Przewidywanie amputacji przy użyciu miejscowo krążących jednojądrzastych komórek progenitorowych u pacjentów leczonych angioplastyką z krytycznym niedokrwieniem kończyn

Chociaż angioplastyka poprawia przepływ krwi w krytycznym niedokrwieniu kończyny, niektórzy pacjenci nadal będą dążyć do amputacji kończyny. W porównaniu z rokowaniem opartym na tradycyjnych czynnikach ryzyka i wewnętrznych cechach naczyniowych, liczba lokalnych MPC może być bardziej predykcyjna dla wyniku klinicznego, dotyczącego dysfunkcji śródbłonka i amputacji kończyny. Liczba lokalnych MPC stanowi obiecujący wskaźnik rokowania w przypadku zdarzeń naczyniowych, takich jak choroba niedokrwienna serca i niedokrwienie kończyn dolnych, z potencjalnym zastosowaniem w stratyfikacji ryzyka i egzekwowaniu profilaktyki.

Procedury zademonstrują Eduardo Vera-Gomez, Alejandro Hernandez-Patricio, Carolina Aranda-Rodriguez, Juan Ariel Gutierrez-Buendia, Atzin Sua Ruiz-Hernandez, Mario Antonio Tellez-Gonzalez i Gabrielle Alexandra Dominguez-Perez. Doktorami z laboratoriów eksperymentalnego metabolizmu i regeneracji tkanek będą również Gabrielle Hernandez-De Rubin i Oscar Antonio Loman-Zuniga. I te z oddziału chirurgii naczyniowej.

Aby określić FMD przed i po angioplastyce, użyj naczyniowego przetwornika liniowego do pomiaru średnicy tętnicy ramiennej pacjenta. Następnie umieść mankiet ciśnieniomierza nad miejscem pomiaru na przedramieniu i wdmuchnij mankiet o 50 milimetrów słupa rtęci powyżej skurczowego ciśnienia krwi na pięć minut przed opróżnieniem. W ciągu 60 sekund od opróżnienia ponownie zmierz średnicę tętnicy ramiennej i użyj równania do oszacowania FMD.

Aby ocenić kliniczne nasilenie niedokrwienia kończyn, zgodnie z klasyfikacją Rutherforda, należy umieścić igłę o rozmiarze 18 w naczyniu krwionośnym w wybranym miejscu pachwiny i umieścić wprowadzacz nad igłą. Wsuń elastyczną prowadnicę do wprowadzającego i zastąp prowadnicę sześcioma francuskimi prowadnicami. Korzystając ze wskazówek fluoroskopowych, wstrzyknij środek kontrastowy, aby zidentyfikować trajektorię tętnicy i zablokowane miejsca naczyniowe.

Wprowadzić do statku dwie francuskie prowadnice nawigacyjne 0,014 i dwie francuskie prowadnice pomocnicze 0,014 i przesunąć przewody doprowadzające do zablokowanego miejsca. Następnie wprowadź jeden cewnik z pięcioma francuskimi, a następnie jeden z trzech cewników francuskich i pobierz 10 mililitrów krwi z miejsca najbliższego niedrożności naczyniowej. Umieść próbkę na lodzie i ponownie przesuń prowadnik.

Gdy prowadnik jest na swoim miejscu, wprowadź cewnik balonowy do angioplastyki, zawierający nadmuchiwany balon umieszczony na końcu cewnika i przesuń cewnik balonowy do angioplastyki do miejsca zmiany. Napompuj balon na blokującej blaszce miażdżycowej, znajdującej się na ścianie naczynia krwionośnego i sprawdź, czy przepływ krwi został przywrócony. 30 minut po wykonaniu angioplastyki należy przesunąć cewnik do miejsca najbliższego blokowi naczyniowemu i pobrać 10 mililitrów krwi.

Następnie usuń wszystkie prowadniki i zapewnij odpowiednią opiekę pooperacyjną. Dwa tygodnie po angioplastyce oceń kliniczne nasilenie niedokrwienia kończyny, ustąpienie bólu spoczynkowego, dolnego niedokrwienia i funkcjonalne zachowanie stopy, zgodnie z klasyfikacją Rutherforda, i zidentyfikuj przypadki wymagające dużej amputacji z powodu niekorzystnego wyniku. W ciągu godziny od pobrania przenieś sześć mililitrów każdej pobranej próbki krwi do nowych 15-mililitrowych probówek i rozcieńcz próbki w stosunku jeden do jednego w PBS.

Dodać dwa mililitry pożywki o gradiencie gęstości do każdej z trzech probówek i dodać trzy równe objętościowo podwielokrotności rozcieńczonej krwi do każdej probówki, aby nie były wypełnione nie więcej niż w trzech czwartych. Oddziel komórki krwi przez wirowanie w gradiacji gęstości i użyj pipety, aby zebrać komórki na granicy faz powstałych warstw. Przeciągnij komórki z każdej próbki do jednej 15-mililitrowej probówki i umyj każdą próbkę sześć razy, po dwa mililitry PBS na pranie.

Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić MPC zawierające granulki w jednym mililitrze PBS na próbkę do policzenia i dodać jeden razy 10 do sześciu komórek na probówkę do odpowiedniej liczby pięciu mililitrowych probówek cytometrii przepływowej na próbkę. Osadzać komórki przez wirowanie i ponownie zawiesić każdą próbkę komórek w 100 mikrolitrach interesującego koktajlu przeciwciał na 10 sekund, przed inkubacją komórek przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji użyj przeciwciał kontrolnych dopasowanych do izotypu, aby ustawić odpowiednie bramki rozproszenia przedniego i bocznego do analizy, a następnie użyj probówki zawierającej dużą liczbę komórek CD45 i CD34 dodatnich do zabramowania NPC.

Aby wybrać podwójnie dodatnie fenotypy immunologiczne, utwórz nowe wykresy i zidentyfikuj KDR, komórki CD133 i CD184 dodatnie, CD34-dodatnie, CD45-dodatnie, a następnie bramkę, aby zidentyfikować główne subpopulacje MPC. Liczba MPC może być następnie skorelowana z wyjściową wartością FMD i deltą FMD po angioplastyce oraz odsetkiem pacjentów wymagających dużej amputacji kończyny dolnej. W tej reprezentatywnej analizie, 30 dni po angioplastyce kończyn dolnych, wyjściowa liczba CD45 dodatnich, CD34-dodatnich, KDR dodatnich MPC korelowała z FMD.

Natomiast zmiana CD45 dodatnich, CD34-dodatnich, CD133-dodatnich, CD184-dodatnich MPC po angioplastyce istotnie korelowała z poprawą FMD. Zwiększoną wyjściową liczbę MPC CD45 dodatnich, CD34 dodatnich, KDR dodatnich, a także zmniejszenie po angioplastyce w komórkach MPC CD45 dodatnich, CD34 dodatnich, CD133 dodatnich, CD184 dodatnich zaobserwowano również u pacjentów, którzy ewoluowali do amputacji kończyny, Podczas dostępu naczyniowego należy pobrać krew z miejsca najbliższego niedrożności naczyniowej.