IR-TEx: Narzędzie do integracji danych typu open source do transkryptomiki dużych zbiorów danych, przeznaczone dla wektora malarii Anopheles gambiae

Protokół ten jest istotny, ponieważ po raz pierwszy dane transkryptomiczne dotyczące komarów Anopheles Gambiae zostały udostępnione swobodnie i łatwo w jednym miejscu. Technika ta umożliwia wszystkim badaczom, nawet tym, którzy nie mają doświadczenia w bioinformatyce, na swobodny i łatwy dostęp do danych dotyczących ekspresji ich ulubionych genów i komarów odpornych na insektycydy. Aby rozpocząć, skorzystaj z linku znajdującego się na dole strony projektu LSTM IR-TEx, aby uruchomić aplikację internetową IR-Tex w przeglądarce internetowej.

Po zainicjowaniu strony internetowej kliknij przycisk Aplikacja u góry strony, który wyświetli aplikację i powiązane dane wyjściowe. Odczytaj każde dane wyjściowe związane z domyślnym wpisem w polu identyfikatora transkrypcji. Wybierz warunki i zestawy danych Anopheles Colozzii, które są narażone na działanie insektycydów pyretroidowych lub nie są narażone na żadną klasę insektycydów i powiązane transkrypty o współczynniku korelacji większym niż 0,98.

Aby zapoznać się z wyrażeniem interesującej Cię transkrypcji, najpierw wybierz transkrypcję. Następnie wprowadź identyfikator transkrypcji w polu identyfikatora transkrypcji, pamiętając, że transkrypcje kończą się na RX w zależności od interesującej cię izoformy. Wybierz zestawy danych do przeszukania, biorąc odpowiednie pola dla krajów, w tym status narażenia, gatunki będące przedmiotem zainteresowania i klasę insektycydów.

Upewnij się, że te kryteria dają więcej niż jeden dołączony zestaw danych. Kliknij przycisk Aktualizuj widok u dołu menu wyboru lub naciśnij Return, ignorując na razie bezwzględną wartość korelacji. Daj aplikacji czas na zaktualizowanie.

Niezależnie od tego, czy pierwszy wykres zawiera zmianę krotności Log2 między populacją oporną a populacją komarów podatnych na laboratorium interesującego nas transkryptu, w każdym zestawie danych, który spełnia wybrane kryteria. Przeczytaj informacje pod wykresem w miarę zmian fałdowania między odpornymi i podatnymi komarami dla każdego odpowiedniego zestawu danych, oprócz powiązanych skorygowanych wartości P. Każdy wiersz reprezentuje poszczególne sondy w mikromacierzy.

Zapoznaj się z poniższą dodatkową tabelą, w której podajemy liczbę eksperymentów, w których transkrypcja zainteresowania jest znacząca, a także łączną liczbę eksperymentów spełniających wybrane kryteria. Aby pobrać dane w formacie rozdzielonym tabulatorami, kliknij przycisk Pobierz pod dwiema tabelami. Dzięki temu użytkownik może w łatwiejszy sposób eksplorować dane za pomocą programu takiego jak Excel.

Każdy punkt na mapie reprezentuje przybliżone miejsca gromadzenia odpornych komarów w każdym zbiorze danych, w którym transkrypcja zainteresowania jest wyrażona w różny sposób. Kolory są zgodne z systemem sygnalizacji świetlnej, który jest wyjaśniony w aplikacji. Zapisz wyniki graficzne, klikając prawym przyciskiem myszy, klikając Zapisz obraz jako i wybierając odpowiedni folder.

W przypadku błędu wyjściowego aplikacji jest prawdopodobne, że żadne zestawy danych nie spełniają wprowadzonych kryteriów. Korelacje wzorców ekspresji transkryptów w wielu zestawach danych można wykorzystać do przewidywania funkcji transkryptu i potencjalnie wyjaśnienia współregulowanych transkryptów z tego samego szlaku. Przed kliknięciem przycisku Aktualizuj widok przesuń suwak wartości korelacji bezwzględnej do wartości 0,85 i kliknij przycisk Aktualizuj widok lub naciśnij Return.

Zapoznaj się z tabelą korelacji, aby znaleźć wiele transkrypcji, które są teraz wyświetlane i są skorelowane z danymi wejściowymi i transkrypcją. Zapoznaj się z poniższą tabelą graficzną, która zawiera wartość korelacji dla każdej transkrypcji. Aby pobrać dane w formacie rozdzielonym tabulatorami, kliknij przycisk Pobierz.

Manipuluj suwakiem wartości korelacji bezwzględnej i obserwuj wszelkie zmiany na najniższym wykresie i tabeli. Niższa rygorystyczność wartości korelacji pokaże więcej transkrypcji, ale wprowadzi więcej szumu. Po zainstalowaniu IR-TEx otwórz plik RStudio Supplemental Coding File1 i uruchom każdy wiersz, aby skonfigurować system dla IR-TEx.

Po pomyślnym zainstalowaniu i zaktualizowaniu wszystkich pakietów zgodnie z wymaganiami przejdź do Plik, Otwórz. Zlokalizuj IR_TEx. r, podświetl i otwórz.

Powinno to być teraz widoczne w górnym oknie programu RStudio. Aby uruchomić aplikację, naciśnij przycisk Uruchom aplikację w prawym górnym rogu okna. Pojawi się drugie okno, w którym załaduje się aplikacja.

Po zakończeniu ładowania, aby uzyskać pełną funkcjonalność, kliknij Otwórz w przeglądarce, znajdujący się w prawym górnym rogu załadowanego okna. Użytkownik może dodawać nowe zestawy danych rezystancji do IR-TEx generowanych za pomocą macierzy Anopheles Gambiae 15k Agilent, zgodnie z opisem w protokole TEx. Otwórz dodatkowe File2.txt.

Ten plik wyszukiwania RNA reprezentuje szablon, na którym powinny być oparte nowe dane. Kolumna A to identyfikator, kolumna B to nieprzetworzona zmiana składania, a kolumna C to skorygowana wartość P. Uruchom kod języka R, aby dopasować identyfikatory do jednego pliku rozdzielanego tabulatorami na różnych platformach, a następnie uporządkuj i znormalizuj dane.

Instrukcje są zawarte w pliku. Każda ścieżka pliku będzie oddzielona ukośnikiem w systemie Mac OS lub podwójnym ukośnikiem w systemie Windows. Utwórz kopię zapasową oryginalnego pliku.

Wyślij plik utworzony na końcu pliku powłoki uzupełniającej2 do wybranej lokalizacji, która zostanie użyta w następnym kroku. Supplemental Coding File2 wygeneruje nowy Fold_Changes. plik txt.

Wykonaj kod zawarty w Dodatkowym pliku kodowania3. Znajdź plik wyjściowy o nazwie FC_DistribPlot. png w folderze określonym jako ścieżka do pliku.

Sprawdź rozkłady Log2 Krotna zmiana, aby upewnić się, że rozkłady Log2 Krotnej zmiany są prawie identyczne w różnych zestawach danych. Pokazano tutaj ekspresję mRNA GS TMS1 i AGAP 009110 RA w dwóch wieloopornych populacjach Anopheles Coluzzii odpowiednio z Wybrzeża Kości Słoniowej i Burkina Faso. Porównanie z podatnym na badania laboratoryjne Anopheles Coluzzii N-Guzo wykazało, że transkrypty te są znacznie regulowane w górę w dwóch oddzielnych populacjach wieloopornych.

Knockdown indukowany RNA-I przeprowadzono na komarach z laboratoryjnej kolonii T-Oscillae LSTM. Kolonia ta pochodzi z Wybrzeża Kości Słoniowej i jest odporna na wszystkie główne klasy insektycydów stosowanych w zdrowiu publicznym. Osłabienie ekspresji GS TMS1 spowodowało znaczny wzrost śmiertelności po ekspozycji na Delta Matheran w porównaniu z kontrolami wstrzykiwanymi GFP, co pokazuje znaczenie tego transkryptu w oporności na pyretroidy.

I odwrotnie, powalenie AGAP 009110 RA nie spowodowało znaczącej zmiany śmiertelności po ekspozycji. GST MS1 był znacznie nadmiernie wyrażony w 20 z 21 zestawów danych mikromacierzy dostępnych dla tych gatunków. W każdej lokalizacji zmiana fałdowania była znacznie wyższa u osób odpornych w porównaniu z populacjami podatnymi.

Wszystkie zestawy danych pochodzą z różnych eksperymentów prowadzonych na przestrzeni wielu lat i nie zostały zaprojektowane z myślą o czystym podejściu opartym na mikroanalizie, więc może być konieczne obniżenie normalnej rygorystyczności wartości P. Dalsza ocena fenotypowego knock-down może być przeprowadzona z innymi insektycydami i cechami historii życia. Jeśli wyniki wyglądają wystarczająco dobrze, dalsze pasożytowanie może określić rolę białka.

Technika ta jest pierwszą aplikacją, która integruje dane transkryptomiczne dotyczące odporności kompleksu gatunków Anopheles Gambiae na insektycydy i udostępnia je wszystkim badaczom w tej dziedzinie.