+probed+by+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).</li>
<li>Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+binding+modes+of+Congo+red+to+amyloid+protofibril+surface+observed+in+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).</li>
<li>Gutierrez, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Method+to+Detect+Neuronal+Degeneration+and+Amyloid+beta+Accumulation+in+Free-Floating+Brain+Sections+With+Fluoro-Jade%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro+Methods%22%5BJournal%5D)">Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade.</a> ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+formation+of+amyloid+beta+oligomers+and+fibrils%2C+binds+plaques%2C+and+reduces+amyloid+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasza hipoteza była taka, że Cur może być stosowany jako najszybszy, najłatwiejszy i najtańszy sposób oznaczania i obrazowania blaszek Aβ w pośmiertnej tkance mózgowej AD w porównaniu z innymi klasycznymi barwnikami wiążącymi amyloid, a także przeciwciałami specyficznymi dla Aβ. Celem tego badania było określenie minimalnego czasu wymaganego do znakowania i obrazowania blaszek Aβ przez Cura w pośmiertnej tkance mózgowej AD oraz określenie, czy Cur może być stosowany jako alternatywa dla przeciwciała Aβ do znakowania blas...

Choroba Alzheimera (AD) jest jednym z najczęstszych, związanych z wiekiem, postępujących zaburzeń neurologicznych i jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie1,2. Zaburzenia uczenia się, pamięci i funkcji poznawczych, wraz z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, są częstymi objawami objawiającymi się w AD3. Chociaż etiologia choroby Alzheimera nie została w pełni wyjaśniona, dostępne dowody genetyczne, biochemiczne i eksperymentalne wskazują, że stopniowe odkładanie się Aβ jest ostatecznym biomarkerem dla AD4. To nieprawidłowo sfałdowane białko gromadzi się w przestrzeniach wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych i uważa się, że jest zaangażowane w utratę synapty, zwiększone zapalenie nerwów i neurodegenerację w regionach korowych i hipokampa w mózgu dotkniętym AD5. Dlatego histochemiczne wykrywanie Aβ w tkance AD jest kluczowym pierwszym krokiem w opracowywaniu nietoksycznych leków antyamyloidowych zapobiegających progresji AD.
W ciągu ostatnich kilku dekad, wiele laboratoriów badawczych używało wielu barwników i przeciwciał do oznaczania i obrazowania blaszek Aβ w tkance mózgowej, ale niektóre z tych metod są czasochłonne, a stosowane barwniki lub przeciwciała są drogie, wymagają kilku dodatkowych substancji chemicznych. W związku z tym opracowanie niedrogiego sposobu wykrywania blaszek Aβ w mózgu osoby z chorobą Alzheimera byłoby mile widzianym nowym narzędziem. Wiele laboratoriów zaczęło używać Cur, obiecującego naturalnego polifenolu przeciw amyloidowi, do znakowania i obrazowania Aβ, a także jako środka terapeutycznego dla AD6,7,8,9. Jego hydrofobowość i lipofilowy charakter, strukturalne podobieństwa do klasycznych barwników wiążących amyloid, silna aktywność fluorescencyjna, a także silne powinowactwo do wiązania z Aβ sprawiają, że jest idealnym fluoroforem do znakowania i obrazowania blaszek Aβ w AD tissue10. Cur wiąże się z płytkami Aβ i oligomerami, a jego obecność wykrywa się również w przestrzeniach wewnątrzkomórkowych7,11,12,13. Ponadto wykazano, że minimalne ilości (1−10 nM) Cur mogą oznaczać blaszki Aβ w tkance mózgowej 5x rodzinnej choroby Alzheimera (5xFAD)7. Chociaż stężenie 1 nM nie zapewnia optymalnej intensywności fluorescencji do zliczania blaszek Aβ, stężenie Cur 10 nM lub więcej tak. Ran i współpracownicy14 stwierdzili, że dawki tak niskie jak 0,2 nM derywatyzowanego difluoroboronu Cur mogą wykryć in vivo osady Aβ prawie tak dobrze, jak sonda podczerwieni. Nadal nie jest jasne, czy dawka ta jest wystarczająca do znakowania blaszek Aβ w tkance. W większości poprzednich badań stosowano 20-30 minut do barwienia blaszek Aβ za pomocą Cur, ale optymalne barwienie może wymagać znacznie mniej czasu.
Obecne badanie miało na celu przetestowanie minimalnego czasu wymaganego przez Cur do znakowania blaszek Aβ w tkance mózgowej AD oraz porównanie czułości znakowania i obrazowania blaszek Aβ w tkance mózgowej myszy 5xFAD po barwieniu Cur innymi konwencjonalnymi barwnikami wiążącymi Aβ, takimi jak Tioflawina-S (Thio-S), Czerwień kongijska (CR) i fluoro-jadeit C (FJC). Zdolność znakowania Aβ tych klasycznych barwników wiążących amyloid porównano z barwieniem Cur w zatopionych w parafinie i kriostatowych koronalnych sekcjach mózgu od myszy 5xFAD oraz od dopasowanej do wieku ludzkiej tkanki mózgowej z AD i kontrolnej. Wyniki sugerują, że Cur znakuje blaszki Aβ w sposób podobny do przeciwciał specyficznych dla Aβ (6E10) i umiarkowanie lepiej niż Thio-S, CR lub FJC. Ponadto, gdy podawano dootrzewnowe wstrzyknięcia Cur myszom 5xFAD przez 2-5 dni, przenikał on przez barierę krew-mózg i wiązał się z blaszkami Aβ7. Co ciekawe, nanomolowe stężenia Cur zostały wykorzystane do oznaczania i obrazowania blaszek Aβ w tkance mózgowej 5xFAD7,14. Co więcej, morfologicznie odrębne blaszki Aβ, takie jak blaszki rdzeniowe, neurytyczne, rozproszone i wypalone, mogą być znakowane przez Cur skuteczniej niż za pomocą któregokolwiek z innych konwencjonalnych barwników wiążących amyloid7. Ogólnie rzecz biorąc, Cur można w łatwy i niedrogi sposób zastosować do znakowania i obrazowania blaszek Aβ w pośmiertnej tkance mózgowej z modeli zwierzęcych AD i/lub ludzkich tkanek AD jako niezawodna alternatywa dla przeciwciał specyficznych dla Aβ.

<table><tbody><tr><td>4&,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>IHC world, Woodstock, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zwierzęcy model choroby Alzheimera</td><td>Laboratorium Jacksona, Bar Harbor, ME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol bezwzględny</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Santacruz Biotech, Dallas, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 6E10</td><td>Biolegend, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało A11</td><td>Millipore, Burlington, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złożony mikroskop świetlny</td><td>Olympus, Shinjuku, Japonia</td><td>Olympus BX51</td><td></td></tr><tr><td>Kongo czerwona</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>GMI, Ramsey, MN</td><td>LeicaCM1800</td><td></td></tr><tr><td>Kurkumina</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodór disodowy </td><td>fosforan Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastyfikator dystyrenowy ksylen</td><td>BDH, Dawsonville, GA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibuły filtracyjne</td><td>Fisher scientific, Pittsburgh, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica, Buffalo Grove, IL</td><td>Leica DMI 6000B</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócona świetlówka mikroskop</td><td>Olympus, Shinjuku, Japonia</td><td>Olympus 1x70</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szklane pokryte lizyną Globe</td><td>Scientific Inc, Mahwah, NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>potasuSigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>EMD Millipore, Burlington, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tioflawina-S</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie i obrazowanie blaszek amyloidowych w tkance mózgowej przy użyciu naturalnej kurkuminy polifenolowej

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Odkładanie się białka beta amyloidu (Aβ) w przestrzeniach poza- i wewnątrzkomórkowych jest jedną z charakterystycznych patologii choroby Alzheimera (AD). Dlatego wykrycie obecności Aβ w tkance mózgowej choroby Alzheimera jest cennym narzędziem do opracowywania nowych metod leczenia w celu zapobiegania postępowi choroby Alzheimera. Kilka klasycznych barwników wiążących amyloid, fluorochrom, sondy obrazowe i przeciwciała specyficzne dla Aβ zostały użyte do histochemicznego wykrycia Aβ w tkance mózgowej AD. Stosowanie tych związków do wykrywania Aβ jest kosztowne i czasochłonne. Jednak ze względu na intensywną aktywność fluorescencyjną, wysokie powinowactwo i specyficzność dla Aβ, a także podobieństwa strukturalne z tradycyjnymi barwnikami wiążącymi amyloid, kurkumina (Cur) jest obiecującym kandydatem do znakowania i obrazowania blaszek Aβ w pośmiertnej tkance mózgowej. Jest to naturalny polifenol z ziela Curcuma longa. W niniejszym badaniu Cur został użyty do histochemicznego znakowania blaszek Aβ zarówno z genetycznego mysiego modelu 5x rodzinnej choroby Alzheimera (5xFAD), jak i z ludzkiej tkanki AD w ciągu minuty. Zdolność znakowania Cur porównano z konwencjonalnymi barwnikami wiążącymi amyloid, takimi jak tioflawina-S (Thio-S), czerwień kongijska (CR) i fluoro-jadeit C (FJC), a także przeciwciała specyficzne dla Aβ (6E10 i A11). Zaobserwowaliśmy, że Cur jest najtańszym i najszybszym sposobem znakowania i obrazowania blaszek Aβ w porównaniu z tymi konwencjonalnymi barwnikami i jest porównywalny z przeciwciałami specyficznymi dla Aβ. Ponadto Cur wiąże się z większością gatunków Aβ, takich jak oligomery i fibryle. Dlatego Cur może być stosowany jako najbardziej opłacalny, prosty i szybki środek do wykrywania fluorochromu dla blaszek Aβ.

Kurkumina znakuje blaszki Aβ w ciągu minuty. Po zabarwieniu tkanki 5xFAD kurkuminą stwierdzono, że kurkumina znakuje blaszki Aβ w ciągu 1 min. Chociaż wydłużenie czasu inkubacji z kurkuminą nieznacznie zwiększyło intensywność fluorescencji blaszek Aβ, liczba zaobserwowanych blaszek Aβ nie różniła się znacząco między czasem barwienia wynoszącym 1 min a 5 min (Rycina 1).
Cur może znakować blaszki Aβ w...

Kurkumina jest idealnym fluoroforem do znakowania i obrazowania blaszek białkowych beta amyloidu w tkance mózgowej ze względu na jej preferencyjne wiązanie z białkiem beta amyloidu, a także strukturalne podobieństwa do innych tradycyjnych barwników wiążących amyloid. Może być stosowany do znakowania i obrazowania blaszek białkowych beta amyloidu skuteczniej i taniej niż tradycyjne metody.

Znakowanie i obrazowanie blaszek amyloidowych w tkance mózgowej przy użyciu naturalnej kurkuminy polifenolowej

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Protokół ten jest najbardziej wydajną i opłacalną metodą dokładnego znakowania blaszek beta-amyloidowych w porównaniu z przeciwciałami specyficznymi dla amyloidu, które są obecnie złotym standardem znakowania tych blaszek. Technika ta zajmuje mniej czasu i jest tak samo skuteczna jak każda z powszechnie stosowanych metod znakowania amyloidu. Kurkumina silnie wiąże się z blaszkami amyloidowymi i może być stosowana jako sonda obrazowa podczas skanów PET mózgu oraz do stosunkowo nieinwazyjnych badań przesiewowych z wykorzystaniem skanowania siatkówki.Kurkumina wiąże się również z splątaniem neurofibrylarnym lub tau w chorobie Alzheimera, alfa synukleiną w chorobie Parkinsona i zmutowanymi białkami Huntingtona w chorobie Huntingtona. Procedurę z Panchananem Maiti zademonstrują Zackary Bowers, doktorant, i Alexandra Plemmons, naukowiec z mojego laboratorium. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na odruch bólowy u znieczulonej 12-miesięcznej myszy modelowej z chorobą Alzheimera, umieść mysz w pozycji leżącej na tacy operacyjnej i wykonaj nacięcie w jamie brzusznej i przez przeponę.Włóż igłę perfuzyjną o rozmiarze 21 do nacięcia i wykonaj małe nacięcie w prawej małżowinie usznej, aby płyn perfuzyjny mógł spłynąć z ciała. Użyj grawitacyjnego systemu perfuzyjnego, aby umożliwić przepływ lodowatego płynu PBS o masie 0,1 mola do igły przez pięć do sześciu minut z szybkością przepływu od 20 do 25 mililitrów na minutę. Jeśli perfuzja zostanie wykonana prawidłowo, zaobserwuje się czystą wątrobę.Właściwa perfuzja zwierząt jest niezbędna, ponieważ jeśli krew nie zostanie całkowicie usunięta, kurkumina może związać się z naczyniami krwionośnymi i spowodować zielony fluorescencyjny sygnał tła. Po dostarczeniu całego PBS przełącz zawór buforowy na lodowaty 4% roztwór paraformaldehydu na osiem do 10 minut przed użyciem nożyczek i kleszczy, aby uwolnić mózg od czaszki. Następnie za pomocą szpatułki umieść mózg w fiolce z 4% paraformaldehydem co najmniej 10 razy większą niż objętość tkanki, aby przechowywać w czterech stopniach Celsjusza do czasu przetworzenia.Aby uzyskać skrawki do cięcia kriostatu, należy kolejno zanurzyć mózg w stopniowanych roztworach sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 godziny na stężenie przed użyciem kriostatu w temperaturze ujemnej 22 stopni Celsjusza w celu uzyskania skrawków 40 mikrometrów, umieszczając od 10 do 20 skrawków na studzience w sześciodołkowej płytce zawierającej PBS uzupełniony 0,02% azydkiem w miarę ich otrzymywania. Po pobraniu wszystkich próbek należy przechowywać skrawki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki. Aby uzyskać skrawki do cięcia parafiny, należy odwodnić perfundowaną tkankę mózgową po utrwaleniu sekwencyjnymi stopniowanymi roztworami alkoholu przez dwie godziny na stężenie, a następnie dwa godzinne zanurzenia w 100% alkoholu i dwa jednogodzinne zanurzenia w ksylenie w temperaturze pokojowej.Po ostatnim zanurzeniu ksylenu należy przeniknąć do tkanki roztworem ksylenu do parafiny jeden do jednego dwa razy przez jedną godzinę na inkubację w temperaturze 56 stopni Celsjusza w szklanym stożkowym szkle pokrytym folią aluminiową, a następnie zanurzyć tkanki w parafinie o temperaturze 56 stopni Celsjusza na cztery do sześciu godzin. Pod koniec inkubacji użyj mikrotomu obrotowego w temperaturze pokojowej, aby uzyskać skrawki o grubości pięciu mikrometrów, umieszczając skrawki w łaźni tkankowej o temperaturze 45 stopni Celsjusza w trakcie ich zbierania. W celu znakowania kurkuminą blaszek beta amyloidu w skrawkach tkanek kriostatu, należy przepłukać skrawki PBS trzy razy przez pięć minut na mycie, a następnie zanurzyć skrawki w 70% etanolu na dwie minuty w temperaturze pokojowej.Podczas inkubacji skrawków rozpuść jeden milimol kurkuminy w metanolu i rozcieńcz roztwór do końcowego stężenia roboczego 10 mikromolów z 70% etanolem. Pod koniec inkubacji zanurzyć skrawki w roboczym roztworze kurkuminy na 10 minut w temperaturze pokojowej przy 50 obrotach na minutę. Pod koniec okresu barwienia wyrzuć roztwór kurkuminy i umyj skrawki trzema dwuminutowymi płukaniami w 70% etanolu.Po ostatnim umyciu przenieś sekcje na szkiełka podstawowe pokryte polilizyną i zamontuj szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku z odpowiednim organicznym medium montażowym. Następnie obejrzyj skrawki pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą obiektywu 10 lub 20x oraz odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji. W celu znakowania histochemicznego głęboko zaparafinowanych skrawków tkanki, zanurz skrawki o grubości pięciu mikrometrów w ksylenie dwa razy na pięć minut w temperaturze pokojowej na zanurzenie, a następnie ponownie uwodnij się stopniowanym jednominutowym zanurzeniem w roztworze alkoholu.Pod koniec inkubacji przemyć skrawki stopniowanymi roztworami alkoholu przez dwie minuty na każde stężenie, a następnie oczyścić za pomocą dwóch pięciominutowych zanurzeń w ksylenie. Po drugim zanurzeniu w ksylenie zamontuj każdą sekcję na szkiełku mikroskopowym za pomocą szkiełka nakrywkowego i odpowiedniego podłoża montażowego do obrazowania mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano. W celu znakowania próbek z wycinków kriostatu przeciwciałami anty-A-beta, należy przemyć próbki trzykrotnie świeżym PBS na przemycie w indywidualnych dołkach 12-dołkowej płytki przed zablokowaniem niespecyficznego wiązania z 10% normalną surowicą kozią w PBS i 0,5% trytonem x-100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji odrzucić roztwór blokujący i inkubować próbki z przeciwciałem specyficznym dla a-beta przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 150 obrotów na minutę. Następnego ranka przemyć skrawki trzema 10-minutowymi płukaniami w świeżym PBS na pranie, a następnie inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z czerwonym fluoroforem przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki trzykrotnie PBS, a następnie raz przemyć 70% alkoholem.Po przemyciu alkoholem inkubować skrawki z 10 mikromolową kurkuminą przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy jednominutowe płukanie 70% alkoholem. Po ostatnim myciu odwodnić sekcje 90% i 100% alkoholem przez jedną minutę na stężenie i czyścić sekcje dwa razy przez pięć minut na zanurzenie świeżym ksylenem na inkubację. Następnie zamontuj i zobrazuj sekcje, jak pokazano.W celu wewnątrzkomórkowej kolokalizacji beta-amyloidu należy wybarwić skrawki przeciwciałem anty amyloidowym beta, a następnie wybarwić kurkuminą w temperaturze pokojowej i 50 obrotów na minutę, chroniąc przed światłem, jak pokazano. Pod koniec inkubacji należy przeciwbarwić odpowiednim barwnikiem jądrowym przez 10 minut w temperaturze pokojowej i 50 obrotów na minutę, chroniąc przed światłem, a następnie trzykrotnie przemyć w PBS. Następnie zamontuj i zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano.Chociaż wydłużenie czasu inkubacji kurkuminą nieznacznie zwiększa intensywność fluorescencji blaszek A beta, liczba obserwowanych blaszek nie różni się znacząco między jedną a pięciominutowym czasem barwienia. Kurkumina może być stosowana do barwienia blaszek beta A i kriosekcji, próbek tkanek zatopionych w parafinie i ludzkich tkankach choroby Alzheimera. Znakowanie przeciwciałem specyficznym dla A beta przed barwieniem kurkuminą ujawnia, że kurkumina jest całkowicie kolokalizowana z A beta na tych samych płytkach, które wiążą przeciwciało.Po barwieniu kurkuminą oznaczonymi oligomerami beta A, kolokalizację kurkuminy z oligomerami można zaobserwować w blaszkach beta A. Podobnie, kurkumina również kolokalizuje się z przeciwciałem specyficznym dla A beta w przestrzeniach wewnątrzkomórkowych, potwierdzając, że plama może oznaczać wewnątrzkomórkową A beta. Znakowanie kurkuminy jest również bardziej widoczne niż konwencjonalne barwniki wiążące amyloid.Pochodne kurkuminy znajdujące się w ekstraktach z kurkumy oznaczają blaszki beta A w porównaniu do kurkuminy w tkance mózgowej człowieka z chorobą Alzheimera, niezależnie od rodzaju użytego podłoża montażowego. Ponadto sygnały immunofluorescencji kurkuminy i intensywność przeciwbarwienia są utrzymywane nawet po barwieniu typowymi barwnikami jądrowymi i innymi markerami komórkowymi. Spotkaliśmy się, że stałe przekroje powinny być cieńsze niż 40 mikronów.Ta procedura treningowa powinna trwać krócej niż 30 minut, a optymalne stężenie kurkuminy to jeden do dwóch mikromolowców. Podwójnie poziomujące biomarkery opóźnionych w rozwoju mogą być wykonywane na tej samej tkance i mogą zapewnić większą szczegółowość tego, które typy komórek mózgowych są poziomowane. Biorąc pod uwagę, że kurkumina może zmniejszać obciążenie blaszką amyloidową, dokładne mechanizmy zachodzące tego procesu są obecnie badane zarówno na poziomie komórkowym, jak i molekularnym.

labeling-imaging-amyloid-plaques-brain-tissue-using-natural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jedną z patologicznych cech AD jest tworzenie się blaszek neurytowych wykazujących obecność białka amyloid β. W niniejszym protokole opisujemy dwie metody wykrywania blaszek neurytowych u myszy w transgenicznym modelu AD: detekcję immunohistochemiczną z wykorzystaniem metody ABC i DAB oraz detekcję fluorescencyjną z zastosowaniem barwienia tioflawiną S.

Wykrywanie blaszek neurytycznych w modelu mysim choroby Alzheimera

MCCH charakteryzuje się zmniejszonym przepływem krwi do mózgu. Ogranicza to dopływ tlenu i składników odżywczych do warstwy komórek śródbłonka naczyń krwionośnych mózgu, uszkadzając komórki.

Barwienie tioflawiny-S agregacji amyloidu beta w mózgowej tkance mózgowej myszy z hipoperfuzją

Film demonstruje procedurę przygotowania ludzkich wycinków mózgu od pacjentów z chorobą Alzheimera do analizy depozycji peptydów beta-amyloidu (Aβ) za pomocą spektrometrii mas wspomaganej matrycą desorpcji/jonizacji laserowej (MALDI-IMS). Kroki obejmują przygotowanie szkiełek, leczenie tkanki w celu zwiększenia jonizacji oraz analizę przestrzennego rozkładu peptydów beta amyloidu.

Wizualizacja peptydów beta-amyloidu w wycinkach ludzkiej kory mózgowej

Źródło: Maiti, P. et. al.,. Znakowanie i obrazowanie blaszek amyloidowych w tkance mózgowej przy użyciu naturalnej kurkuminy polifenolowej. J. Vis. exp. (2019)Ten film przedstawia procedurę obrazowania blaszek beta-amyloidowych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą znakowania immunologicznego i barwienia kurkuminą. Znakowanie immunologiczne zapewnia swoistość dla beta-amyloidu, podczas gdy kurkumina selektywnie wiąże włókienka bogate w β arkusze, poprawiając wizualizację. Kolokalizacja...

Obrazowanie blaszek beta-amyloidowych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą znakowania immunologicznego i barwienia kurkuminą

Źródło: Bisht, K., et. al. Korelacyjne światło i mikroskopia elektronowa w celu zbadania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi. J. vis. exp. (2016) Ten film przedstawia wizualizację i mapowanie płytek amyloidowych znakowanych metoksy-X04 w mózgu myszy z chorobą Alzheimera sekcje wykorzystujące mikroskopię fluorescencyjną i jasne pole, umożliwiające precyzyjną korelację blaszek ze strukturami anatomicznymi w celu badania patologii choroby Alzheimera.

Wizualizacja i mapowanie blaszek amyloidowych znakowanych metoksy-X04 w sekcji mózgu myszy z chorobą Alzheimera

Ten artykuł opisuje protokół wizualizacji blaszek amyloidowych Aβ w mysich modelach choroby Alzheimera za pomocą metoksy-X04, który przenika przez barierę krew-mózg i selektywnie wiąże się z β-plisowanymi arkuszami znajdującymi się w gęstych blaszkach rdzeniowych Aβ. Umożliwia wstępne badanie przesiewowe skrawków tkanek zawierających płytkę przed barwieniem immunologicznym i przetwarzaniem do mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.

Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Poznaj metodę znakowania blaszek amyloidowych kurkuminą w tkance mózgowej myszy modelowej choroby Alzheimera. Ta technika oferuje ekonomiczną i efektywną alternatywę dla kosztownych metod opartych na przeciwciałach.

Znakowanie i obrazowanie blaszek amyloidowych w tkance mózgowej przy użyciu naturalnej kurkuminy polifenolowej

Przeglądaj więcej filmów