Name: Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj protokół wysokoprzepustowego RT-qPCR w C. elegans bez izolacji RNA przy użyciu technologii nanofluidycznej. Metoda umożliwia uzyskanie ponad 9000 wyników w dwa dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sharlene Murdoch i Babraham Institute Facilities za ich wsparcie. JLP był wspierany przez Wellcome Trust (093970/Z/10/Z), a OC jest wspierany przez ERC 638426 i BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biology. 4 (10), 309(2006).</li>
<li>Semrau, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+lineage+decision-making+in+vitro%3A+emerging+concepts+and+novel+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools.</a> Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).</li>
<li>Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics%3A+Recording+the+past+and+predicting+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future.</a> Science. 358 (6359), 69-75 (2017).</li>
<li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).</li>
<li>Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression%3A+from+single+molecules+to+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).</li>
<li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li>
<li>Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).</li>
<li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li>
<li>Serra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+the+Smart-seq2+Protocol+for+Robust+Single+Worm+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq.</a> Bio-protocol. 8 (4), 2729(2018).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Biology. 14 (8), 1007559(2018).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li>
<li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).</li>
<li>Ståhlberg, A., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+workflow+of+single-cell+expression+profiling+using+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+qPCR+gene+expression+profiling+applied+to+1440+lymphoblastoid+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells.</a> Methods. 59 (1), 71-79 (2013).</li>
<li>Fluidigm. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-Time+PCR+Analysis+User+Guide%22">Real-Time PCR Analysis User Guide</a>. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+MIQE+guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>U. S. National Library of Reference. Primer Blast. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2020).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+%28RT-PCR%29%3A+trends+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).</li>
<li>Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNolan%2C+T+%22Good+Practice+guide+for+the+application+of+quantitative+PCR+%28qPCR%29%2C+LGC%22">Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC</a>. , (2013).</li>
<li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 22 (7), 85(2006).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+RNA+Extraction+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol.+Bio-101%22%5BJournal%5D)">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).</li>
<li>Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-Type+Cyclin+CYL-1+and+the+Heat-Shock-Factor+HSF-1+Are+Required+for+Heat-Shock-Induced+Protein+Expression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li>
<li>Zhang, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dbl-1+a+TGF-beta+is+essential+for+C.+elegans+aversive+olfactory+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).</li>
<li>Sørensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+and+Misuse+of+the+Coefficient+of+Variation+in+Organizational+Demography+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Sociological+Methods+%26+Research%22%5BJournal%5D)">The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research.</a> Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).</li>
<li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li>
<li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule wykazano, że protokół Worm-to-CT jest szybką i skuteczną metodą ekstrakcji RNA z pojedynczych robaków lub małej puli robaków. Wysoka przepustowość oferowana przez system nanofluidyczny sprawia, że idealnie nadaje się on do ilościowego określania pomiarów zmienności międzyosobniczej. Co więcej, wysoka czułość tej metody pozwala na wykrycie genów ulegających ekspresji na niskich poziomach, które są poniżej wykrywalności w przypadku stosowania technologii sekwencjonowania RNA pojedynczego robaka9.
Rozważając wybór metody przygotowania cDNA z pojedynczych robaków. Ly i wsp.29 zoptymalizowali protokół, który opiera się na proteinazie K do trawienia kutykuli. Naskórek jest główną przeszkodą w izolacji cząsteczek od robaków, a proteinaza K stanowi skuteczną metodę jego rozbicia. Jednak proteinaza K musi być inaktywowana termicznie, aby móc używać enzymów do odwrotnej transkrypcji. Podczas gdy Ly i in. zastosowali 10-minutową ekspozycję na temperaturę 96 °C, ten krok został pominięty w tym protokole, ponieważ RNA łatwo ulega degradacji. Zamiast używać proteinazy K, zastosowano powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania, aby rozbić naskórek. Zamrożenie i rozmrożenie jest skuteczną metodą rozbijania naskórka, ponieważ można wyizolować więcej RNA na robaka. Ly i in. podają, że całkowite RNA wyekstrahowane na robaka wynosi 35 ng przy użyciu proteinazy K, podczas gdy ten protokół uzyskuje 51,75 ng ± 6,74 SEM całkowitego RNA na robaka. Unikanie ekspozycji na ciepło w połączeniu z etapami preamplifikacji najwyraźniej poszerza zakres dynamiczny wykrywania Worm-to-CT w porównaniu ze standardowymi protokołami. Ly i wsp. podają bezwzględne wartości Ct wynoszące 21,1 ± 0,15 dla hsp-16,2 i 22,8 ± 0,17 dla hsp-70 po szoku cieplnym. Korzystając z tych samych warunków szoku cieplnego (1 h w temperaturze 30 °C), protokół ten uzyskuje bezwzględne wartości Ct wynoszące 17,93 ± 0,57 dla hsp-16,2 i 21,13 ±0,33 dla hsp-70. Oznacza to, że metoda lizy zamrażania i rozmrażania zapewnia wyższą wydajność RNA i jest bardziej odpowiednia dla transkryptów o niskiej ekspresji.
Systemy nanofluidyczne idealnie sprawdzają się przy badaniu danego zestawu docelowych transkryptów i wykorzystaniu mniejszej (układ wielomacierzowy) lub większej (układ jednomacierzowy) liczby próbek, co pozwala na dostosowanie do skali eksperymentu. Aby uzyskać bezstronny obraz wszystkich transkryptów wyrażonych w pojedynczym robaku, oczywistym wyborem jest użycie sekwencjonowania RNA. Jeśli jednak eksperyment skupia się na mniejszym, ale wciąż stosunkowo dużym zestawie genów docelowych, bardziej opłacalne jest wykorzystanie tego protokołu, pod warunkiem, że badacz ma dostęp do maszyny do PCR w technologii nanofluidycznej. Koszt odczynników systemu nanofluidycznego i chipa z pojedynczą macierzą szacuje się na około 13 funtów na robaka, podczas gdy koszt odczynników do sekwencjonowania pojedynczego robaka wyniósłby około 60 funtów na robaka, nie wliczając kosztów sekwencjonowania.
Zastanawiając się, jaką platformę PCR zastosować, metoda Worm-to-CT w połączeniu z nanofluidycznym qPCR oferuje korzyści pod względem czasu i przepustowości. Możliwe jest uzyskanie 9 216 wyników RT-qPCR w ciągu około 2 dni pracy, podczas gdy amplifikacja tej samej liczby celów przy użyciu standardowej platformy qPCR zajęłaby około 5 tygodni roboczych przy użyciu 96 testów płytkowych, przy użyciu czterech płytek dziennie. Jeśli jednak liczba celów do przetestowania jest mniejsza, bardziej opłacalne jest użycie Worm-to-CT w połączeniu ze standardową maszyną qPCR. Układy scalone z pojedynczą macierzą nie mogą być ponownie uruchomione, więc uruchamianie pustych studni zmniejsza opłacalność.
Jednym z ograniczeń metody jest potencjalne tworzenie dimerów starter-starter podczas etapu multipleksowania, ale występuje to w mniej niż 1% przypadków. Chociaż protokół Worm-to-CT jest skuteczny i zapewnia wiarygodne wyniki, gdy jest stosowany do pojedynczych robaków, wskaźnik niepowodzeń wynosi około 5%, co prawdopodobnie odpowiada przypadkom, w których robak pozostaje uwięziony w nasadce lub górnej części rurki podczas etapu zbioru.
Ta wszechstronna i niezawodna metoda zapewnia większą przepustowość i czułość w porównaniu z bardziej standardowymi technikami. Metoda ta może być bardzo przydatna do walidacji wysokoprzepustowych badań przesiewowych i jest doskonałym wyborem do monitorowania lub walidacji poziomów ekspresji genów pojedynczego robaka. Metoda ta może być stosowana do innych wymagających technik, takich jak kwantyfikacja ekspresji genów z izolowanych tkanek. Na przykład izolacja pełnych tkanek, takich jak jelito, gonady lub komórki wyizolowane przez FAC, zapewnia wystarczającą ilość materiału do przeprowadzenia eksperymentów sekwencjonowania RNA. Jednak ograniczone ilości materiału często prowadzą do zduplikowanych odczytów, co wyklucza ilościowe określenie ilości rzadkich transkrypcji. W tym scenariuszu zastosowanie technologii opartej na nanofluidyce powinno zapewnić dodatkową czułość eksperymentów i zwiększyć efektywność kosztową, jeśli naukowcy muszą monitorować tylko podzbiór wszystkich transkryptów w tych tkankach lub komórkach.

Optymalizacja sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i qPCR ujawniła, że impulsy transkrypcyjne lub impulsy mogą prowadzić do ogromnych różnic w liczbie cząsteczek RNA na komórkę1. Co więcej, technologie te ujawniły znaczną heterogeniczność komórkową, która wcześniej była pomijana w standardowych masowych pomiarach transkryptomicznych. W zależności od kontekstu, pewna zmienność transkrypcyjna pojedynczej komórki jest spowodowana mieszanym składem komórkowym tkanek. Jednak nawet w izogenicznych populacjach komórek hodowanych w tym samym środowisku występuje powszechna heterogeniczność transkrypcyjna2,3. Ta "biologiczna zmienność" jest coraz częściej identyfikowana jako wszechobecna właściwość sieci komórkowych, od bakterii po człowieka. W niektórych przypadkach może mieć fenotypowe konsekwencje w rozwoju, progresji raka, opóźnieniu HIV i odpowiedzi na chemioterapię4,5.
Nicień Caenorhabditis elegans jest unikalnym organizmem modelowym o idealnych cechach do badania przyczyn i konsekwencji biologicznej zmienności między osobnikami. Nicienie te są prostym organizmem modelowym składającym się z 959 komórek, a ich przezroczysty naskórek sprawia, że są podatne na badania obrazowe in vivo6. C. elegans jest gatunkiem hermafrodytycznym, który rozmnaża się głównie poprzez samozapłodnienie; W ten sposób powstały izogeniczne szczepy laboratoryjne. Pomimo izogeniczności i kontrolowanych warunków hodowli, wiele fenotypów i transkryptów jest zmiennych u poszczególnych osób, co sugeruje, że różnice stochastyczne lub mikrośrodowiskowe przyczyniają się do niejednorodności między osobnikami7,8. Taka zmienność ekspresji genów ma wielorakie konsekwencje związane z przystosowaniem, w tym zmienność w penetracji mutacji, przeżywalności, czasie rozwoju i płodności7,8,9. Ze względu na te cechy, badania nad pojedynczymi robakami dają niespotykaną dotąd możliwość badania zmienności biologicznej w całym organizmie.
Istnieje fundamentalna potrzeba rozwoju i optymalizacji technologii do dokładnego wykrywania transkryptów na poziomie pojedynczego robaka. Nowe technologie, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego robaka10, sekwencjonowanie RNA z izolowanych tkanek11 oraz sekwencjonowanie pojedynczych komórek12 są teraz dostępne dla C. elegans. Pozostaje jednak główne wyzwanie: podczas monitorowania interindywidualności geny o słabej ekspresji często spadają poniżej wykrywalnych poziomów13. Jest to szczególnie istotne w przypadku rzadkich transkryptów wyizolowanych z niewielkich ilości materiału wyjściowego, ponieważ istnieje dobrze ugruntowana, odwrotna zależność między średnim wyrażeniem a wariancją techniczną, co często powoduje, że rzadkie transkrypty spadają poniżej statystycznych punktów odcięcia13. Optymalizacja wysokoprzepustowych technologii multipleksowanego qPCR okazała się przydatna w badaniach pojedynczych komórek ssaków, w szczególności podczas badania ekspresji rzadkich transkryptów14,15. Technologia ta może być również wykorzystywana do celów analizy porównawczej i walidacji innych technologii pojedynczych robaków.
Worm-to-CT to szybka, solidna metoda zaadaptowana z zestawu używanego w badaniach biologii komórki, do przygotowania cDNA pojedynczego robaka. cDNA uzyskane tą metodą w połączeniu z multipleksowaną nanofluidyczną technologią qPCR zostało wybrane, ponieważ zapewnia wyższą przepustowość eksperymentalną, szerszy zakres dynamiczny wykrywania i zostało zatwierdzone do celów jednokomórkowych14,15. Opisany preparat cDNA ma również zastosowanie do stosowania ze standardowymi technologiami PCR. Przepustowość zwiększa się na dwa sposoby: po pierwsze, przygotowanie cDNA jest szybsze i bardziej niezawodne niż tradycyjna ekstrakcja tiocyjanianianem guanidu, fenolem i chloroformem, ponieważ robaki są bezpośrednio dodawane do buforu do lizy, pomijając bezpośrednią izolację łatwo degradowalnego RNA. Po drugie, wykorzystanie technologii nanofluidycznych znacznie zwiększa liczbę próbek i celów, które można badać jednocześnie. W tym artykule porównano dwa układy scalone: układ jednoukładowy i układ wielomacierzowy. Pojedynczy układ scalony może uruchomić 96 pojedynczych robaków i 96 zestawów starterów, co daje 9 216 reakcji na eksperyment. Osiągnięcie podobnej przepustowości przy użyciu standardowych technologii qPCR wymagałoby 96 oddzielnych eksperymentów qPCR przy użyciu 96-dołkowych płytek. Mniejszy i bardziej elastyczny układ wielomacierzowy składa się z sześciu macierzy 12 x 12, co daje 864 reakcje. Wyjątkowa niezawodność i czułość metody została zwiększona dzięki technologii nanofluidycznej i wprowadzeniu etapu preamplifikacji. Metoda przedstawiona w tym artykule ma być stosowana w połączeniu z najnowocześniejszym algorytmem statystycznym do wyodrębniania wariancji biologicznej. W artykule przedstawiono protokół szybkiego przygotowania cDNA i wysokoprzepustowego qPCR zarówno dla próbek pojedynczych robaków, jak i próbek wsadowych; Algorytm zostanie opublikowany w innym miejscu. W przypadku tego protokołu organizacja każdego chipa powinna być przygotowana przed eksperymentem. Tabele 1 i Tabela 2 pokazują przykłady tych planów odpowiednio dla układu wielomacierzowego i jednomacierzowego. Znajdują się tam również przeglądy protokołu Worm-to-CT szczegółowo opisane w Rysunek 1 oraz uruchamianie układów wielomacierzowych i jednotablicowych w Rysunek 2.

<table><tbody><tr><td>100 i mikro; M podstawowe startery dla genów będących przedmiotem zainteresowania.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X Barwnik wiążący DNA</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td><td>do chipa 96.96 (chip z pojedynczą matrycą)</td></tr> <tr><td>2X Test ładowania odczynnika</td><td>Fluidigm</td><td>100-7611</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki 8-paskowe probówki</td><td></td><td></td><td></td>PCR</tr><tr><td>96-dołkowe płytki z blokiem</td><td></td><td></td><td></td>lodu</tr><tr><td>96 dołków</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td>Określany w całym manuskrypcie jako "Single-Array Chip"</td></tr><tr><td>96-dołkowa taśma</td><td></td><td></td><td></td>uszczelniająca</tr><tr><td>BioMark & Oprogramowanie EP1</td><td>Fluidigm</td><td>101-6793</td><td>Zawiera: oprogramowanie Biomark HD Data Collection, oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym, oprogramowanie do analizy genotypowania SNP, oprogramowanie do cyfrowej analizy PCR, oprogramowanie do analizy krzywej topnienia</td></tr><tr><td>BioMark lub system BioMark HD</td><td>Fluidigm</td><td>100-2451 K1</td><td>Określany w całym manuskrypcie jako "termocykler nanofluidyczny"</td></tr><tr><td>Zestaw płynów do przewodów kontrolnych dla 96.96 i FlexSix IFC</td><td>Fluidigm</td><td>89000021</td><td>Określany w całym manuskrypcie jako "płyn linii kontrolnej"</td></tr><tr><td>Bufor zawiesinowy</td><td>DNA TEKnova</td><td>T0021</td><td></td></tr><tr><td>kopulaste kapsułki</td><td></td><td></td><td></td>PCR</tr><tr><td>Egzonukleaza I</td> New <td>England BioLabs</td><td>M0293L</td><td></td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny egzonukleazy I</td> New <td>England BioLabs</td><td>B0293S</td><td></td></tr><tr><td>FLEXsix DELTAgene Odczynnik do próbki</td><td>Fluidigm</td><td>100-7673</td><td>określany w całym manuskrypcie jako "odczynnik próbki"</td></tr><tr><td>FLEXsix Gene Expression IFC</td><td>Fluidigm</td><td>100-6308</td><td>określany w całym manuskrypcie jako "Multi-Array Chip"</td></tr> <tr><td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide</td><td>Fluidigm</td><td>68000088</td><td>Jest to protokół używany jako podstawa sekcji 2 protokołu, do którego odwołuje się manuskrypt.</td></tr><tr><td>Kontroler IFC MX</td><td>Fluidigm</td><td>68000112 I1</td><td>Określany w całym manuskrypcie jako "maszyna do gruntowania nanofluidyki PCR"</td></tr><tr><td>Kontrolery IFC SOFTWEAR</td><td>Fluidigm</td><td>100-2297</td><td>Zawiera wszystkie oprogramowanie i skrypty wymagane do uruchomienia kontrolera IFC</td></tr><tr><td>MX ciekły azot w mikrowirówce Dewara</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>StarLab</td><td>C1301B-230V</td><td>Służy do odkręcania pasków probówki PCR w protokole.</td></tr><tr><td>Wirówka do płytek</td><td></td><td></td><td></td>wodnych bez nukleaz</tr><tr><td></td><td>Labnet</td><td>K4050725</td><td>mini wirówka do płytek, mps 1000. określany w protokole jako "spinner talerzowy"</td></tr><tr><td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td><td>invitrogen</td><td>4402955</td><td>Ten zestaw jest przystosowany do stosowania w nicieniach w protokole Worm-to-CT. Contense: Store Stop Solution, DNase I i 20X RT Enzyme Mix w temperaturze -20&deg;C. Przechowuj roztwór do lizy, 2X SYBR RT Buffer (określany w całym manuskrypcie jako bufor RT) i Power SYBR&reg; Green PCR Master Mix (określany w manuskrypcie jako PCR Master Mix). Ten zestaw jest przeznaczony na 400 reakcji, zestawy dostępne są również dla 40 i 100 reakcji.</td></tr><tr><td>PreAmp Master Mix</td><td>Fluidigm</td><td>100-5580, 100-5581</td><td></td></tr><tr><td>Mistrz odwrotnej transkrypcji Mix&mdash; 480 reakcji</td><td>Fluidigm</td><td>100-6299</td><td>Jedna probówka dostępna również dla 96 reakcji (PN100-6298)</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td>wolna od rnaz</tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix z Low ROX</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>172-5211</td><td>określany w całym manuskrypcie jako "supermix sondy fluorescencyjnej"</td></tr><tr><td>Standardowy 96-dołkowy i 384-dołkowy bufor termocyklera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE (10mM Tris, pH 8,0, 1,0 mM EDTA</td><td>TEKnova</td><td>T0224</td><td>Określany w całym manuskrypcie jako bufor Tris-EDTA</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000031</td><td>Określany w tekście jako "mieszalnik termiczny"</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15596026</td><td>Określany w protokole jako "tiocyjanian guanidu-fenol-chloroform"</td></tr><tr><td>Ciepła kąpiel</td><td></td><td></td><td></td> wodna</tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy ilościowy rt-pcr w pojedynczych i masowych próbkach c. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

Ten artykuł przedstawia wysokoprzepustowy test ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) dla Caenorhabditis elegans, który jest szybki, solidny i bardzo czuły. Protokół ten pozwala na uzyskanie precyzyjnych pomiarów ekspresji genów od pojedynczych robaków lub z próbek zbiorczych. Przedstawiony tutaj protokół stanowi nowatorską adaptację istniejących metod otrzymywania komplementarnego DNA (cDNA) sprzężonego z nanofluidyczną platformą RT-qPCR. Pierwsza część tego protokołu, nazwana "Worm-to-CT", umożliwia produkcję cDNA bezpośrednio z nicieni bez konieczności wcześniejszej izolacji mRNA. Zwiększa przepustowość eksperymentalną, umożliwiając przygotowanie cDNA z 96 robaków w ciągu 3,5 godziny. Druga część protokołu wykorzystuje istniejącą technologię nanofluidyczną do przeprowadzania wysokoprzepustowego RT-qPCR na cDNA. W artykule tym oceniano dwa różne chipy nanofluidyczne: pierwszy obejmuje 96 próbek i 96 celów, co daje 9216 reakcji w ciągu około 1,5 dnia pracy laboratoryjnej. Drugi typ układu składa się z sześciu układów 12 x 12, co daje 864 reakcje. W tym przypadku metoda Worm-to-CT została zademonstrowana poprzez ilościowe określenie poziomów mRNA genów kodujących białka szoku cieplnego z pojedynczych robaków i z próbek zbiorczych. Dostarczono obszerną listę starterów przeznaczonych do amplifikacji przetworzonego RNA dla większości genów kodujących w genomie C. elegans.

Walidacja metody Worm-to-CT jako sposobu przygotowania cDNA
Aby sprawdzić, czy protokół Worm-to-CT jest prawidłową metodą ekstrakcji cDNA, porównano go ze standardowymi metodami ekstrakcji z użyciem tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu. Wyniki przedstawiono na Rysunku 3, gdzie cDNA przygotowano ze średnio ~1 000 nicieni przy użyciu standardowych technik ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem22 oraz z 30 nicieni przy użyciu metody Worm-to-CT. Próbki poddano jednoczesnemu szokowi termicznemu (30 min w 34 °C). Ogólnie poziomy ekspresji mRNA hsp-70 na 100 ng całkowitego RNA były porównywalne przy zastosowaniu obu metod. Jednak w przypadku najwyższej ekspresji hsp-70 (tj. w szczepie N2 po szoku termicznym) poziomy ekspresji były wyższe przy zastosowaniu metody Worm-to-CT, co wskazuje na poprawioną czułość.
Aby sprawdzić, czy można odtworzyć oczekiwany spadek ekspresji hsp u hsf-1(sy441)23, mutacji głównego regulatora transkrypcyjnego chaperonów molekularnych23,24, porównano indukcję transkrypcyjną chaperonów po krótkim szoku termicznym. W obu metodach stwierdzono spadek indukcji hsp-70 u zwierząt hsf-1(sy441). Było to spodziewane, ponieważ mutanty hsf-1(sy441) wykazują obniżoną zdolność do indukcji chaperonów z powodu truncacji w domenie transaktywacyjnej HSF-1. W przypadku ekstrakcji guanidianem tiocyjanianu-fenolem-chloroformem poziom hsp70 spadł o 82,7% w porównaniu z kontrolą, a w metodzie Worm-to-CT o 92,3% w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego (Rycina 3). Wyniki były porównywalne dla obu metod oraz zgodne z wcześniejszymi doniesieniami23. Wyniki te wskazują, że metoda Worm-to-CT stanowi poprawną alternatywę dla standardowych technik syntezy cDNA.
Walidacja platformy nanofluidycznej PCR wykorzystywanej do amplifikacji celów mRNA
Aby przetestować spójność wyników uzyskanych przy użyciu nanofluidycznej qPCR w celu amplifikacji transkryptów, porównano wyniki PCR otrzymane metodą masową Worm-to-CT zarówno w standardowym systemie qPCR (Tabela materiałów) oraz nanofluidyczny system qPCR z wykorzystaniem chipa wielkoprzestrzennego. Krotność zmiany ekspresji trzech różnych genów, sma-3 (Rysunek 4A), sma-10 (Rycina 4B), i dnj-26, monitorowano (Rysunek 4C) u zwierząt posiadających allel null w dbl-1 (dbl-1(nk3))25 w porównaniu do odpowiedników typu dzikiego. Dbl-1 koduje jedyny ligand szlaku sygnalizacyjnego białka morfogenetycznego kości (BMP). sma-3 i sma-10 są genami kodującymi ortologi SMAD, kluczowe komponenty kaskady sygnałowej BMP. Dnj-26 koduje chaperonę molekularną, będącą celem sygnalizacji BMP. Wyniki te wykazują niewielką lub żadną różnicę w krotności zmiany (fold change) przy porównaniu rezultatów obu metod, co skutkuje nieistotnymi statystycznie wartościami P wynoszącymi odpowiednio 0,3113, 0,2635 i 0,3481 dla sma-3, sma-10i dnj-26odpowiednio. Łącznie wyniki te wykazują, że metoda Worm-to-CT zastosowana do próbek zbiorczych jest wydajnym i szybkim sposobem izolacji RNA z niewielkiej liczby nicieni i dostarcza wiarygodnych danych w połączeniu ze standardowymi systemami PCR lub wysokoprzepustowymi platformami qPCR opartymi na nanofluidyce.
Porównanie poziomów ekspresji uzyskanych z próbek zbiorczych z wartościami średnimi uzyskanymi z pojedynczych nicieni
Względne poziomy ekspresji obliczono, wykorzystując cDNA uzyskane z próbek zbiorczych (25 nicieni) lub ze średniej z 36 próbek pojedynczych nicieni (Rysunek 5). Oba rodzaje cDNA uzyskano metodą Worm-to-CT i powielono z wykorzystaniem technologii nanofluidycznej PCR. Jak zaobserwowano na Rysunku 5A–C, dla wszystkich badanych chaperonów (tj. hsp16.1, F44E5.4, hsp-70) obie metody wykryły porównywalne poziomy ekspresji. Wyniki te wskazują, że parametry uzyskane z pojedynczych nicieni są wiarygodne.
Zastosowanie technologii Worm-to-CT połączonej z nanofluidyką do szacowania parametrów ekspresji genów pojedynczych nicieni
Ponieważ chip z jedną macierzą umożliwia monitorowanie do 96 transkryptów docelowych w 96 pojedynczych próbkach, nadaje się on do badania zmienności osobniczej w ekspresji transkryptów między pojedynczymi nicieniami. Rycina 6A przedstawia reprezentatywny wynik ukazujący średnią ekspresję wielu transkryptów hsp z pojedynczych nicieni po krótkim szoku termicznym. Jak zaobserwowano na rycinie, zmienność ekspresji transkryptów różniła się drastycznie w zależności od genu (Rycina 6A). Aby uzyskać więcej informacji, obliczono współczynnik zmienności (CV), dzieląc odchylenie standardowe przez średnią poziomów ekspresji26 (Rycina 6B). Monitorowano trzy geny, których wartości CV zostały wcześniej oszacowane alternatywnymi metodami (dane niepublikowane). Dwa stabilne transkrypty (ife-1 oraz Y45F10D.4) i jeden zmienny (nlp-2927) wykazały oczekiwaną zmienność. Wykres wyraźnie przedstawia również znany odwrotny związek między wartościami zmienności a poziomami ekspresji26 (Rycina 6B).
Powtórzenia techniczne są kluczowe dla zapewnienia powtarzalności w przypadku stosowania próbek zbiorczych. Niekoniecznie ma to jednak miejsce w eksperymentach na pojedynczych komórkach.14,15,28Aby ustalić, czy w przypadku stosowania próbek pojedynczych nicieni konieczne jest wykorzystanie powtórzeń technicznych do szacowania parametrów, 28&#160;pobrano pojedyncze nicienie,&#160;po krótkim szoku termicznym, a następnie przetworzono z wykorzystaniem triplikatów technicznych. Wartości CV obliczone z danych dla pojedynczych nicieni uzyskanych w trzech powtórzeniach (niebieskie kropki w Rycina 7, techniczny współczynnik zmienności (CV)) w porównaniu do tych dla każdego transkryptu uzyskanego z poszczególnych nicieni (czerwone kropki w Rycina 7, zmienności biologicznej) poddano porównaniu. W przypadku każdego przetestowanego transkryptu współczynniki zmienności (CV) technicznej były niższe niż współczynniki zmienności biologicznej, co wskazuje, że do oszacowania parametrów nie były wymagane powtórzenia techniczne w trzech kopiach. Brak konieczności wykonywania powtórzeń technicznych zwiększa przepustowość eksperymentu bez obniżania jego jakości.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Przegląd protokołu Worm-to-CT. 
Na tym rysunku przedstawiono krótki przegląd poszczególnych etapów wymaganych do przeprowadzenia analizy nicieni zgodnie z protokołem Worm-to-CT. Przedstawiono dwie opcjonalne metody dla etapu odwrotnej transkrypcji; są to metody zamienne, możliwe do zastosowania dla każdego typu chipa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Przegląd przygotowania i przeprowadzania nanofluidycznego qPCR. 
Na tym rysunku przedstawiono przygotowania do uruchomienia nanofluidycznego systemu qPCR z wykorzystaniem chipa wielomaćcianowego oraz chipa jednocząstkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Protokół Worm-to-CT zastosowany do próbek zbiorczych dostarczył wiarygodnych wyników. 
Porównanie protokołu Worm-to-CT z regularną ekstrakcją tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem22 w próbkach zbiorczych. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, u mutantów hsf-1(sy441)23 poziomy transkryptów hsp w odpowiedzi na szok termiczny uległy obniżeniu. Powyższe histogramy przedstawiają indukcję hsp-70 w przypadku braku (-) lub po (+) krótkim szoku termicznym trwającym 30 min w 34 °C. cDNA uzyskano za pomocą ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem zastosowanej do 1 000 nicieni (lewo) lub za pomocą metody Worm-to-CT zastosowanej do 30 połączonych nicieni (prawo). Porównano poziomy ekspresji hsp-70 na 100 ng całkowitego RNA uzyskanego każdą z metod. Zgodnie z oczekiwaniami, u hsf-1(sy441) indukcja transkrypcyjna hsp-70 w odpowiedzi na szok termiczny znacząco spadła o 82,7% przy użyciu tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu oraz o 92,3% przy użyciu metody Worm-to-CT. Poziomy mRNA genów docelowych znormalizowano względem średniej z trzech genów housekeepingowych: cdc-42, pmp-3 i ire-1. Każda kropka reprezentuje powtórzenie biologiczne. Dane zostały poddane transformacji logarytmicznej do analizy statystycznej, ponieważ nie spełniały założeń wymaganych do analizy parametrycznej. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą RM-One-way ANOVA z zastosowaniem testu wielokrotnych porównań Sidaka. Typ dziki = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Słupki oznaczają błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Wzorce ekspresji były spójne pomiędzy standardowymi systemami qPCR a nanofluidycznymi systemami qPCR. 
(A) Poziom ekspresji mRNA dla sma-3&#160;(A), sma-10 (B) lub dnj-26 (C) został określony za pomocą standardowego qPCR oraz nanofluidycznego qPCR (chip wielkopolowy) z trzech powtórzeń biologicznych cDNA otrzymanego metodą Worm-to CT z dzikiego szczepu (N2) oraz szczepu z nokautem dbl-1(nk3)25. Względne poziomy ekspresji mRNA dla każdego szczepu określono metodą Delta-Ct21. Następnie obliczono krotność zmiany (fold change), dzieląc poziomy ekspresji uzyskane u nicieni dbl-1(nk3) przez odpowiadające im poziomy mRNA w szczepie N2. Jak pokazano na panelu A, wzorce były spójne dla obu metod w każdym poszczególnym powtórzeniu biologicznym. (B) i (C) przedstawiają analogiczne wyniki jak w przypadku (A) dla poziomów mRNA sma-10 i dnj-26 odpowiednio. Poziomy docelowego mRNA znormalizowano względem genów housekeepingowych cdc-42 i pmp-3. Analizę statystyczną dla każdego genu przeprowadzono za pomocą sparowanego testu t, porównując wyniki trzech powtórzeń biologicznych uzyskanych za pomocą standardowego qPCR z wynikami uzyskanymi za pomocą nanofluidycznego qPCR. Wartości P dla tych porównań wynosiły odpowiednio 0,3113, 0,2635 i 0,3481 dla sma-3, sma-10 i dnj-26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2.jpg" /> 
Rycina 5: Zastosowanie metody Worm-to-CT w próbkach zbiorczych lub w pojedynczych nicieniach pozwoliło uzyskać podobne poziomy ekspresji po normalizacji na jednego nicienia. 
Poziomy ekspresji (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 oraz (C) hsp-70 (C12C8.1) analizowano u młodych osobników dorosłych w warunkach braku szoku termicznego, przeprowadzając procedurę Worm-to-CT albo na zbiorczej próbce 25 osobników, albo na 36 pojedynczych osobnikach. Po normalizacji danych na jednego nicienia nie stwierdzono istotnych różnic między poziomami uzyskanymi na jednego nicienia dla każdego transkryptu przy zastosowaniu obu metod. Poziomy mRNA genów docelowych znormalizowano względem średniej z trzech genów pomocniczych (housekeeping genes): cdc-42, pmp-3 oraz ire-1. Słupki reprezentują błąd standardowy średniej. Analiza statystyczna = test t dla prób zależnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig06.jpg" /> 
Rycina 6: Wysokoprzepustowa analiza RT-qPCR pojedynczych nicieni z wykorzystaniem metody Worm-to-CT pozwala na monitorowanie zmienności międzyosobniczej w ekspresji genów. 
(A) średnie poziomy ekspresji 53 transkryptów uzyskane po krótkotrwałym szoku termicznym (30 min w temperaturze 34 &#176;C). Wykresy pudełkowe przedstawiają rozkład średniej ekspresji mRNA z poszczególnych nicieni (dla każdego osobnika wykorzystano średnią z trzech powtórzeń technicznych). Kropki reprezentują poziomy ekspresji u 28 poszczególnych nicieni. Poziomy mRNA genów docelowych znormalizowano względem średniej z trzech genów pomocniczych. cdc-42, pmp-3i ire-1. (B) Współczynnik zmienności26 (CV) jako funkcja średniej ekspresji mRNA dla 53 transkryptów po ekspozycji na krótki szok termiczny została obliczona na podstawie danych z 28 osobników (surowe dane przedstawiono w panelu B). Zbiór transkryptytów obejmuje zmienną nlp-29 transkrypcja27 oraz dwa stabilne transkrypty (ife-1 i Y45F10D.4; niepublikowane dane). CV (współczynnik zmienności) jest stosunkiem odchylenia standardowego do średniej. Współczynnik ten wykorzystano do oszacowania zmienności międzyosobniczej w ekspresji transkryptów pomiędzy poszczególnymi osobnikami nicieni. Zgodnie z oczekiwaniami, zmienność międzyosobnicza rosła wraz ze spadkiem średnich poziomów ekspresji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig07.jpg" /> 
Rysunek 7: Powtórzenia techniczne nie były konieczne podczas analizy zmienności międzyosobniczej w ekspresji genów z wykorzystaniem chipa nanofluidycznego. 
Dane przedstawione na tym wykresie uzyskano u 28 poszczególnych nicieni po krótkim szoku termicznym (30 min w 34 °C). Każda czerwona kropka reprezentuje współczynnik zmienności (CV) średnich poziomów ekspresji transkryptu dla jednego badanego transkryptu pomiędzy 28 poszczególnymi nicierniami (bio CV). Każda niebieska kropka reprezentuje CV poziomów ekspresji pomiędzy trzema powtórzeniami technicznymi uzyskanymi z jednego nicienia, na każdy badany transkrypt (technical CV). Wykres ten pokazuje, że zmienność techniczna (między powtórzeniami technicznymi) była znacznie niższa niż zmienność biologiczna (między poszczególnymi nicierniami), co sugeruje, że przy badaniu ekspresji genów w pojedynczych nicierniami, podobnie jak w badaniach pojedynczych komórek14,15,28, nie ma potrzeby wykonywania powtórzeń technicznych na nanofluidycznym układzie do ekspresji genów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Schemat rozmieszczenia dla chipa wielomatrycowego. Powyższa tabela przedstawia prosty układ, który można wykorzystać podczas planowania analizy na chipie wielomatrycowym. Po lewej stronie znajdują się miejsca, które należy wypełnić docelowymi starterami, a po prawej miejsca przeznaczone na analizowane próbki. Każda matryca testów i próbek jest sparowana numerycznie w obrębie chipa. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Plan układu dla chipa z pojedynczą macierzą. Powyższa tabela przedstawia prosty układ, który można wykorzystać podczas planowania pracy z chipem z pojedynczą macierzą. Po lewej stronie znajdują się miejsca, które należy wypełnić docelowymi starterami, a po prawej miejsca przeznaczone na badane próbki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Lista starterów RT-qPCR użytych w tym badaniu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_3.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Primery z bazy danych primerów do RT-qPCR. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_S1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Nasz protokół poprawił zarówno przepustowość, jak i oszczędność czasu w uzyskiwaniu danych RT-qPCR bezpośrednio z pojedynczych próbek lub małych próbek masowych bez konieczności izolacji RNA. Korzystając z tego protokołu, można uzyskać ponad 9 000 wyników RT-qPCR w ciągu zaledwie dwóch dni pracy na stanowisku, co zwykle zajmuje około pięciu tygodni przy użyciu standardowego 96-dołkowego qPCR. Protokół ten zapewnia szybszy, solidny i bardzo czuły test RT-qPCR u C. elegans, który jest idealny do monitorowania międzyosobniczej zmienności ekspresji genów między izogenicznymi robakami.Zacznij od zebrania robaków z trawnika bakteryjnego na świeżą, niewysianą pożywkę do wzrostu nicieni i pozwól robakom poruszać się po talerzu przez pięć minut. Podczas gdy robaki aklimatyzują się, w kapturze wolnym od RNaz wymieszaj 10 mikrolitrów buforu do lizy z jednym do 100 Dnazy I na próbkę i umieść pokrywkę paska PCR do góry nogami na platformie lunety sekcyjnej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszanki do lizy do wypukłych nakrętek probówki PCR i zgarnij robaki z płytki, aby uniknąć przenoszenia bakterii do każdej szczeliny pokrywki.Kiedy wszystkie robaki zostaną przeniesione, zamknij nakrętki i obracaj probówki przez pięć sekund przed umieszczeniem probówek w kolbie Dewara z ciekłym azotem. Po ostatnich pięciu sekundach rozmrozić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza, a następnie powtórzyć procedurę zamrażania/rozmrażania jeszcze dziewięć razy. Po ostatnim cyklu zamrażania/rozmrażania mieszać lizowane próbki w mieszalniku termicznym przez 20 do 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i około 1800 obrotów na minutę.Pod koniec inkubacji mieszania odwirować próbki, jak pokazano, i dodać jeden mikrolitr świeżo rozmrożonego roztworu zatrzymanego do każdej probówki. W celu odwrotnej transkrypcji ciepłych próbek luzem, w kapturze wolnym od RNaz, przygotuj główną mieszankę buforu enzymatycznego i dodaj 14 mikrolitrów mieszanki głównej do 11 mikrolitrów każdej próbki. Przepuść próbki przez termocykler przy użyciu wskazanego programu odwrotnej transkrypcji i rozcieńcz otrzymany produkt cDNA w stosunku od jednego do czterech w wodzie wolnej od nukleaz.W przypadku preamplifikacji specyficznej dla celu, dodaj 3,75 mikrolitra mieszanki głównej preamplifikacji do jednego dołka na próbkę na 96-dołkowej płytce i dodaj 1,25 mikrolitra każdego roztworu cDNA do każdego dołka mieszanki głównej. Po załadowaniu wszystkich próbek przykryj płytkę taśmą uszczelniającą i krótko zawiruj próbki przed odwirowaniem przez odwirowanie, a następnie załaduj płytkę do termocyklera i uruchom program zgodnie ze wskazaniami. Aby usunąć niewbudowane startery z przedwzmacniacza, na końcu termocyklu odwirować płytkę próbki i ostrożnie zdjąć uszczelkę.Dodaj dwa mikrolitry mieszanki głównej egzonukleazy I do każdej reakcji wstępnej amplifikacji i ponownie zamknij, odwiruj i załaduj płytkę z powrotem do termocyklera. Pod koniec cyklu rozcieńczyć próbki 18 mikrolitrami buforu Tris-EDTA. Aby skonfigurować układ wielomacielowy, dodaj 3,6 mikrolitra głównej mieszanki do ładowania testu i 0,4 mikrolitra 50 mikromolowego startera do przodu i do tyłu do jednego dołka na próbkę na płytce 384-dołkowej.Następnie dodać 2,2 mikrolitra próbki wzorcowej mieszanki i 1,8 mikrolitra każdej wstępnie amplifikowanej egzonukleazy, którą potraktowałem próbkę, do odpowiednich dołków płytki. Aby ustawić chip z pojedynczą matrycą, dodaj 5,4 mikrolitra mieszanki głównej do ładowania testu i 0,6 mikrolitra startera do przodu odwróconego do jednego dołka na próbkę drugiej płytki 384-dołkowej, a następnie dodaj 3,3 mikrolitra mieszanki głównej próbki i 2,7 mikrolitra każdej wstępnie amplifikowanej egzonukleazy, którą potraktowałem próbkę, do odpowiednich dołków przygotowanej płytki jednomatrycowej. Aby przygotować chip nanofluidics do pierwszego uruchomienia, powoli i ostrożnie przytrzymując chip pod kątem 45 stopni, wstrzyknij 150 mikrolitrów płynu z przewodu kontrolnego do akumulatorów chipa.Po załadowaniu całego płynu usuń niebieską folię ochronną z dolnej części chipa i umieść chip w maszynie do zasysania nanofluidics PCR z kodem kreskowym skierowanym na zewnątrz. Następnie uruchom skrypt Prime(153x). Po zagruntowaniu umieścić chip na ciemnej powierzchni i po załadowaniu każdego testu lub mieszanki próbek, w razie potrzeby usunąć odpowiednie zatyczki barierowe i dodać odpowiednią objętość testu lub mieszanki próbek do odpowiednich wlotów chipa nanofluidycznego zgodnie z planem eksperymentalnym.Po załadowaniu należy umieścić chip w termocyklerze nanofluidycznym i uruchomić odpowiedni protokół w oprogramowaniu do zbierania danych. Jeśli cały układ z wieloma macierzami nie jest używany, wykonaj przebieg skryptu, aby umożliwić dalsze użycie pozostałych tablic chipów. Aby sprawdzić, czy protokół worm-to-Ct jest prawidłową metodą ekstrakcji cDNA, metodę porównano ze standardowymi metodami ekstrakcji tiocyjanianianem guanidu, fenolem i chloroformem.Na całym świecie poziomy ekspresji mRNA hsp-70 na 100 nanogramów całkowitego RNA były porównywalne zarówno przy użyciu metody fenol-chloroform, jak i robak-ct. Jednak w przypadkach najwyższej ekspresji hsp-70 ekspresja była wyższa w przypadku metody worm-to-CT, co wskazuje na poprawę czułości. W przypadku ekstrakcji tiocyjanianianem guanidu-fenolem-chloroformem próbek masowych, hsp-70 zmniejszył się o 82,7 w mutantach hsf-1 w porównaniu z kontrolami i o 92,3% w przypadku ciepła do Ct, co wskazuje, że spadek był porównywalny między tymi dwiema metodami.Wykorzystując cDNA uzyskane z próbek zbiorczych 25 robaków lub średnio z 36 próbek pojedynczych robaków, metody wykryły porównywalne poziomy ekspresji dla wszystkich badanych białek opiekuńczych, co wskazuje, że parametry uzyskane od pojedynczych robaków są wiarygodne. Tutaj pokazano średnią ekspresję wielu transkryptów hsp od pojedynczych robaków po krótkim szoku cieplnym. Jak zaobserwowano, zmienność ekspresji transkryptów różni się dramatycznie w zależności od genów.Dla każdego transkryptu badanego przy użyciu próbek pojedynczych robaków techniczne współczynniki zmienności były niższe niż biologiczne współczynniki zmienności, co wskazuje, że techniczne trilikaty nie były wymagane do oszacowania parametrów, gdy qPCR przeprowadzono na pojedynczych robakach. Podczas wykonywania tego protokołu ważne jest, aby dokładnie pipetować małe objętości i nie pipetować odwrotnie do chipa nanofluidycznego. Protokół ten może być używany do uzyskiwania dużych zestawów danych RT-qPCR, które można następnie eksportować i przetwarzać zgodnie z potrzebami za pomocą skryptów Excel lub R.

high-throughput-quantitative-rt-pcr-single-bulk-c-elegans-samples

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Ten film opisuje technikę szybkiego badania pojedynczego nicienia pod kątem markera genetycznego za pomocą badania przesiewowego PCR. W przykładowym protokole przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem edycji genomu opartej na CRISPR.

PCR z pojedynczym robakiem: metoda ekstrakcji i amplifikacji genomowego DNA

Źródło: Anderson, Q. L. i wsp. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych z wykorzystaniem Caenorhabditis elegans do badania knockdownów genów podczas interakcji gospodarz-patogen. Przedstawiono w nim procedurę przygotowania powalanych robaków i przenoszenia ich na płytki testowe w celu oceny skutków zabijania robaków przez patogeny.

Wielodołkowy test na bazie płynu do badań przesiewowych nokautów C. elegans

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Tutaj opisujemy protokół, który jest elastycznym, wszechstronnym narzędziem przesiewowym o wysokiej zawartości, które może być wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen i może być wykorzystane do odkrywania leków.

Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Poznaj protokół wysokoprzepustowego RT-qPCR w C. elegans bez izolacji RNA przy użyciu technologii nanofluidycznej. Metoda umożliwia uzyskanie ponad 9000 wyników w dwa dni.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Przeglądaj więcej filmów