Name: Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj technikę krystalografii neutronowej do lokalizacji atomów wodoru w białkach. Metoda ta ujawnia stany protonowania i orientację cząsteczek wody, dostarczając kluczowych informacji o mechanizmach reakcji enzymatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eksperymenty z ekspresją, oczyszczaniem i krystalizacją białek przeprowadzono w Centrum Strukturalnej Biologii Molekularnej (CSMB), Instytucie Badań Biologicznych i Środowiskowych Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych w Oak Ridge National Laboratory. Dane dyfrakcji neutronów zostały zebrane w BL-11B MaNDi w Spallation Neutron Source (SNS) w ORNL, które jest sponsorowane przez Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Autorzy dziękują Brendanowi Sullivanowi za pomoc w redukcji danych. Dane dyfrakcji rentgenowskiej zostały zebrane w obiektach Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center (METRIC) na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej, które jest wspierane przez stan Karolina Północna. GCS dziękuje za wsparcie częściowo ze strony Narodowej Fundacji Badawczej (NRF), Republiki Południowej Afryki i programu Graduate Opportunities (GO!) w ORNL. FM potwierdza wsparcie ze strony USDA NIFA Hatch 211001.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krystalografia białek neutronowych jest bardzo czułą techniką badania stanów protonacji i orientacji cząsteczek wody w białkach. Informacje te rzucają światło na mechanizmy katalityczne białek, ponieważ zmiany w oddziaływaniach protonowania i wiązań wodorowych są często kluczowe dla chemii enzymów10. Krystalografia białek neutronowych, choć jest techniką informacyjną, obejmuje szereg czynników, które należy wziąć pod uwagę przed planowaniem przeprowadzenia eksperymentu dyfrakcji neutronów, a mianowicie:
<ol>
	<li>Wymóg dużych kryształów białkowych do zbierania danych.</li>
	<li>Właściwości rozpraszania wodoru i innych pierwiastków, takich jak jony metali.</li>
	<li>Ograniczenia w oprogramowaniu do udoskonalania konstrukcji i budowania modeli podczas pracy z próbkami deuterowanymi.</li>
</ol>
Krystalografia białek neutronowych jest techniką o ograniczonym strumieniu. W przeciwieństwie do zestawów danych dyfrakcji rentgenowskiej, w przypadku zestawów danych neutronów oczekuje się wyższych współczynników R i niższej kompletności, redundancji i stosunku sygnału do szumu ze względu na nieodłączne ograniczenia techniki (ograniczony strumień, quasi-Laue, dłuższe fale). Zbieranie danych z pojedynczej klatki trwa zwykle od 12 do 18 godzin. Powodzenie eksperymentu w dużym stopniu zależy od wielkości i jakości próbki, przy czym kryształy o wielkości 0,1 mm3 często stanowią minimalny wymóg3. Dyfrakcja neutronów wymaga produkcji dużych ilości białka w celu wytworzenia kropli krystalizacji w zakresie od 10 do 800 μl. Minimalną objętość do wyhodowania wystarczająco dużych kryształów można oszacować za pomocą kalkulatora objętości, biorąc pod uwagę parametry kryształu i próbki (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Wzrost dużych kryształów najczęściej odbywa się przez dyfuzję pary3. Krystalizacja w wiszących kroplach pozwala na wzrost kryształów w dużych kroplach o pojemności od 10 do 25 μL, podczas gdy większe krople do ~ 50 μL można ustawić za pomocą dostępnego na rynku sprzętu do upuszczania w pozycji siedzącej14,54. Silikonowane dziewięciodołkowe płytki szklane mogą być używane do ustawiania bardzo dużych kropli, o objętości do 800 μl. Te szklane talerze są umieszczane w "pudełkach kanapkowych" dostępnych na rynku w Hampton Research. Dalsze techniki krystalizacji obejmują krystalizację okresową, w której granica wielkości kropli jest podyktowana przez naczynie. Konfiguracja eksperymentu z krystalizacją wsadową może wynosić od mikrolitrów domililitrów 55. Krystalizację można również przeprowadzić przy użyciu techniki dializy, w której białko jest równoważone z osadem za pomocą membrany dializacyjnej lub przez przeciwdyfuzję wzdłuż gradientu stężenia strącającego lub przez porowaty czopek, taki jak agaroza56,57. Wysiew to kolejna alternatywa dla uzyskania kryształów o pożądanej objętości. Mikro- i makrowysiewy są z powodzeniem stosowane do wzrostu dużych kryształów, w tym dużych kryształów NcLPMO9D45. Pewna wiedza na temat diagramu faz białek, w tym wpływu temperatury na rozpuszczalność, pomaga w dużym wzroście kryształów.
Planując eksperyment dyfrakcji neutronów, niezbędna jest optymalizacja preparatu białka w celu maksymalizacji stosunku sygnału do szumu podczas zbierania danych dyfrakcyjnych7. Aby obejść anulowanie gęstości i wysokie niekoherentne rozpraszanie powodowane przez atomy H, mapy neutronowego SLD można ulepszyć, wymieniając atomy H na jego izotop D, który ma dodatnią koherentną długość rozpraszania i niską niekoherentną długość rozpraszania. Aby to osiągnąć, przeprowadza się wymianę parową uwodornionego kryształu białka na zdeuterowany bufor krystalizacyjny. Zapewnia to wymianę H/D cząsteczek rozpuszczalnika i labilnych, dających się miareczkować atomów Hbiałka 23. Wymiana parowa odbywa się poprzez zamontowanie uwodornionego kryształu w kapilarze kwarcowej z deuterowanymi "korkami" buforowymi krystalizacji na bazie D2O i stanowi skuteczną, delikatną technikę, która jest najczęściej stosowana 14,23,35. Wymiana może trwać kilka tygodni i najlepiej wymagać częstej wymiany zdeuterowanego bufora, aby zapewnić maksymalną wymianę H/D. Wymiana H/D może być również przeprowadzona poprzez bezpośrednie zanurzenie kryształu w deuterowanym buforze. Aby uniknąć narażenia kryształu na naprężenia spowodowane ekspozycją na D2O, proces namaczania należy przeprowadzać stopniowo, stopniowo zwiększając stosunek D2O: H2O58. Oprócz tego krystalizację uwodornionego białka można również przeprowadzić w deuterowanym buforze do wymiany H/D w labilnych miejscach H22,59. Należy jednak zauważyć, że bufor na bazie D2O ma wpływ na rozpuszczalność białek, co wymaga dalszego dostosowania znanych warunków na bazieH2O 3,59. Zaobserwowano również, że na bazieD 2O prowadzą w niektórych przypadkach do mniejszych kryształów59. Pełną wymianę miareczkowalnych i związanych z węglem atomów H na D można osiągnąć poprzez ekspresję białek w pożywkach deuterowanych w celu wytworzenia perdeuterowanej próbki20. Otrzymane mapy SLD neutronów w perdeuterowanej próbce zostaną znacznie ulepszone, nie wyświetlając już zniesienia gęstości odpowiednika próbki uwodornionej. Jest to korzystne przy charakteryzowaniu H/D związanych w miejscach niewymiennych w białku lub kofaktorze. Jednak ekspresja białka perdeuterowanego jest zarówno kosztowna, jak i niska pod względem wydajności60. Centrum Strukturalnej Biologii Molekularnej (CSMB) Oak Ridge National Laboratory (ORNL) oferuje urządzenie do deuteracji dla użytkowników chcących wygenerować perdeuterowaną próbkę (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Ekspresja perdeuterowana jest zwykle przeprowadzana w bioreaktorze w skali 1 l, co daje ~ 50 mg oczyszczonego białka61.
Po zebraniu danych dyfrakcji neutronów przeprowadzane jest udoskonalanie i interaktywne budowanie modelu. Udoskonalanie można uruchomić przy użyciu wielu pakietów oprogramowania, w tym phenix.refine, nCNS lub SHELXL 28,31,32,33. Pakiet Phenix jest najczęściej używanym oprogramowaniem do udoskonalania danych dyfrakcji neutronów w połączeniu z Coot, który jest używany do ręcznego budowania modelu na podstawie map neutronów SLD34. Chociaż zarówno Phenix, jak i Coot pozwalają na przetwarzanie danych dyfrakcji neutronów, mogą brakować im pewnych funkcji niezbędnych do przetwarzania idiosynkrazji związanych z danymi neutronowymi i próbkami deuterowanymi. Na przykład Coot nie zawiera optymalizacji geometrii dla pozostałości deuterowanych, co może prowadzić do komplikacji podczas budowania modelu, ponieważ funkcja "Real Space Refine" powoduje "eksplodowanie" pozostałości (Rysunek uzupełniający 26)62. Problem ten można rozwiązać, generując pliki utwierdzeń dla wszystkich pozostałości deuterowanych. Jest to jednak intensywny proces i takie biblioteki nie są obecnie publicznie dostępne. Podczas wprowadzania ulepszeń w Phenix, wymienne miejsca H/D zostaną początkowo ustawione na 0,50 obłożenia dla H i D. W miarę dokonywania udoskonaleń, zajętość H i D będzie udoskonalana zgodnie z mapami neutronów SLD. Podczas interaktywnego budowania modeli, mapy gęstości różnicowej Fo-F c są bardzo pouczające w ocenie zajętości H/D. Mapy mogą być wykorzystane do określenia, które miejsca mają wysokie zapylenie D, co jest szczególnie pouczające w miejscu aktywnym, w którym stany protonacji są katalityczne63. Niejednoznaczne sytuacje pojawiają się jednak, gdy zajętość H:D jest bliska 0,70:0,30, co skutkuje całkowitym anulowaniem sygnału na mapach neutronowych SLD64. Należy również wziąć pod uwagę, że zbiory danych neutronowych quasi-Laue często mają kompletność około 80%, czyli niższą niż rutynowo obserwowana ≥ 98% dla danych dyfrakcji rentgenowskiej. Podczas rafinacji danych dyfrakcji neutronów w Phenix, brakujące obserwowane amplitudy (Fo) są zatem obliczane na podstawie modelu, aby uzupełnić listę odbić, wprowadzając w ten sposób odchylenie modelu. Aby uwzględnić to potencjalne odchylenie, mapy "no_fill" powinny być sprawdzane podczas budowania modeli interaktywnych, a nie mapy "wypełnione".
Użytkownicy mogą zdecydować się na wspólne udoskonalanie danych rentgenowskich i neutronowych swojej struktury lub udoskonalanie tylko danych neutronowych. Wizualizacja map SLD neutronów, szczególnie w niższej rozdzielczości, może początkowo być niepokojąca, szczególnie w przypadku uwodornionego białka, w którym H jest nadal obecne w miejscach niewymiennych pomimo wymiany parowej H/D. Powoduje to anulowanie map gęstości neutronów, co sprawia wrażenie map nieciągłych65,66. Zebranie odpowiedniego zestawu danych rentgenowskich korzystnie uzupełnia te anulowania we wspólnym udoskonaleniu (Rysunek 13A i Rysunek 13B). Strategia udoskonalania stawów zazwyczaj polega na udoskonalaniu współrzędnych szkieletu białka w stosunku do danych rentgenowskich, podczas gdy dane dyfrakcji neutronów są wykorzystywane do doprecyzowania położenia i zajętości atomów H/D w miejscach wymiennych28. Ponieważ wprowadzenie wspólnego obłożenia H/D w wymiennych lokalizacjach zwiększa liczbę dopracowywanych parametrów, wspólne udoskonalenie za pomocą danych rentgenowskich zwiększa również stosunek danych do parametrów. Wspólne udoskonalanie wymaga zebrania odpowiedniego zestawu danych rentgenowskich w tej samej temperaturze na tym samym krysztale lub krysztale wyhodowanym w tych samych warunkach. W przypadku danych dyfrakcji neutronów zbieranych w temperaturze pokojowej (300 K), odpowiedni zestaw danych dotyczących promieniowania rentgenowskiego powinien być zbierany w temperaturze pokojowej przy użyciu strategii zbierania danych o niskich dawkach w celu ograniczenia uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Z kolei próbki perdeuterowane zapewniają ulepszone i ciągłe mapy SLD neutronów, ponieważ nie mają tej samej wielkości anulowania sygnału H/D. Jednak długość rozpraszania neutronów niektórych pierwiastków, w tym metali i siarki, sprawia, że są one słabo widoczne na mapach neutronów SLD, nawet jeśli białko zostało perdeuterowane (Rysunek 13C-F)18. Jeśli metal musi zostać scharakteryzowany, najlepiej jest wykorzystać dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego w wspólnym udoskonalaniu lub zastosować techniki spektroskopowe w celu uzupełnienia eksperymentów dyfrakcyjnych. Udoskonalanie danych tylko na neutronach jest często wykonywane, gdy zestaw danych neutronów ma wysoką rozdzielczość lub jeśli użyto białka perdeuterowanego. Ponadto, udoskonalanie danych tylko na neutronach jest szczególnie przydatne, jeśli badane jest białko bardzo wrażliwe na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, ponieważ struktura pochodząca z promieniowania rentgenowskiego może zawierać artefakty wywołane promieniowaniem. Jeżeli ma być przeprowadzone udoskonalanie wyłącznie danych neutronowych, należy upewnić się, czy odpowiedni zestaw danych neutronowych jest wystarczająco kompletny i rozdzielczy.
ORNL oferuje dwa urządzenia do zbierania danych dyfrakcji neutronów: linię badawczą IMAGINE w HFIR oraz linię MaNDi w SNS36,67. Chociaż oba instrumenty zapewniają skuteczne metody zbierania danych dyfrakcji neutronów przy użyciu podobnych zasad, każdy instrument ma unikalne specyfikacje, które należy wziąć pod uwagę przy ubieganiu się o czas wiązki. IMAGINE zbiera dane quasi-Laue i jest zoptymalizowany pod kątem zbierania danych o temperaturze pokojowej na kryształach z komórkami elementarnymi do ~100 A. MaNDi może być używany do zbierania danych o temperaturze pokojowej i kriotemperaturze za pomocą zbierania TOF-Laue na kryształach z komórkami elementarnymi do ~ 300 A. Przed zebraniem pełnego zestawu danych na krysztale przeprowadza się test w celu oceny jakości uzyskanego wzoru dyfrakcyjnego, w którym kryształ jest wystawiony na działanie wiązki neutronów dla pojedynczej klatki. Jeśli kryształ jest odpowiedniej jakości, pełny zestaw danych dyfrakcji neutronów zostanie zebrany, zindeksowany, zintegrowany, przeskalowany i połączony w procesie analogicznym do przetwarzania danych rentgenowskich. IMAGINE wykorzystuje Lauegen i Lscale, a MaNDi wykorzystuje pakiet Mantid i wykorzystuje trójwymiarowe dopasowanie profili 48,50,51,68,69,70. Naukowcy, którzy staną się użytkownikami którejkolwiek z tych placówek, otrzymają zestaw danych w formacie MTZ lub HKL do dalszej analizy.
Dyfrakcja neutronów jest nieniszczącą, bardzo czułą techniką badania stanu protonowania i oddziaływań wiązań wodorowych makrocząsteczek biologicznych. Jest szczególnie przydatny w przypadku białek światłoczułych i metaloprotein. Przed przeprowadzeniem eksperymentu należy wziąć pod uwagę kilka kwestii dotyczących techniki, a także przetwarzania danych, jednak wynik daje wyniki, które mogą dać cenny wgląd w mechanizm katalityczny białka będącego przedmiotem zainteresowania. Krystalografia białek neutronowych uzupełnia badania obliczeniowe, strukturalne, biochemiczne i spektroskopowe, co czyni ją cennym narzędziem w zestawie technik stosowanych przez biologów do charakteryzowania makrocząsteczek biologicznych.

Krystalografia makromolekularna neutronów to technika, która daje unikalne okno na strukturę i chemię leżącą u podstaw białek. Koncepcyjnie podobna do dyfrakcji rentgenowskiej, dyfrakcja neutronów dostarcza atomistycznych szczegółów struktury makromolekularnej, jednak oddziaływanie neutronów z jądrami umożliwia lokalizację lekkich atomów, często trudną do wykrycia za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej1. Podczas dyfrakcji rentgenowskiej promienie rentgenowskie rozpraszają się od chmury elektronów, co sprawia, że lekkie atomy, takie jak wodór (H), są słabo widoczne na mapach gęstości elektronów, które nie mają rozdzielczości bliskiej poniżej Ångströma2. Natomiast intensywność rozpraszania neutronów zależy od złożonych oddziaływań z jądrem, przy czym izotopy tego samego pierwiastka wykazują różne długości rozpraszania. Dlatego lekkie atomy i ich izotopy, takie jak wodór (1H) i deuter (2H lub D), mają porównywalną widoczność do szkieletu atomów węgla, azotu i tlenu na mapach gęstości rozpraszania neutronów (SLD). Ponadto, ponieważ wielkość rozpraszania neutronów jest niezależna od liczby elektronów, rozpraszanie od lekkich pierwiastków nie jest przesłonięte przez ciężkie pierwiastki, gdy znajdują się one w bliskiej odległości od siebie, jak to obserwuje się w rozpraszaniu promieniowania rentgenowskiego. Zwiększona widoczność H i jego izotopu D przy zastosowaniu dyfrakcji neutronów dostarcza cennych informacji o stanie protonacji katalitycznie ważnych reszt, kofaktorów i ligandów oraz pomaga w orientacji cząsteczek wody, ujawniając ważne informacje o mechanizmach katalitycznych i chemii białek3. Dyfrakcja neutronowa ma również tę zaletę, że jest techniką nieniszczącą, szczególnie przydatną do próbek biologicznych wrażliwych na jonizację, takich jak białka z centrami metalowymi lub światłoczułymi kofaktorami redoks2. Głównym celem tego artykułu jest przedstawienie przeglądu procesu przepływu pracy w celu uzyskania wysokiej jakości struktury krystalicznej białka neutronowego. Odsyłamy zainteresowanego czytelnika do Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 oraz O'Dell et al.3 w celu uzyskania doskonałego przeglądu dyfrakcji białek neutronowych oraz Ashkar et al.7 do dalszych zastosowań rozpraszania neutronów.
Neutrony są głównie generowane podczas reakcji jądrowych wykorzystujących jeden z dwóch procesów: rozszczepienie jądra atomowego w źródłach reaktora lub spalację w źródłach opartych na akceleratorze8. Źródła reaktorowe wytwarzają ciągłą wiązkę neutronów, wykorzystując rozszczepienie jądrowe izotopu 235U, podczas gdy źródła neutronów spalacyjnych wytwarzają pulsacyjną wiązkę neutronów, bombardując cel, na przykład ciekły metal, taki jak rtęć, protonami9. W Oak Ridge National Laboratory (ORNL) w Oak Ridge w stanie Tennessee znajduje się zarówno źródło neutronów w stanie ustalonym w reaktorze izotopowym o wysokim strumieniu (HFIR), jak i źródło impulsowe o częstotliwości 60 Hz w spulacyjnym źródle neutronów (SNS). Linia badawcza IMAGINE, znajdująca się w HFIR, to dyfraktometr neutronowy zoptymalizowany pod kątem makrocząsteczek biologicznych (rysunek uzupełniający 1)10. IMAGINE wykorzystuje detektor neutronowych płytek obrazowych do pomiaru danych quasi-Laue przy użyciu wąskiego pasma przepustowego w zakresie 2,8 – 4,5 A od monokryształów o krawędziach komórek elementarnych <150 A. Makromolekularny dyfraktometr neutronów (MaNDi), znajdujący się w SNS, jest dyfraktometrem neutronów Laue z funkcją czasu przelotu (TOF) wyposażonym w ramkę z matrycą detektora sferycznego (DAF) (rysunek uzupełniający 2)11. MaNDi mierzy dane z monokryształów z krawędziami komórek elementarnych w zakresie 10 – 300 A, wykorzystując przestrajalne pasmo o długości fali 2 A w zakresie 2,0 – 6,0 Å12.
Proces generowania neutronów jest bardzo energochłonny, co skutkuje stosunkowo słabymi strumieniami wiązki neutronów w porównaniu ze strumieniami wiązki promieniowania rentgenowskiego w źródłach synchrotronowych13. Aby zapewnić wystarczający stosunek sygnału do szumu podczas zbierania danych, konieczne jest wyhodowanie kryształów o odpowiedniej wielkości i jakości14. Zazwyczaj kryształy o objętościach > 0,1 mm3 są potrzebne do zbierania danych z odpowiednimi statystykami15. Oprócz niższych strumieni należy wziąć pod uwagę nieodłączne właściwości oddziaływania między neutronami a jądrami próbki16. Długość rozpraszania neutronów różni się w zależności od izotopów tego samego pierwiastka, właściwość, która może być korzystnie wykorzystana w rozpraszaniu neutronów pod małym kątem (SANS) do maskowania lub podświetlania obszarów próbki – proces znany jako dopasowanie kontrastu17. W eksperymentach dyfrakcyjnych ujemna koherentna długość rozpraszania neutronów wynosząca H (-3,741 fm dla 1H) może prowadzić do zniesienia cech mapy gęstości rozpraszania neutronów od czasu spójnych długości rozpraszania neutronów innych biologicznie istotnych atomów, w tym węgla (6,6511 fm dla 12C), azotu (9,37 fm dla 14N), tlenu (5,803 fm dla 16O), fosfor (5,13 fm dla 31P) i siarka (2,804 fm dla 32S) są dodatnie (Tabela 1)12,14. Co więcej, duża niekoherentna długość rozpraszania H (25,274 fm) zwiększa tło podczas zbierania danych, pogarszając jakość zestawu danych i pogarszając rozdzielczość danych7. Aby obejść te ograniczenia wprowadzone przez H, konieczne jest, dla dyfrakcji neutronów, zamiana H na jego izotop deuteru, 2H(D), który ma dodatnią długość rozpraszania neutronów koherentnych (6,671 fm) i znacznie niższą długość rozpraszania niekoherentnego (4,04 fm)19. Można to osiągnąć poprzez perdeuterację, proces, w którym białko ulega ekspresji przez organizmy hodowane w całkowicie deuterowanych pożywkach, zapewniając całkowite włączenie D w miejscach H20. Możliwa jest również częściowa deuteryzacja białka poprzez zastąpienie H przez D wyłącznie w miejscach wymiennych (grupach miareczkowalnych), podczas gdy niewymienne miejsca związane z węglem pozostają uwodornione21. Można to osiągnąć poprzez wzrost uwodornionych kryształów białka w deuterowanym ługu macierzystym22. Najczęściej jednak wymiana H/D uwodornionych białek odbywa się poprzez wymianę parową po wzroście odpowiednio dużych kryształów w buforze opartym na H2O23. W takich przypadkach kryształy są umieszczane w kapilarze kwarcowej i równoważone parą z ługiem macierzystym na bazie D20.
Ograniczone strumienie neutronów w źródłach neutronów skutkują dłuższym czasem zbierania danych, od dni do kilku tygodni24. W ORNL zarówno IMAGINE, jak i MaNDi wykorzystują wąskie pasmo przepustowe o długości fali w zakresie 2–6 A, aby zoptymalizować gromadzenie danych25. Dane można zbierać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze kriogenicznej. Gromadzenie danych kriogenicznych może potencjalnie poprawić jakość danych i otworzyć możliwość zatrzymywania przez zamarzanie produktów pośrednich. Po zebraniu danych dyfrakcji neutronów, zestaw danych rentgenowskich jest zwykle zbierany na tym samym kryszale w tej samej temperaturze lub na kryszale hodowanym w identycznych warunkach26. Gromadzenie danych w tej samej temperaturze pozwala na udoskonalenie struktury zarówno na podstawie danych rentgenowskich, jak i neutronowych, zapobiegając wszelkim potencjalnym artefaktom wywołanym temperaturą, takim jak zmiany widoczności i położenia wód lub zajmowanie pozostałości o alternatywnych konformacjach27. Wspólne udoskonalanie danych neutronów rentgenowskich zwiększa stosunek danych do parametrów i ma tę zaletę, że pozwala na doprecyzowanie współrzędnych szkieletu białka w stosunku do danych rentgenowskich, podczas gdy dane dyfrakcji neutronów są wykorzystywane do uściślenia położenia atomów H/D 28. Jest to szczególnie przydatne w przypadku stosowania próbek częściowo deuterowanych, w których występuje anulowanie gęstości spowodowane atomami H w niewymiennych miejscach białka. Chociaż liczba struktur rentgenowskich znacznie przewyższa liczbę struktur neutronowych zdeponowanych w Banku Danych Białkowych (PDB), pakiety oprogramowania początkowo zaprojektowane do udoskonalania danych rentgenowskich zostały rozszerzone o dane neutronowe3,29,30. Po zebraniu danych modele można udoskonalić za pomocą pakietów uściślających, takich jak phenix.refine, CNSsolve (nCNS) lub SHELXL28,31,32,33. Podczas procesu uszlachetniania mapy gęstości rozpraszania neutronów mogą być wizualizowane w celu ręcznego dopasowania za pomocą COOT34. Po rozwiązaniu struktury, współrzędne oraz pliki danych dyfrakcji neutronów i/lub promieniowania rentgenowskiego mogą zostać przesłane do PDB, który zatwierdzi i zdeponuje model, udostępniając go do publicznego dostępu18,29,30.
Analiza strukturalna białek to wieloaspektowe podejście, w którym wykorzystywane są liczne techniki do badania ich funkcji i mechanizmu35. Krystalografia białek neutronowych dostarcza cennych informacji chemicznych, które rozszerzają i uzupełniają wyniki dodatkowych badań, takich jak dyfrakcja rentgenowska, spektroskopia, magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) lub dyfrakcja elektronów mikrokrystalicznych (microED)36. Dyfrakcja białek neutronowych ma wyjątkową pozycję, aby zapewnić wgląd w mechanizmy enzymatyczne, ponieważ atomy H mają kluczowe znaczenie dla ich chemii. Brak uszkodzeń radiacyjnych indukowanych przez neutrony sprawia, że są one wyjątkowo odpowiednie do badania metaloprotein37. Przedstawiamy tutaj reprezentatywny przykład procesu dyfrakcji białek neutronowych od przygotowania próbki do zebrania, udoskonalenia i analizy danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Kryształy o rozmiarach wystarczających do eksperymentów dyfrakcji neutronowej zostały wyhodowane z metaloproteiny Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). NcLPMO9D jest metaloproteiną zawierającą miedź biorącą udział w degradacji opornej celulozy poprzez wstawienie atomu tlenu w wiązaniu glikozydowym38,39. Miejsce aktywne NcLPMO9D zawiera jednojądrzaste centrum miedzi w charakterystycznym "nawiasie histydyny" złożonym z N-końcowej histydyny i drugiej konserwatywnej histydyny (rysunek uzupełniający 3)40. N-koniec grzybowych LPMO jest metylowany, ale modyfikacja poprzejściowa nie zachodzi podczas ekspresji rekombinowanej w drożdżach. W stanie spoczynku NcLPMO9D centrum miedzi jest obecne na stopniu utlenienia Cu2+ i jest aktywowane przez redukcję pojedynczego elektronu do Cu1+, umożliwiając wiązanie tlenu cząsteczkowego i aktywację przez szybką redukcję do gatunku ponadtlenkowego41,42. Ogólna reakcja NcLPMO9D wymaga dalszego dodania jednego elektronu i dwóch protonów w celu utworzenia hydroksylowanego iloczynu polisacharydowego43. Tożsamość aktywowanej formy tlenu odpowiedzialnej za abstrakcję atomów wodoru (HAA) z substratu polisacharydowego nie została zidentyfikowana, a obecnie trwają intensywne badania strukturalne i obliczeniowe44,45. Biorąc pod uwagę skład chemiczny redoks w miejscu aktywnym NcLPMO9D, łagodzenie uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem jest szczególnie istotne. Ilustrujemy tutaj gromadzenie danych o temperaturze pokojowej i kriotemperaturze na kryształach NcLPMO9D w celu określenia struktury NcLPMO9D odpowiednio w stanie spoczynku i w aktywowanej formie zredukowanej46. Nacisk zostanie położony na montaż kryształów białka, konfigurację instrumentów linii badawczej do zbierania danych, przygotowanie plików danych i współrzędnych oraz etapy udoskonalania niezbędne do modelowania struktury neutronowej składającej się ze wszystkich atomów.

<table><tbody><tr><td>Chłonne punkty papierowe Rozmiar #30-#40, długość 60 mm</td><td>DiaDent/DiaVet</td><td>218-292</td><td></td></tr><tr><td>Wosk kapilarny</td><td>Hampton</td><td>HR4-328</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td></td><td>Wersja 7.0.077</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe (15 ml)</td><td>Corning</td><td>CLS430790</td><td></td></tr><tr><td>stożkowe probówki wirówkowe (50 ml)</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td>Wersja 0.8.9.2</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap ALS</td><td>Hampton</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze z zakrzywioną końcówką</td><td>Mitegen</td><td>TW-CTF-1</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku deuteru, 35 % wag. w D2O, &ge; 99 atomów % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>543047</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru 99,9 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Pętle MicroLoops o podwójnej grubości 1000 i mikro; m</td><td>Mitegen</td><td>M5-L18SP-1000</td><td></td></tr><tr><td>FiveEasy pH-metr F20-Std-Kit</td><td>Mettler Toledo</td><td>30266626</td><td></td></tr><tr><td>Pianka Dewars Standardowe naczynie 800 ml</td><td>Spearlab</td><td>M-FD-800</td><td></td></tr><tr><td>Czterokolorowa glina montażowa</td><td>Hampton</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, BioUltra, do biologii molekularnej, &ge; 99,5% (T),</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>Dyfraktometr rentgenowski z anodą obrotową o wysokim strumieniu z detektorem EIGER 4M</td><td>Rigaku, Oxford Cryostream i Dectris</td><td>XtaLAB Synergy-R</td><td>Dyfraktometr rentgenowski Home source</td></tr><tr><td>Różdżka magnetyczna Straight</td><td>Mitegen</td><td>MR-1013198</td><td></td></tr><tr><td>Mikroloader, końcówka do napełniania Femtotips i innych mikrokapilar szklanych (tylko do użytku badawczego), 0,5 &ndash; 20 &mikro; L, 100 mm, jasnoszary, 192 szt. (2 stojaki i czasy; 96 szt.)</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki o pojemności 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego z przezroczystą pokrywką Średnica 100 mm</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td></td><td>Wersja 1.14-3260</td><td></td></tr><tr><td>Pin Tong 18 mm</td><td>Mitegen</td><td>MR-1013196</td><td></td></tr><tr><td>Objętość pipety 0,1-2,5 &mu; L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683779</td><td></td></tr><tr><td>Pojemność pipety 100-1000 &mu; L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683825</td><td></td></tr><tr><td>Pojemność pipety 10-100 &mu; L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683809</td><td></td></tr><tr><td>Pojemność pipety 20-200 &mu; L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683817</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) BioXtra, średnia masa 3,350, proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara kwarcowa, średnica wewnętrzna 1,00 mm, długość 80 mm</td><td>Hampton</td><td>HR6-146</td><td>Cienkościenny kapilarny</td></tr><tr><td>mikroskop badawczy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Podstawy goniometru wielokrotnego użytku B3 (SSRL/SAM Style)</td><td>Mitegen</td><td>GB-B3-R</td><td></td></tr><tr><td>Round - Miniaturowe rurki z pustego szkła (VitroTubes) Przezroczysty topiony kwarc / średnica wewnętrzna 1,00 mm, długość 100 mm</td><td>VitroCom</td><td>CV1012</td><td>Grubościenne kapilarne</td></tr><tr><td>pudełko na kanapki z pokrywą</td><td>Hampton</td><td>HR3-132</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowana 9-dołkowa szklana płyta</td><td>Hampton</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>Płytka krystalizacyjna do siedzenia (24 duże dołybki)</td><td>Mitegen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór deuterotlenek sodu, 40 % wag. w D2O, 99 atomów % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176788</td><td></td></tr><tr><td>Grube silikonowane okrągłe szkiełka podstawowe (22 mm x 0,96 mm)</td><td>Hampton</td><td>HR3-247</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne końcówki do pipet, 0,1 - 10 &mikro; L</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne końcówki do pipet, 1 - 100 &mikro; L</td><td>VWR</td><td>76322-136</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne końcówki do pipet, 100 - 1000 &mikro; L</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne końcówki do pipet, 20 - 200 &mikro; L</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne końcówki do pipet, 1 - 20 i mikro; L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>Długopis woskowy</td><td>Hampton</td><td>HR4-342</td><td></td></tr></tbody></table>

gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

Krystalografia neutronów to technika strukturalna, która pozwala na określenie pozycji atomów wodoru w makrocząsteczkach biologicznych, dostarczając mechanistycznie ważnych informacji o stanach protonacji i hydratacji, jednocześnie nie wywołując uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Natomiast dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego dostarcza tylko ograniczonych informacji na temat położenia atomów światła, a wiązka promieniowania rentgenowskiego szybko indukuje uszkodzenia promieniowania kofaktorów światłoczułych i centrów metali. Poniżej przedstawiono przebieg pracy zastosowany na liniach badawczych IMAGINE i MaNDi w Oak Ridge National Laboratory (ORNL) w celu uzyskania struktury dyfrakcji neutronów po wyhodowaniu kryształu białka o odpowiedniej wielkości (> 0,1mm3). Demonstrujemy montaż uwodornionych kryształów białka w kapilarnach kwarcowych w celu zbierania danych dyfrakcji neutronów. Przedstawiono również proces wymiany parowej zamontowanych kryształów z buforem zawierającymD 2O, aby zapewnić zastąpienie atomów wodoru w miejscach wymiennych deuterem. Włączenie deuteru zmniejsza tło powstające w wyniku niekoherentnego rozpraszania atomów wodoru i zapobiega znoszeniu gęstości spowodowanemu ich ujemną długością rozpraszania koherentnego. Strategie dopasowywania próbek i zbierania danych o temperaturze pokojowej zilustrowano za pomocą danych gromadzonych przez IMAGINE w reaktorze izotopowym o wysokim strumieniu (HFIR). Co więcej, montowanie kryształów i szybkie zamrażanie w ciekłym azocie w celu zbierania danych kriogenicznych w celu wychwytywania labilnych produktów pośrednich reakcji zademonstrowano na instrumencie MaNDi do pomiaru czasu przelotu w Spalacyjnym Źródle Neutronów (SNS). Omówione zostanie również przygotowanie plików danych współrzędnych i dyfrakcyjnych modelu oraz wizualizacja map gęstości długości rozpraszania neutronów (SLD). Na koniec omówione zostanie udoskonalanie struktury na podstawie samych danych neutronowych lub na podstawie połączonych danych rentgenowskich/neutronowych w celu uzyskania struktury całkowicie atomowej białka będącego przedmiotem zainteresowania. Proces wyznaczania struktury neutronowej zostanie zademonstrowany przy użyciu kryształów monooksygenazy polisacharydowej Neurospora crassa LPMO9D, metaloproteiny zawierającej miedź, biorącej udział w degradacji opornych polisacharydów poprzez oksydacyjne rozszczepienie wiązania glikozydowego.

Krystalografia białek neutronowych to technika strukturalna, która pozwala na lokalizację atomów wodoru, dostarczając tym samym ważnych szczegółów mechanistycznych funkcji białek. Przedstawiamy tutaj przebieg pracy montażu kryształu białka, zbieranie danych dyfrakcji neutronów, udoskonalanie struktury i analizę map gęstości długości rozpraszania neutronów.

Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

Krystalografia neutronowa to strukturalna technika określania pozycji atomów wodoru w makrocząsteczkach biologicznych. Struktury neutronowe ujawniają stany protonacji i orientacje cząsteczek wody, aby wyjaśnić mechanizmy reakcji i interakcje wiązania. W przeciwieństwie do dyfrakcji rentgenowskiej, dyfrakcja neutronów ma tę zaletę, że jest techniką nieniszczącą.Białka z grupami światłoczułymi lub metalosensorami mogą być badane bez cierpienia z powodu uszkodzeń popromiennych. Aby przeprowadzić krystalografię białek neutronowych, duże, kruche kryształy białek są montowane w kapilarnach kwarcowych w celu zbierania danych o temperaturze pokojowej. Montaż kapilarny kryształów nie jest rutynowo wykonywany, co sprawia, że demonstracja tej techniki jest pouczająca.W celu zebrania kryształów otwórz szczelnie zamknięte pudełko kanapkowe zawierające kryształy białka w dziewięciodołkowej płytce ze szkła silikonowanego o dużej objętości i za pomocą mikropipety przenieś od 10 do 20 mikrolitrów z roztworu zbiornika krystalizacyjnego na szkiełko podstawowe. Oceń kryształy pod mikroskopem. Użyj mikropętli o odpowiedniej wielkości, aby zebrać kryształ i umieść kryształ w kropli roztworu rezerwuarowego.Do montażu kryształów weź kapilę kwarcową o średnicy dwóch milimetrów i długości 50 milimetrów, zassaj bufor zbiornika pipetą i napełnij jeden koniec kapilary buforem zbiornika. Użyj pętli montażowej, aby delikatnie umieścić kryształ w buforze zbiornika w kapilarze kwarcowej. Postukaj w probówkę, aby przesunąć bufor zbiornika i kryształ w dół kapilary, a następnie użyj długiej, cienkiej pipety, aby zassać roztwór z okolic kryształu.Użyj cienkiego papierowego, aby ostrożnie wysuszyć kryształ i osuszyć ścianki kapilary, a następnie dodaj 20 do 50 mikrolitrów deuterowanego roztworu buforowego na koniec kapilary. Użyj różdżki grzewczej, aby stopić porcję wosku pszczelego i delikatnie włóż kapilar do stopionego wosku pszczelego, aż utworzy się hermetyczne uszczelnienie. Zastąp zdeuterowany bufor świeżym deuterowanym buforem o pojemności od 20 do 50 mikrolitrów w drugim, szóstym i 10 dniu po zamontowaniu kryształu i ponownie uszczelnij kapilarę świeżym stopionym woskiem pszczelim po każdej wymianie pary, jak pokazano.Po co najmniej dwutygodniowej wymianie pary użyj szpachli, aby przymocować kapilę kwarcową do kija z próbką goniometru dyfraktometru neutronowego IMAGINE, który został przymocowany do stolika próbki instrumentu, a następnie opuść próbkę i przyklej ją do wiązki neutronów i obszaru detektora. Otwórz program do akwizycji danych na komputerze sterującym Beamline i kliknij zakładkę setup, aby ustawić strategię zbierania danych i wprowadzić parametry eksperymentu, w tym nazwę instrumentu i nazwę obrazów, które mają być zbierane. Kliknij kartę zbierania i wprowadź parametry zbierania danych, w tym czas ekspozycji i liczbę klatek do zebrania.W graficznym interfejsie użytkownika optyki kliknij 2.78 dla minimum lambda i 4.5 dla maksimum lambda, aby ustawić quasi-zakres zbierania danych. Kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie, aby rozpocząć zbieranie danych. Po zebraniu danych neutronowych zbierz odpowiedni zestaw danych rentgenowskich na tym samym krysztale w tej samej temperaturze.Przed zebraniem danych kriogenicznych wyjmij roztwór zbiornika z pudełka na kanapki i napełnij pudełko na kanapki deuterowanym roztworem buforowym zbiornika, pozostaw do zrównoważenia przez tydzień i powtórz trzy razy. Po trzech kolejnych rundach wymiany roztworu w zbiorniku, zbierz kryształ za pomocą mikropętli i zanurz kryształ w roztworze krioprotektantu na dwie godziny przed zamontowaniem kryształu w mikropętli przymocowanej do mocowania kriokryształu. Zanurz zamontowany kryształ i mocowanie kriogeniczne w ciekłym azocie.Gdy kryształ jest zamrożony, zamontuj kryształ na stoliku na próbkę dyfraktometru neutronów wielkocząsteczkowych wyposażonym w strumień kriogeniczny. Sprawdź, czy kryształ jest zamontowany i wyśrodkowany w celu zbierania danych, uzupełnij informacje o propozycji i kliknij ikonę folderu, aby załadować tabelę strategii zbierania danych, a następnie kliknij przycisk Prześlij, aby rozpocząć zbieranie danych. Dyfrakowane neutrony staną się widoczne w czasie rzeczywistym, gdy zostaną wykryte przez detektory czasu przelotu MaNDi.Aby udoskonalić połączone dane rentgenowskie i neutronowe, najpierw otwórz CCP4 i wybierz opcję konwertuj, aby zmodyfikować program rozszerzeń MTZ, aby dopasować flagi danych wolnych od R danych neutronowych do tych z danych rentgenowskich. Zaimportuj plik odbicia danych neutronowych w formacie MTZ. Wybierz opcję importuj wolne dane R z innego pliku MTZ i zaimportuj plik MTZ rentgenowski.Nazwij nowy dopasowany plik MTZ i kliknij przycisk Uruchom. Następnie otwórz pakiet oprogramowania Phoenix i w obszarze udoskonalenia kliknij gotowy zestaw. Prześlij plik współrzędnych białka, wybierz, aby dodać wodór do modelu, jeśli go nie ma, i wybierz HD w miejscach wymiennych, H w innym miejscu z menu rozwijanego.Wybierz dodaj deuter do cząsteczek rozpuszczalnika i kliknij uruchom, aby rozpocząć. Aby zagęścić strukturę, na karcie zagęszczenia otwórz feniksa. Refine program, aby skonfigurować udoskonalanie przy użyciu zarówno danych rentgenowskich, jak i neutronowych.W zakładce konfiguracji wprowadź plik PDB z rozwiązanej struktury rentgenowskiej. Prześlij plik MTZ z danymi neutronowymi. Przypisz dane pliku MTZ jako dane neutronowe w neutronach R free.Prześlij plik MTZ z danych rentgenowskich i przypisz go jako dane rentgenowskie i rentgenowskie R za darmo. W obszarze Ustawienia zagęszczenia upewnij się, że wybrano standardową strategię zagęszczania, i zwiększ liczbę cykli do pięciu. Wybierz wszystkie parametry, zaawansowane i wodory.Zmień model rafinacji wodoru na indywidualny i wyłącz siłę napędzającą ADP, a następnie wyszukaj jądrowy. Wybierz opcję Użyj odległości jądrowych od X-HD. Kliknij przycisk Uruchom, aby zainicjować uściślenie.Aby zbudować model w Phoenix, kliknij otwórz w Coot. W Coot wizualizuj mapy gęstości gęstości elektronów promieniowania rentgenowskiego i długości rozpraszania neutronów. Wybierz menedżera wyświetlania i usuń mapę gęstości długości rozpraszania neutronów 2FOFC.Wybierz otwórz MTZ i wybierz otwórz MTZ i otwórz plik mtz danych neutronowych. Zarówno dla opcji amplitud, jak i faz wybierz no_fill_neutron dane z menu rozwijanych, aby otworzyć niewypełnione mapy gęstości długości rozpraszania neutronów. Przeprowadzić oględziny pozostałości, aby określić, czy model pasuje do danych, i przeanalizować piki mapy gęstości różnicowej w miejscach wymiennych wodór-deuter w celu określenia prawidłowej orientacji i zajętości.Zmień orientację cząsteczek wody zgodnie z mapami neutronów SLD i oddziaływaniami wiązań wodorowych. Dostosuj stan protonacji i orientację miejsc wymiennych reszty białkowodowo-deuterowej zgodnie z mapami neutronów SLD. Wykonuj kolejne rundy interaktywnego budowania i udoskonalania modelu, aby uzyskać kompletną strukturę.Uwodornione kryształy białka wyhodowane w buforze na bazie wody mają wymiary około 1 000 na 900 mikronów. Kryształy można montować w kapilarach kwarcowych w celu wymiany pary z buforem na bazie tlenku deuteru przez trzy tygodnie przed zebraniem danych dyfrakcji neutronów. Dane dyfrakcji neutronów zbierano przez kilka dni z rozdzielczością 2,30 angstrema, a na tym samym krysztale zebrano zestaw danych dyfrakcji rentgenowskiej.Piki w mapach gęstości długości rozpraszania neutronów FO minus FC dostarczają cennych informacji na temat orientacji reszt, takich jak paragina, i dodatnich pików w FO minus FC mapy gęstości rozpraszania neutronów są również bardzo pouczające w określaniu stanów protonowania reszt z grupami miareczkowymi, takimi jak histydyna. Nakładki map gęstości rozpraszania elektronów i neutronów dla cząsteczek wody wskazują, że podczas gdy interakcje wiązań wodorowych można wywnioskować z danych rentgenowskich, neutrony dostarczają jasnych informacji o położeniu tych wiązań wodorowych. Mapy gęstości rozpraszania neutronów można wykorzystać do określenia orientacji grup funkcyjnych łańcucha bocznego wodoru i deuteru.Mapy gęstości długości rozpraszania neutronów, w których niewymienne atomy wodoru są związane z węglem, wydają się niekompletne w porównaniu z ich odpowiednikami na mapach gęstości elektronów ze względu na anulowanie gęstości. W związku z tym zaleca się wspólne udoskonalanie próbki za pomocą zarówno danych rentgenowskich, jak i neutronowych, w których dane rentgenowskie mogą być wykorzystane do określenia położenia szkieletu białkowego. Krystalografia białek neutronowych wymaga dużych kryształów.Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z kryształami i montażu, aby uniknąć uszkodzenia kryształów, które mogą łatwo pęknąć, pogarszając jakość danych. Krystalografia białek neutronowych zapewnia wgląd w mechanizm reakcji białek, potencjalnie ujawniając katalityczne reszty lub cząsteczki wody, których rolę można dalej badać za pomocą kinetyki, mutagenezy lub spektroskopii.

neutron-crystallography-data-collection-processing-for-modelling

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Badania strukturalne biomakromolekuł za pomocą krystalografii wymagają kryształów wysokiej jakości. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys (w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium) i/lub przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

Badanie przesiewowe fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin odbywa się za pomocą przepływu pracy z dedykowanymi bibliotekami związków, narzędziami do obsługi kryształów, szybkimi urządzeniami do zbierania danych i w dużej mierze zautomatyzowaną analizą danych. Przedstawiony protokół ma na celu maksymalizację wyników takich eksperymentów, aby zapewnić obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów opartych na dalszej strukturze.

Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Poznaj technikę krystalografii neutronowej do lokalizacji atomów wodoru w białkach. Metoda ta ujawnia stany protonowania i orientację cząsteczek wody, dostarczając kluczowych informacji o mechanizmach reakcji enzymatycznych.

Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

Przeglądaj więcej filmów