Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Nasz protokół poprawił zarówno przepustowość, jak i oszczędność czasu w uzyskiwaniu danych RT-qPCR bezpośrednio z pojedynczych próbek lub małych próbek masowych bez konieczności izolacji RNA. Korzystając z tego protokołu, można uzyskać ponad 9 000 wyników RT-qPCR w ciągu zaledwie dwóch dni pracy na stanowisku, co zwykle zajmuje około pięciu tygodni przy użyciu standardowego 96-dołkowego qPCR. Protokół ten zapewnia szybszy, solidny i bardzo czuły test RT-qPCR u C. elegans, który jest idealny do monitorowania międzyosobniczej zmienności ekspresji genów między izogenicznymi robakami.

Zacznij od zebrania robaków z trawnika bakteryjnego na świeżą, niewysianą pożywkę do wzrostu nicieni i pozwól robakom poruszać się po talerzu przez pięć minut. Podczas gdy robaki aklimatyzują się, w kapturze wolnym od RNaz wymieszaj 10 mikrolitrów buforu do lizy z jednym do 100 Dnazy I na próbkę i umieść pokrywkę paska PCR do góry nogami na platformie lunety sekcyjnej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszanki do lizy do wypukłych nakrętek probówki PCR i zgarnij robaki z płytki, aby uniknąć przenoszenia bakterii do każdej szczeliny pokrywki.

Kiedy wszystkie robaki zostaną przeniesione, zamknij nakrętki i obracaj probówki przez pięć sekund przed umieszczeniem probówek w kolbie Dewara z ciekłym azotem. Po ostatnich pięciu sekundach rozmrozić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza, a następnie powtórzyć procedurę zamrażania/rozmrażania jeszcze dziewięć razy. Po ostatnim cyklu zamrażania/rozmrażania mieszać lizowane próbki w mieszalniku termicznym przez 20 do 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i około 1800 obrotów na minutę.

Pod koniec inkubacji mieszania odwirować próbki, jak pokazano, i dodać jeden mikrolitr świeżo rozmrożonego roztworu zatrzymanego do każdej probówki. W celu odwrotnej transkrypcji ciepłych próbek luzem, w kapturze wolnym od RNaz, przygotuj główną mieszankę buforu enzymatycznego i dodaj 14 mikrolitrów mieszanki głównej do 11 mikrolitrów każdej próbki. Przepuść próbki przez termocykler przy użyciu wskazanego programu odwrotnej transkrypcji i rozcieńcz otrzymany produkt cDNA w stosunku od jednego do czterech w wodzie wolnej od nukleaz.

W przypadku preamplifikacji specyficznej dla celu, dodaj 3,75 mikrolitra mieszanki głównej preamplifikacji do jednego dołka na próbkę na 96-dołkowej płytce i dodaj 1,25 mikrolitra każdego roztworu cDNA do każdego dołka mieszanki głównej. Po załadowaniu wszystkich próbek przykryj płytkę taśmą uszczelniającą i krótko zawiruj próbki przed odwirowaniem przez odwirowanie, a następnie załaduj płytkę do termocyklera i uruchom program zgodnie ze wskazaniami. Aby usunąć niewbudowane startery z przedwzmacniacza, na końcu termocyklu odwirować płytkę próbki i ostrożnie zdjąć uszczelkę.

Dodaj dwa mikrolitry mieszanki głównej egzonukleazy I do każdej reakcji wstępnej amplifikacji i ponownie zamknij, odwiruj i załaduj płytkę z powrotem do termocyklera. Pod koniec cyklu rozcieńczyć próbki 18 mikrolitrami buforu Tris-EDTA. Aby skonfigurować układ wielomacielowy, dodaj 3,6 mikrolitra głównej mieszanki do ładowania testu i 0,4 mikrolitra 50 mikromolowego startera do przodu i do tyłu do jednego dołka na próbkę na płytce 384-dołkowej.

Następnie dodać 2,2 mikrolitra próbki wzorcowej mieszanki i 1,8 mikrolitra każdej wstępnie amplifikowanej egzonukleazy, którą potraktowałem próbkę, do odpowiednich dołków płytki. Aby ustawić chip z pojedynczą matrycą, dodaj 5,4 mikrolitra mieszanki głównej do ładowania testu i 0,6 mikrolitra startera do przodu odwróconego do jednego dołka na próbkę drugiej płytki 384-dołkowej, a następnie dodaj 3,3 mikrolitra mieszanki głównej próbki i 2,7 mikrolitra każdej wstępnie amplifikowanej egzonukleazy, którą potraktowałem próbkę, do odpowiednich dołków przygotowanej płytki jednomatrycowej. Aby przygotować chip nanofluidics do pierwszego uruchomienia, powoli i ostrożnie przytrzymując chip pod kątem 45 stopni, wstrzyknij 150 mikrolitrów płynu z przewodu kontrolnego do akumulatorów chipa.

Po załadowaniu całego płynu usuń niebieską folię ochronną z dolnej części chipa i umieść chip w maszynie do zasysania nanofluidics PCR z kodem kreskowym skierowanym na zewnątrz. Następnie uruchom skrypt Prime(153x). Po zagruntowaniu umieścić chip na ciemnej powierzchni i po załadowaniu każdego testu lub mieszanki próbek, w razie potrzeby usunąć odpowiednie zatyczki barierowe i dodać odpowiednią objętość testu lub mieszanki próbek do odpowiednich wlotów chipa nanofluidycznego zgodnie z planem eksperymentalnym.

Po załadowaniu należy umieścić chip w termocyklerze nanofluidycznym i uruchomić odpowiedni protokół w oprogramowaniu do zbierania danych. Jeśli cały układ z wieloma macierzami nie jest używany, wykonaj przebieg skryptu, aby umożliwić dalsze użycie pozostałych tablic chipów. Aby sprawdzić, czy protokół worm-to-Ct jest prawidłową metodą ekstrakcji cDNA, metodę porównano ze standardowymi metodami ekstrakcji tiocyjanianianem guanidu, fenolem i chloroformem.

Na całym świecie poziomy ekspresji mRNA hsp-70 na 100 nanogramów całkowitego RNA były porównywalne zarówno przy użyciu metody fenol-chloroform, jak i robak-ct. Jednak w przypadkach najwyższej ekspresji hsp-70 ekspresja była wyższa w przypadku metody worm-to-CT, co wskazuje na poprawę czułości. W przypadku ekstrakcji tiocyjanianianem guanidu-fenolem-chloroformem próbek masowych, hsp-70 zmniejszył się o 82,7 w mutantach hsf-1 w porównaniu z kontrolami i o 92,3% w przypadku ciepła do Ct, co wskazuje, że spadek był porównywalny między tymi dwiema metodami.

Wykorzystując cDNA uzyskane z próbek zbiorczych 25 robaków lub średnio z 36 próbek pojedynczych robaków, metody wykryły porównywalne poziomy ekspresji dla wszystkich badanych białek opiekuńczych, co wskazuje, że parametry uzyskane od pojedynczych robaków są wiarygodne. Tutaj pokazano średnią ekspresję wielu transkryptów hsp od pojedynczych robaków po krótkim szoku cieplnym. Jak zaobserwowano, zmienność ekspresji transkryptów różni się dramatycznie w zależności od genów.

Dla każdego transkryptu badanego przy użyciu próbek pojedynczych robaków techniczne współczynniki zmienności były niższe niż biologiczne współczynniki zmienności, co wskazuje, że techniczne trilikaty nie były wymagane do oszacowania parametrów, gdy qPCR przeprowadzono na pojedynczych robakach. Podczas wykonywania tego protokołu ważne jest, aby dokładnie pipetować małe objętości i nie pipetować odwrotnie do chipa nanofluidycznego. Protokół ten może być używany do uzyskiwania dużych zestawów danych RT-qPCR, które można następnie eksportować i przetwarzać zgodnie z potrzebami za pomocą skryptów Excel lub R.