Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Metoda ta wykorzystuje różne sposoby radzenia sobie z wyzwaniami związanymi z ekspresją rekombinowanych białek wirusowych przy użyciu jednego białka wirusowego P' jako białka opiekuńczego dla innego białka wirusowego N 'w celu uzyskania białek N wolnych od RNA. Wolne od RNA białko N RSV uzyskuje się przed złożeniem specyficznego dla wirusa RNA w nukleokapsyd in vitro. Metoda może być również stosowana w przypadku innych niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnym sensie.

Metoda klonowania niezależnego od ligacji jest szybką techniką pozyskiwania konstruktów koekspresji. Dlaczego lub fakultatywne mikroskop elektronowy barwienia to szybka metoda sprawdzania dużego montażu w surowej komórce. Chcemy dać Ci dwie wskazówki.

Po pierwsze, uzyskaj wysoką wydajność i solidne wyniki na każdym kroku, zanim przejdziesz do następnego kroku. Po drugie, ustaw odpowiednie programy do chromatografii i poćwicz zbieranie siatek za pomocą kleszczy. Aby uzyskać bi-cistroniczną konstrukcję koekspresji N i P, hoduj cztery jednolitrowe kultury E coli BL21DE3 szczep komórek w pożywce LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,6, obniż temperaturę do 16 stopni Celsjusza. Po jednej godzinie indukować ekspresję białka przez leczenie 0,5 milimolowym IPTG przez noc. Następnego ranka zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w 200 mililitrach buforu do lizy.

Lizuj komórki przez sonikację przez 15 minut, z trzema sekundami włączonymi i trzema sekundami wyłączonymi impulsami. I zbierz lizaty przez odwirowanie. Załaduj supernatant do kobaltowej kolumny grawitacyjnej o wymiarach 2,5 na 10 centymetrów z około 10 mililitrami kulek.

Wstępnie zrównoważone z 5 do 10 objętościami kolumny buforu do lizy. I umyć kolumnę pięcioma objętościami buforu B i pięcioma objętościami buforu C. Użyj dwóch objętości buforu D, aby wymyć białko z kulek. I zrównoważ kolumnę Q z pięcioma jednomililitrowymi objętościami bufora QA.

Za pomocą pompy perystaltycznej załadować rozcieńczoną próbkę do kolumny. Rozpuść załadowaną kolumnę Q na maszynie HPLC wraz ze świeżymi QA i QB. Uruchom mycie pompy, aby pomyślnie umyć maszynę za pomocą jednego lub dwóch woluminów QB i QA.

Po ostatnim praniu ustaw natężenie przepływu na jeden mililitr na minutę i ustaw UV1 na 280 nanometrów, a UV2 na 260 nanometrów, używając płytki o głębokości 96 do zebrania frakcji. Następnie użyj stopniowego gradientowego nakładania trzech do czterech objętości każdego stężenia środka elucyjnego, aby wymyć białka, zaczynając od stężenia 0% QB i zwiększając procent o 5% za każdym razem. Kompleks białkowy N-0 P będzie eluował przy stężeniu buforu 15% QB.

Wyizolować białko przez filtrację żelową, w kolumnie oczyszczającej na małą skalę o wymiarach 1 na 30 centymetrów, zrównoważoną buforem E. Następnie przeanalizować białko zawierające frakcje za pomocą strony SDS. W przypadku składania nukleokapsydu specyficznego dla wirusa, wymieszać i inkubować oczyszczony kompleks N-0 P z oligo RNA w stosunku molekularnym 1:1,5 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Wstępnie zrównoważyć kolumnę filtracyjną z żelu oczyszczającego na małą skalę z buforem E. I usunąć wszelkie osady przez odwirowanie.

Załadować supernatant do kolumny chromatografii wykluczającej wielkość. I porównaj obrazy chromatografii wykluczania wielkości białka do złożenia RNA i próbek kontrolnych samego białka, łącząc proporcje czystości kwasów nukleinowych, aby określić, które piki są złożonym N RNA, N-0 P i wolnym RNA. Aby złożyć kompleks N RNA, zbierz wszystkie frakcje pikowe N RNA, wykonaj ekstrakcję RNA i uruchom żel mocznikowy, aby dwukrotnie sprawdzić długość określonego RNA.

Aby przygotować siatkę barwienia ujemnego do mikroskopii elektronowej z barwieniem ujemnym, użyj płytki grzewczej, aby podgrzać 5 ml podwójnie destylowanej wody do wrzenia i dodaj 37,5 miligrama mrówczanu uranylu do wody, aby uzyskać 0,75% roztwór do barwienia mrówczanu uranylu. Przenieść roztwór do zlewki pokrytej folią aluminiową. I dodaj cztery mikrolitry 10 molowego wodorotlenku sodu.

Po 15 minutach mieszania chronionego przed światłem, przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 mikrona do probówki. Aby siatki ciągłej mikroskopii elektronowej powlekanej węglem były hydrofilowe, umieść siatki w komorze podłączonej do zasilania i nałóż ujemnie naładowane jony na siatki. Wytnij i złóż pasek parafilmu o wymiarach dwa na dwa cale.

Dodaj dwie 40 mikrolitrowe krople wody destylowanej na jeden koniec paska. I dwie 40 mikrolitrowe krople 0,75% roztworu barwiącego mrówczan uranylu na drugi koniec. Dodaj trzy mikrolitry próbki białka do każdej siatki.

Po minucie przyłóż kratki do bibuły i zanurz je dwa razy w kropelkach wody destylowanej. I raz w pierwszej kropli roztworu barwiącego. Następnie zanurz siatkę w drugiej kropli roztworu barwiącego na 30 sekund, a następnie osusz kratki na bibułce, aby usunąć nadmiar roztworu plamy i pozwól kratkom wyschnąć na powietrzu przed obrazowaniem.

Za pomocą tego protokołu można uzyskać rozpuszczalny na dużą skalę kompleks N0 P heterodimerycznego syncytialnego wirusa oddechowego. W E. coli pełna długość N i N-końcowych części białek P ulega koekspresji z 10-krotnym znacznikiem His na białku N. W oparciu o stosunek czystości kwasów nukleinowych absorbancji UV, N0 P zawierał zarówno N, jak i N-końcowy P, ale nie zawierał komórkowego RNA.

Oczyszczony N0 P może być następnie stymulowany i składany w cząstki podobne do nukleokapsydu na siatkach mikroskopii elektronowej poprzez inkubację ze specyficznymi oligonukleukleotydami, jak pokazano. Podczas oczyszczania białka należy unikać pęcherzyków powietrza podczas oczyszczania kolumny i rozcieńczyć próbkę buforem QA w celu dostosowania pH i stężenia soli przed załadowaniem próbki do kolumny. Należy uważać, aby trzymać siatki mikroskopii elektronowej za zewnętrzną krawędź, aby uniknąć zanieczyszczenia siatek.

Pomoże nam to określić pytania dotyczące niedodatniego upakowania genomu RSV, niezależnie od tego, czy jest to lewoskrętna, czy prawoskrętna struktura spiralna. Postępując zgodnie z tymi procedurami i uwierzytelniając matrycę RNA do testu aktywności polimerazy RSV. A ten specyficzny dla wirusa RSV nukleokapsyd może być używany do analizy krioelektromagnetycznej o wysokiej rozdzielczości.