Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Metoda ta wykorzystuje różne sposoby rozwiązania problemów związanych z ekspresją rekombinowanych białek wirusowych, stosując jedno białko wirusowe P jako chaperon dla innego białka wirusowego N w celu uzyskania białek N wolnych od RNA. Białko N wirusa RSV wolne od RNA jest otrzymywane przed złożeniem specyficznego dla wirusa RNA w nukleokapsyd in vitro. Metoda ta może być również stosowana w przypadku innych niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnej polarności. Metoda klonowania niezależnego od ligacji jest szybką techniką pozyskiwania konstruktów do koekspresji. Ponieważ elektronowa mikroskopia z barwieniem negatywowym jest szybką metodą sprawdzania dużych kompleksów w surowych komórkach, chcielibyśmy przekazać dwie wskazówki. Po pierwsze, należy uzyskać wysoką wydajność i wiarygodne wyniki na każdym etapie przed przejściem do kolejnego kroku. Po drugie, należy skonfigurować odpowiednie programy do chromatografii oraz poćwiczyć pobieranie siatek pęsetą.

Aby uzyskać konstrukt bicistronowy do koekspresji białek N i P, należy wyhodować cztery jedno litrowe kultury komórek szczepu E coli BL21DE3 w pożywce LB w temperaturze 37°C. Gdy gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 0,6, należy obniżyć temperaturę do 16°C. Po godzinie należy indukować ekspresję białek, dodając 0,5 mM IPTG i inkubując kulturę przez noc. Następnego ranka komórki należy zebrać poprzez wirowanie, a osady resuspenderć w 200 ml buforu do lizy. Komórki należy poddać lizie za pomocą sonikacji przez 15 minut, stosując impulsy trwające trzy sekundy włączone i trzy sekundy wyłączone, a następnie zebrać lizaty przez wirowanie. Nadpłyn należy nałożyć na kobaltową kolumnę grawitacyjną o wymiarach 2,5 × 10 cm, zawierającą około 10 ml kulek uprzednio równoważonych 5–10 objętościami kolumny buforu do lizy, a następnie przemyć kolumnę pięcioma objętościami buforu B i pięcioma objętościami buforu C. Do elucji białka z kulek należy użyć dwóch objętości buforu D. Następnie należy zrównoważyć kolumnę Q, stosując pięć porcji po 1 ml buforu QA.

Użyj pompy perystaltycznej, aby nanieść rozcieńczoną próbkę na kolumnę. Zamontuj załadowaną kolumnę Q w urządzeniu HPLC wraz ze świeżymi buforami QA i QB. Uruchom przemywanie pompy, aby skutecznie przemyć urządzenie od jedną do dwóch objętości buforów QB i QA.

Po ostatnim płukaniu ustaw prędkość przepływu na 1 ml/min, a detektory UV1 na 280 nm i UV2 na 260 nm, wykorzystując płytkę 96-dołkową do głębokich studni do zbierania frakcji. Następnie zastosuj stopniowanie gradientowe, podając od trzech do czterech objętości każdego stężenia eluenta w celu elucji białek, zaczynając od 0% stężenia QB i zwiększając ten procent o 5% w każdym kroku. Kompleks białkowy N0 P zostanie elucyjny przy stężeniu buforu QB wynoszącym 15%.

Wyizoluj białko metodą filtracji żelowej, wykorzystując kolumnę do oczyszczania w małej skali o wymiarach 1x30 cm, wyrównaną buforem E. Następnie przeanalizuj frakcje zawierające białko za pomocą elektroforezy SDS-PAGE.

W celu specyficznego dla wirusa montażu nukleokapsydu, zmieszaj i inkubuj oczyszczony kompleks N0P z oligonukleotydem RNA w stosunku molowym 1:1,5 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Wstępnie zrównoważ kolumnę do żelowej filtracji do oczyszczania w małej skali za pomocą buforu E i usuń wszelkie osady poprzez wirowanie.

Nanieś supernatant na kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczek. Porównaj obrazy z chromatografii wykluczania cząsteczek dla próbek kompleksu białko-RNA oraz próbek kontrolnych zawierających samo białko, uwzględniając wskaźniki czystości kwasów nukleinowych, aby zidentyfikować piki odpowiadające kompleksom N-RNA, białku N oraz wolnemu RNA. W celu wyizolowania kompleksu N-RNA zbierz wszystkie frakcje piku N-RNA, przeprowadź ekstrakcję RNA, a następnie wykonaj elektroforezę w żelu PAGE z mocznikiem, aby potwierdzić długość konkretnego RNA.

Aby przygotować siatkę do barwienia negatywowego w celu przeprowadzenia elektronowej mikroskopii z barwieniem negatywowym, należy użyć płyty grzewczej, aby doprowadzić 5 mL wody dwukrotnie destylowanej do wrzenia, a następnie dodać do niej 37,5 mg uranyloformianu, aby otrzymać 0,75% roztwór barwiący uranyloformianu. Roztwór należy przenieść do zlewki przykrytej folią aluminiową i dodać cztery µL 10 M wodorotlenku sodu.

Po 15 minutach mieszania w warunkach ochrony przed światłem, przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 mikrona do probówki. Aby uczynić siatki do mikroskopii elektronowej z ciągłą powłoką węglową hydrofilowymi, umieścić siatki w komorze podłączonej do zasilacza i przyłożyć do nich jony o ładunku ujemnym. Odciąć i złożyć pasek parafilmu o wymiarach dwóch na dwa cale. Nanieść dwie krople wody destylowanej o objętości 40 µL na jeden koniec paska oraz dwie krople 0,75% roztworu barwiącego uranylowo-formianowego o objętości 40 µL na drugi koniec. Nanieść 3 µL próbki białka na każdą siatkę. Po jednej minucie, przykładając siatki do papieru filtracyjnego, zanurzyć je dwukrotnie w kroplach wody destylowanej, a następnie raz w pierwszej kropli roztworu barwiącego. Następnie zanurzyć siatkę w drugiej kropli roztworu barwiącego na 30 sekund, po czym osuszyć siatki na papierze filtracyjnym, aby usunąć nadmiar roztworu barwiącego, i pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu przed obrazowaniem.

Stosując niniejszy protokół, można uzyskać rozpuszczalny kompleks heterodimeryczny N0P wirusa RSV (oddechowego syncytialnego) w dużej skali. W komórkach E coli pełna długość białka N oraz fragmenty N-końcowe białek P są koekspresjonowane z 10X His-tagiem przyłączonym do białka N. Na podstawie współczynnika czystości kwasów nukleinowych mierzonego metodą absorbancji UV stwierdzono, że kompleks N0P zawierał zarówno pełną długość białka N, jak i N-końcowy fragment białka P, lecz nie zawierał komórkowego RNA.

Oczyszczone N0P można było następnie stymulować i składać w cząstki przypominające nukleokapsydy na siatkach do mikroskopii elektronowej poprzez inkubację ze specyficznymi oligonukleotydami RNA, zgodnie z zaprezentowaną metodą.

Podczas oczyszczania białka należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas oczyszczania kolumnowego oraz rozcieńczyć próbkę buforem QA w celu dostosowania pH i stężenia soli przed nałożeniem próbki na kolumnę. Należy uważać, aby trzymać siatki do mikroskopii elektronowej za zewnętrzną krawędź, aby uniknąć ich zanieczyszczenia.

Pomoże to rozstrzygnąć kwestie dotyczące długoterminowego upakowania genomu RSV, w szczególności czy posiada on lewo- czy prawoskrętną strukturę helikalną. Po zastosowaniu tych procedur i uwierzytelnieniu matrycy RNA można przeprowadzić test aktywności polimerazy RSV, a tak przygotowany swoisty dla wirusa RSV nukleokapsyd może zostać wykorzystany do wysokorozdzielczej analizy cryo-EM.