Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

Krystalografia neutronowa to strukturalna technika określania pozycji atomów wodoru w makrocząsteczkach biologicznych. Struktury neutronowe ujawniają stany protonacji i orientacje cząsteczek wody, aby wyjaśnić mechanizmy reakcji i interakcje wiązania. W przeciwieństwie do dyfrakcji rentgenowskiej, dyfrakcja neutronów ma tę zaletę, że jest techniką nieniszczącą.

Białka z grupami światłoczułymi lub metalosensorami mogą być badane bez cierpienia z powodu uszkodzeń popromiennych. Aby przeprowadzić krystalografię białek neutronowych, duże, kruche kryształy białek są montowane w kapilarnach kwarcowych w celu zbierania danych o temperaturze pokojowej. Montaż kapilarny kryształów nie jest rutynowo wykonywany, co sprawia, że demonstracja tej techniki jest pouczająca.

W celu zebrania kryształów otwórz szczelnie zamknięte pudełko kanapkowe zawierające kryształy białka w dziewięciodołkowej płytce ze szkła silikonowanego o dużej objętości i za pomocą mikropipety przenieś od 10 do 20 mikrolitrów z roztworu zbiornika krystalizacyjnego na szkiełko podstawowe. Oceń kryształy pod mikroskopem. Użyj mikropętli o odpowiedniej wielkości, aby zebrać kryształ i umieść kryształ w kropli roztworu rezerwuarowego.

Do montażu kryształów weź kapilę kwarcową o średnicy dwóch milimetrów i długości 50 milimetrów, zassaj bufor zbiornika pipetą i napełnij jeden koniec kapilary buforem zbiornika. Użyj pętli montażowej, aby delikatnie umieścić kryształ w buforze zbiornika w kapilarze kwarcowej. Postukaj w probówkę, aby przesunąć bufor zbiornika i kryształ w dół kapilary, a następnie użyj długiej, cienkiej pipety, aby zassać roztwór z okolic kryształu.

Użyj cienkiego papierowego, aby ostrożnie wysuszyć kryształ i osuszyć ścianki kapilary, a następnie dodaj 20 do 50 mikrolitrów deuterowanego roztworu buforowego na koniec kapilary. Użyj różdżki grzewczej, aby stopić porcję wosku pszczelego i delikatnie włóż kapilar do stopionego wosku pszczelego, aż utworzy się hermetyczne uszczelnienie. Zastąp zdeuterowany bufor świeżym deuterowanym buforem o pojemności od 20 do 50 mikrolitrów w drugim, szóstym i 10 dniu po zamontowaniu kryształu i ponownie uszczelnij kapilarę świeżym stopionym woskiem pszczelim po każdej wymianie pary, jak pokazano.

Po co najmniej dwutygodniowej wymianie pary użyj szpachli, aby przymocować kapilę kwarcową do kija z próbką goniometru dyfraktometru neutronowego IMAGINE, który został przymocowany do stolika próbki instrumentu, a następnie opuść próbkę i przyklej ją do wiązki neutronów i obszaru detektora. Otwórz program do akwizycji danych na komputerze sterującym Beamline i kliknij zakładkę setup, aby ustawić strategię zbierania danych i wprowadzić parametry eksperymentu, w tym nazwę instrumentu i nazwę obrazów, które mają być zbierane. Kliknij kartę zbierania i wprowadź parametry zbierania danych, w tym czas ekspozycji i liczbę klatek do zebrania.

W graficznym interfejsie użytkownika optyki kliknij 2.78 dla minimum lambda i 4.5 dla maksimum lambda, aby ustawić quasi-zakres zbierania danych. Kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie, aby rozpocząć zbieranie danych. Po zebraniu danych neutronowych zbierz odpowiedni zestaw danych rentgenowskich na tym samym krysztale w tej samej temperaturze.

Przed zebraniem danych kriogenicznych wyjmij roztwór zbiornika z pudełka na kanapki i napełnij pudełko na kanapki deuterowanym roztworem buforowym zbiornika, pozostaw do zrównoważenia przez tydzień i powtórz trzy razy. Po trzech kolejnych rundach wymiany roztworu w zbiorniku, zbierz kryształ za pomocą mikropętli i zanurz kryształ w roztworze krioprotektantu na dwie godziny przed zamontowaniem kryształu w mikropętli przymocowanej do mocowania kriokryształu. Zanurz zamontowany kryształ i mocowanie kriogeniczne w ciekłym azocie.

Gdy kryształ jest zamrożony, zamontuj kryształ na stoliku na próbkę dyfraktometru neutronów wielkocząsteczkowych wyposażonym w strumień kriogeniczny. Sprawdź, czy kryształ jest zamontowany i wyśrodkowany w celu zbierania danych, uzupełnij informacje o propozycji i kliknij ikonę folderu, aby załadować tabelę strategii zbierania danych, a następnie kliknij przycisk Prześlij, aby rozpocząć zbieranie danych. Dyfrakowane neutrony staną się widoczne w czasie rzeczywistym, gdy zostaną wykryte przez detektory czasu przelotu MaNDi.

Aby udoskonalić połączone dane rentgenowskie i neutronowe, najpierw otwórz CCP4 i wybierz opcję konwertuj, aby zmodyfikować program rozszerzeń MTZ, aby dopasować flagi danych wolnych od R danych neutronowych do tych z danych rentgenowskich. Zaimportuj plik odbicia danych neutronowych w formacie MTZ. Wybierz opcję importuj wolne dane R z innego pliku MTZ i zaimportuj plik MTZ rentgenowski.

Nazwij nowy dopasowany plik MTZ i kliknij przycisk Uruchom. Następnie otwórz pakiet oprogramowania Phoenix i w obszarze udoskonalenia kliknij gotowy zestaw. Prześlij plik współrzędnych białka, wybierz, aby dodać wodór do modelu, jeśli go nie ma, i wybierz HD w miejscach wymiennych, H w innym miejscu z menu rozwijanego.

Wybierz dodaj deuter do cząsteczek rozpuszczalnika i kliknij uruchom, aby rozpocząć. Aby zagęścić strukturę, na karcie zagęszczenia otwórz feniksa. Refine program, aby skonfigurować udoskonalanie przy użyciu zarówno danych rentgenowskich, jak i neutronowych.

W zakładce konfiguracji wprowadź plik PDB z rozwiązanej struktury rentgenowskiej. Prześlij plik MTZ z danymi neutronowymi. Przypisz dane pliku MTZ jako dane neutronowe w neutronach R free.

Prześlij plik MTZ z danych rentgenowskich i przypisz go jako dane rentgenowskie i rentgenowskie R za darmo. W obszarze Ustawienia zagęszczenia upewnij się, że wybrano standardową strategię zagęszczania, i zwiększ liczbę cykli do pięciu. Wybierz wszystkie parametry, zaawansowane i wodory.

Zmień model rafinacji wodoru na indywidualny i wyłącz siłę napędzającą ADP, a następnie wyszukaj jądrowy. Wybierz opcję Użyj odległości jądrowych od X-HD. Kliknij przycisk Uruchom, aby zainicjować uściślenie.

Aby zbudować model w Phoenix, kliknij otwórz w Coot. W Coot wizualizuj mapy gęstości gęstości elektronów promieniowania rentgenowskiego i długości rozpraszania neutronów. Wybierz menedżera wyświetlania i usuń mapę gęstości długości rozpraszania neutronów 2FOFC.

Wybierz otwórz MTZ i wybierz otwórz MTZ i otwórz plik mtz danych neutronowych. Zarówno dla opcji amplitud, jak i faz wybierz no_fill_neutron dane z menu rozwijanych, aby otworzyć niewypełnione mapy gęstości długości rozpraszania neutronów. Przeprowadzić oględziny pozostałości, aby określić, czy model pasuje do danych, i przeanalizować piki mapy gęstości różnicowej w miejscach wymiennych wodór-deuter w celu określenia prawidłowej orientacji i zajętości.

Zmień orientację cząsteczek wody zgodnie z mapami neutronów SLD i oddziaływaniami wiązań wodorowych. Dostosuj stan protonacji i orientację miejsc wymiennych reszty białkowodowo-deuterowej zgodnie z mapami neutronów SLD. Wykonuj kolejne rundy interaktywnego budowania i udoskonalania modelu, aby uzyskać kompletną strukturę.

Uwodornione kryształy białka wyhodowane w buforze na bazie wody mają wymiary około 1 000 na 900 mikronów. Kryształy można montować w kapilarach kwarcowych w celu wymiany pary z buforem na bazie tlenku deuteru przez trzy tygodnie przed zebraniem danych dyfrakcji neutronów. Dane dyfrakcji neutronów zbierano przez kilka dni z rozdzielczością 2,30 angstrema, a na tym samym krysztale zebrano zestaw danych dyfrakcji rentgenowskiej.

Piki w mapach gęstości długości rozpraszania neutronów FO minus FC dostarczają cennych informacji na temat orientacji reszt, takich jak paragina, i dodatnich pików w FO minus FC mapy gęstości rozpraszania neutronów są również bardzo pouczające w określaniu stanów protonowania reszt z grupami miareczkowymi, takimi jak histydyna. Nakładki map gęstości rozpraszania elektronów i neutronów dla cząsteczek wody wskazują, że podczas gdy interakcje wiązań wodorowych można wywnioskować z danych rentgenowskich, neutrony dostarczają jasnych informacji o położeniu tych wiązań wodorowych. Mapy gęstości rozpraszania neutronów można wykorzystać do określenia orientacji grup funkcyjnych łańcucha bocznego wodoru i deuteru.

Mapy gęstości długości rozpraszania neutronów, w których niewymienne atomy wodoru są związane z węglem, wydają się niekompletne w porównaniu z ich odpowiednikami na mapach gęstości elektronów ze względu na anulowanie gęstości. W związku z tym zaleca się wspólne udoskonalanie próbki za pomocą zarówno danych rentgenowskich, jak i neutronowych, w których dane rentgenowskie mogą być wykorzystane do określenia położenia szkieletu białkowego. Krystalografia białek neutronowych wymaga dużych kryształów.

Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z kryształami i montażu, aby uniknąć uszkodzenia kryształów, które mogą łatwo pęknąć, pogarszając jakość danych. Krystalografia białek neutronowych zapewnia wgląd w mechanizm reakcji białek, potencjalnie ujawniając katalityczne reszty lub cząsteczki wody, których rolę można dalej badać za pomocą kinetyki, mutagenezy lub spektroskopii.