Znakowanie i obrazowanie blaszek amyloidowych w tkance mózgowej przy użyciu naturalnej kurkuminy polifenolowej

Protokół ten jest najbardziej wydajną i opłacalną metodą dokładnego znakowania blaszek beta-amyloidowych w porównaniu z przeciwciałami specyficznymi dla amyloidu, które są obecnie złotym standardem znakowania tych blaszek. Technika ta zajmuje mniej czasu i jest tak samo skuteczna jak każda z powszechnie stosowanych metod znakowania amyloidu. Kurkumina silnie wiąże się z blaszkami amyloidowymi i może być stosowana jako sonda obrazowa podczas skanów PET mózgu oraz do stosunkowo nieinwazyjnych badań przesiewowych z wykorzystaniem skanowania siatkówki.

Kurkumina wiąże się również z splątaniem neurofibrylarnym lub tau w chorobie Alzheimera, alfa synukleiną w chorobie Parkinsona i zmutowanymi białkami Huntingtona w chorobie Huntingtona. Procedurę z Panchananem Maiti zademonstrują Zackary Bowers, doktorant, i Alexandra Plemmons, naukowiec z mojego laboratorium. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na odruch bólowy u znieczulonej 12-miesięcznej myszy modelowej z chorobą Alzheimera, umieść mysz w pozycji leżącej na tacy operacyjnej i wykonaj nacięcie w jamie brzusznej i przez przeponę.

Włóż igłę perfuzyjną o rozmiarze 21 do nacięcia i wykonaj małe nacięcie w prawej małżowinie usznej, aby płyn perfuzyjny mógł spłynąć z ciała. Użyj grawitacyjnego systemu perfuzyjnego, aby umożliwić przepływ lodowatego płynu PBS o masie 0,1 mola do igły przez pięć do sześciu minut z szybkością przepływu od 20 do 25 mililitrów na minutę. Jeśli perfuzja zostanie wykonana prawidłowo, zaobserwuje się czystą wątrobę.

Właściwa perfuzja zwierząt jest niezbędna, ponieważ jeśli krew nie zostanie całkowicie usunięta, kurkumina może związać się z naczyniami krwionośnymi i spowodować zielony fluorescencyjny sygnał tła. Po dostarczeniu całego PBS przełącz zawór buforowy na lodowaty 4% roztwór paraformaldehydu na osiem do 10 minut przed użyciem nożyczek i kleszczy, aby uwolnić mózg od czaszki. Następnie za pomocą szpatułki umieść mózg w fiolce z 4% paraformaldehydem co najmniej 10 razy większą niż objętość tkanki, aby przechowywać w czterech stopniach Celsjusza do czasu przetworzenia.

Aby uzyskać skrawki do cięcia kriostatu, należy kolejno zanurzyć mózg w stopniowanych roztworach sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 godziny na stężenie przed użyciem kriostatu w temperaturze ujemnej 22 stopni Celsjusza w celu uzyskania skrawków 40 mikrometrów, umieszczając od 10 do 20 skrawków na studzience w sześciodołkowej płytce zawierającej PBS uzupełniony 0,02% azydkiem w miarę ich otrzymywania. Po pobraniu wszystkich próbek należy przechowywać skrawki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki. Aby uzyskać skrawki do cięcia parafiny, należy odwodnić perfundowaną tkankę mózgową po utrwaleniu sekwencyjnymi stopniowanymi roztworami alkoholu przez dwie godziny na stężenie, a następnie dwa godzinne zanurzenia w 100% alkoholu i dwa jednogodzinne zanurzenia w ksylenie w temperaturze pokojowej.

Po ostatnim zanurzeniu ksylenu należy przeniknąć do tkanki roztworem ksylenu do parafiny jeden do jednego dwa razy przez jedną godzinę na inkubację w temperaturze 56 stopni Celsjusza w szklanym stożkowym szkle pokrytym folią aluminiową, a następnie zanurzyć tkanki w parafinie o temperaturze 56 stopni Celsjusza na cztery do sześciu godzin. Pod koniec inkubacji użyj mikrotomu obrotowego w temperaturze pokojowej, aby uzyskać skrawki o grubości pięciu mikrometrów, umieszczając skrawki w łaźni tkankowej o temperaturze 45 stopni Celsjusza w trakcie ich zbierania. W celu znakowania kurkuminą blaszek beta amyloidu w skrawkach tkanek kriostatu, należy przepłukać skrawki PBS trzy razy przez pięć minut na mycie, a następnie zanurzyć skrawki w 70% etanolu na dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Podczas inkubacji skrawków rozpuść jeden milimol kurkuminy w metanolu i rozcieńcz roztwór do końcowego stężenia roboczego 10 mikromolów z 70% etanolem. Pod koniec inkubacji zanurzyć skrawki w roboczym roztworze kurkuminy na 10 minut w temperaturze pokojowej przy 50 obrotach na minutę. Pod koniec okresu barwienia wyrzuć roztwór kurkuminy i umyj skrawki trzema dwuminutowymi płukaniami w 70% etanolu.

Po ostatnim umyciu przenieś sekcje na szkiełka podstawowe pokryte polilizyną i zamontuj szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku z odpowiednim organicznym medium montażowym. Następnie obejrzyj skrawki pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą obiektywu 10 lub 20x oraz odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji. W celu znakowania histochemicznego głęboko zaparafinowanych skrawków tkanki, zanurz skrawki o grubości pięciu mikrometrów w ksylenie dwa razy na pięć minut w temperaturze pokojowej na zanurzenie, a następnie ponownie uwodnij się stopniowanym jednominutowym zanurzeniem w roztworze alkoholu.

Pod koniec inkubacji przemyć skrawki stopniowanymi roztworami alkoholu przez dwie minuty na każde stężenie, a następnie oczyścić za pomocą dwóch pięciominutowych zanurzeń w ksylenie. Po drugim zanurzeniu w ksylenie zamontuj każdą sekcję na szkiełku mikroskopowym za pomocą szkiełka nakrywkowego i odpowiedniego podłoża montażowego do obrazowania mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano. W celu znakowania próbek z wycinków kriostatu przeciwciałami anty-A-beta, należy przemyć próbki trzykrotnie świeżym PBS na przemycie w indywidualnych dołkach 12-dołkowej płytki przed zablokowaniem niespecyficznego wiązania z 10% normalną surowicą kozią w PBS i 0,5% trytonem x-100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji odrzucić roztwór blokujący i inkubować próbki z przeciwciałem specyficznym dla a-beta przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 150 obrotów na minutę. Następnego ranka przemyć skrawki trzema 10-minutowymi płukaniami w świeżym PBS na pranie, a następnie inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z czerwonym fluoroforem przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki trzykrotnie PBS, a następnie raz przemyć 70% alkoholem.

Po przemyciu alkoholem inkubować skrawki z 10 mikromolową kurkuminą przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy jednominutowe płukanie 70% alkoholem. Po ostatnim myciu odwodnić sekcje 90% i 100% alkoholem przez jedną minutę na stężenie i czyścić sekcje dwa razy przez pięć minut na zanurzenie świeżym ksylenem na inkubację. Następnie zamontuj i zobrazuj sekcje, jak pokazano.

W celu wewnątrzkomórkowej kolokalizacji beta-amyloidu należy wybarwić skrawki przeciwciałem anty amyloidowym beta, a następnie wybarwić kurkuminą w temperaturze pokojowej i 50 obrotów na minutę, chroniąc przed światłem, jak pokazano. Pod koniec inkubacji należy przeciwbarwić odpowiednim barwnikiem jądrowym przez 10 minut w temperaturze pokojowej i 50 obrotów na minutę, chroniąc przed światłem, a następnie trzykrotnie przemyć w PBS. Następnie zamontuj i zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano.

Chociaż wydłużenie czasu inkubacji kurkuminą nieznacznie zwiększa intensywność fluorescencji blaszek A beta, liczba obserwowanych blaszek nie różni się znacząco między jedną a pięciominutowym czasem barwienia. Kurkumina może być stosowana do barwienia blaszek beta A i kriosekcji, próbek tkanek zatopionych w parafinie i ludzkich tkankach choroby Alzheimera. Znakowanie przeciwciałem specyficznym dla A beta przed barwieniem kurkuminą ujawnia, że kurkumina jest całkowicie kolokalizowana z A beta na tych samych płytkach, które wiążą przeciwciało.

Po barwieniu kurkuminą oznaczonymi oligomerami beta A, kolokalizację kurkuminy z oligomerami można zaobserwować w blaszkach beta A. Podobnie, kurkumina również kolokalizuje się z przeciwciałem specyficznym dla A beta w przestrzeniach wewnątrzkomórkowych, potwierdzając, że plama może oznaczać wewnątrzkomórkową A beta. Znakowanie kurkuminy jest również bardziej widoczne niż konwencjonalne barwniki wiążące amyloid.

Pochodne kurkuminy znajdujące się w ekstraktach z kurkumy oznaczają blaszki beta A w porównaniu do kurkuminy w tkance mózgowej człowieka z chorobą Alzheimera, niezależnie od rodzaju użytego podłoża montażowego. Ponadto sygnały immunofluorescencji kurkuminy i intensywność przeciwbarwienia są utrzymywane nawet po barwieniu typowymi barwnikami jądrowymi i innymi markerami komórkowymi. Spotkaliśmy się, że stałe przekroje powinny być cieńsze niż 40 mikronów.

Ta procedura treningowa powinna trwać krócej niż 30 minut, a optymalne stężenie kurkuminy to jeden do dwóch mikromolowców. Podwójnie poziomujące biomarkery opóźnionych w rozwoju mogą być wykonywane na tej samej tkance i mogą zapewnić większą szczegółowość tego, które typy komórek mózgowych są poziomowane. Biorąc pod uwagę, że kurkumina może zmniejszać obciążenie blaszką amyloidową, dokładne mechanizmy zachodzące tego procesu są obecnie badane zarówno na poziomie komórkowym, jak i molekularnym.