Name: Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę in vitro składania nukleokapsydów RSV przy użyciu fosfoproteiny P jako szaperonu dla wolnego od RNA nukleoproteiny N. Technika ta umożliwia uzyskanie rekombinowanych białek wirusowych i ma zastosowanie w badaniach nad innymi wirusami RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Programy badawcze w laboratorium Liang w Emory są wspierane przez amerykański Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych (NIGMS), Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH) pod numerem nagrody R01GM130950, oraz Research Start-Up Fund w Emory University School of Medicine. Autor dziękuje członkom laboratorium Liang za pomocne wsparcie i krytyczną dyskusję.

1. Klonowanie molekularne
UWAGA: Klonowanie niezależne od ligazy (LIC) zostało użyte do stworzenia bi-cistronicznego konstruktu koekspresji RSV. LIC to metoda opracowana na początku lat 90., która wykorzystuje aktywność 3'-5' Exo polimerazy DNA T4 do tworzenia nawisów z komplementarnością między wektorem a DNA insert21,22. Konstrukty zostały wykonane przy użyciu wektora DNA 2BT-10, który składa się z 10-krotnego znacznika His na N-końcu otwartej ramki odczytu (ORF) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>Wykonaj linearyzację wektorów LIC za pomocą mineralizacji SSPI.
	<ol>
		<li>Połączyć 10 μl buforu SSPI 10X, 4 μl enzymu SSPI o stężeniu 5 U/μL, równoważną objętość 5 μg wektorowego miniprepu DNA i sterylny ddH2O do 100 μL.</li>
		<li>Inkubować trawienie przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Uruchom trawienie na 1,0% żelu agarozowym w celu ekstrakcji DNA wektora.</li>
		<li>Użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby przeprowadzić ekstrakcję i oczyszczenie. Zawiesić końcową objętość DNA wektora w 30 μl ddH2O i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj wstawki DNA dla N1-391 i P1-126 za pomocą N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer i P1-126 Reverse Primer (Tabela 1). 
	UWAGA: Nakładanie się na wektor linearyzowany jest w wystarczającym stopniu, aby zapewnić temperaturę topnienia między 55 °C a 60 °C. W przypadku startera odwrotnego z tego samego powodu występuje wystarczające zachodzenie na odwrotną nić komplementarną wektora linearyzowanego.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić amplifikację PCR wstawki DNA, stosując warunki podane w Tabeli 2 i Tabeli 3.</li>
		<li>Wyekstrahuj amplifikowaną wstawkę DNA. Uruchom produkty PCR z poprzedniego kroku na 1,0% żelu agarozowym, a następnie wyekstrahuj i oczyść pasma przez ekstrakcję żelu. Zawiesić końcową objętość wyekstrahowanego DNA w 15 μl ddH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Traktowanie wektora i insercji DNA za pomocą polimerazy DNA T4 (Tabela 4). 
	UWAGA: Zabieg należy przeprowadzić oddzielnie dla DNA wektora i DNA insercji.
	<ol>
		<li>Inkubować mieszaninę przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inaktywować polimerazę na gorąco w temperaturze 75 °C przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyżarzanie wektora LIC i wektora wstawiania.
	<ol>
		<li>Ustanowić kontrolę ujemną za pomocą 2 μl wektora LIC DNA i 2 μl sterylnego ddH2O.</li>
		<li>Połącz 2 μl insercji DNA i 2 μl wektora LIC DNA z poprzednich reakcji polimerazy DNA T4 w probówce o pojemności 0,2 ml.</li>
		<li>Przeprowadzić reakcję wyżarzania w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Ugasić reakcję za pomocą 1,3 μl EDTA o stężeniu 25 mM.</li>
		<li>Przekształć reakcję w 100 μl kompetentnych komórek E. coli Top10 i umieść je na płytce selekcyjnej ampicyliny23,24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj pozytywne konstrukty.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór minipreparatu plazmidu. Można to zrobić poprzez zbieranie kolonii i inokulację w pożywce LB. Zwykle wystarczą 3 kolonie.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę o sile 4,560 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulki w 250 μl buforu P1 i przygotować minipreparaty plazmidowe za pomocą zestawu do minipreparacji wirowej.</li>
		<li>Przeprowadź analizę trawienia produktu miniprep przy użyciu AseI lub innych enzymów restrykcyjnych.</li>
		<li>Załaduj próbki na 0,8% żelu agarozowym i uruchom strawiony plazmid. Przeanalizuj żel pod lampą UV.</li>
		<li>Użyj usługi sekwencjonowania, aby zweryfikować sekwencję dodatniego produktu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskać wstawkę DNA o koekspresji.
	<ol>
		<li>Wykonaj PCR, aby uzyskać N1-391 i P1-126, używając wcześniej skonstruowanych 2BT-10 N1-391 i 2BT-10 P1-126 jako szablonów.</li>
		<li>Wykonaj 1. PCR, aby uzyskać N1-391 z konstruktu 2BT-10 N1-391, używając warunków PCR w Tabeli 2 i Tabeli 3 z N1-391 Forward starter i Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTCTGATGCAATGCGGCGGCG 
		CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.</li>
		<li>Wykonaj drugi PCR, aby uzyskać P1-126 z konstruktu 2BT-10 P1-126 przy użyciu startera Forward: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC 
		AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́i P1-126 Reverse starter (należy użyć warunków PCR w Tabeli 2 i Tabeli 3).</li>
		<li>Na koniec wykonaj nakładanie się PCR na zmieszanych produktach poprzednich 2 reakcji PCR, aby połączyć N1-391 i P1-126. Użyj startera N1-391 Forward i P1-126 Reverse startera. Należy użyć warunków PCR w Tabeli 5 i Tabeli 6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz wektor i wstawkę DNA.
	<ol>
		<li>Nakładający się produkt PCR należy potraktować polimerazą DNA T4 zgodnie z protokołem w kroku 1.3.</li>
		<li>Wyżarzać wektor LIC i iloczyn PCR zgodnie z protokołem w kroku 1.4.</li>
		<li>Zidentyfikuj dodatnie konstrukty zgodnie z protokołem w kroku 1.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekspresja i oczyszczanie białek
UWAGA: Użyj E. coli do bi-cistronicznego konstruktu koekspresji zarówno N, jak i P. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, ale przeprowadzaj ekspresję w obniżonej temperaturze (16 °C) przez noc. Oczyść kompleksy białkowe poprzez kombinację kolumny kobaltowej, wymiany jonowej i chromatografii wykluczania wielkości (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).
<ol>
	<li>Użyj szczepu E. coli BL21(DE3) do produkcji białka. Hodować 4 litry kultur komórkowych w temperaturze 37 °C w podłożu LB (bulion Luria), aż OD600 osiągnie 0,6.</li>
	<li>Obniżyć temperaturę do 16 °C. Godzinę później wyindukuj ekspresję za pomocą 0,5 mM izopropylo-1-tio-D-galaktopyranozydu (IPTG) przez noc.</li>
	<li>Odwirować komórki w stężeniu 4,104 x g przez 25 minut, a następnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osady komórkowe w 200 ml buforu do lizy A (50 mM fosforanu sodu, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazolu, 10% glicerolu i 0,2% NP40). Użyj 50 ml buforu do lizy, aby ponownie zawiesić osady komórkowe z 1 litra hodowli komórkowej.</li>
	<li>Lizuj komórki za pomocą sonikacji przez 15 minut, 3 sekundy włączone i 3 sekundy wyłączone. Następnie odwirować komórki o stężeniu 37 888 x g przez 40 min. 
	UWAGA: Protokół można wstrzymać poprzez zamrożenie komórek przed sonikacją w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Załaduj supernatant do kobaltowej kolumny grawitacyjnej (średnica x długość: 2,5 cm x 10 cm) z ~10 ml kulek wstępnie zrównoważonych z 5-10 objętościami kolumny (CV) buforu do lizy.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 5 CV buforu B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glicerolu i 5 mM imidazolu) i 5 CV buforu C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% glicerolu i 5 mM imidazolu).</li>
	<li>Eluować białko z kulek za pomocą 2 CV buforu D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl i 250 mM imidazolu).</li>
	<li>Rozcieńczyć eluowane białko 5x buforem QA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% glicerol) dla kolumny Q.</li>
	<li>Przemyć 5 ml kolumny Q buforem QA w celu zrównoważenia kolumny, a następnie załadować rozcieńczoną próbkę do kolumny Q za pomocą pompy perystaltycznej (np. Rabbit).</li>
	<li>Załaduj kolumnę Q do maszyny HPLC wraz z buforem QA i buforem QB (50 mM Tris-HCl pH7,4, 1,5 M NaCl, 5% glicerolu). Ustaw natężenie przepływu na 1 ml/min.</li>
	<li>Uruchom program "mycie pompy", aby umyć maszynę z buforem QB, a następnie buforem QA (1-2 CV / każdy). Ustaw przepływ systemu na 3 ml/min.</li>
	<li>Ustaw UV1 na 280 nm i UV2 na 260 nm. Użyj płytki głębinowej 96, aby zebrać frakcje.</li>
	<li>Elute białka za pomocą stopniowego gradientu czynnika elucyjnego (bufor QB) stosując 3-4 CV każdego stężenia, zwiększając procent o 5% za każdym razem, zaczynając od 0% QB. Kompleks białkowy N0P wyjdzie przy 15% buforze QB.</li>
	<li>Gdy całe białko zostanie wymyte, przemyć kolumnę 100% buforem QB (2 CV).</li>
	<li>Wyizolować białko za pomocą filtracji żelowej Superdex 200 Increase 10/300 GL kolumny (średnica x długość: 1,0 cm x 30 cm) i zrównoważyć buforem E (20 mM HEPES, pH 7,4 i 200 mM NaCl).</li>
	<li>Analizuj frakcje zawierające białka za pomocą SDS-PAGE.</li>
</ol>
3. Montaż in vitro NC specyficznego dla wirusa 
UWAGA: Montaż in vitro specyficznego dla RSV NC (N:RNA) został przeprowadzony przez inkubację przygotowanego kompleksu N0P z oligonukleotydami RNA. Następnie zastosowano chromatografię SEC w celu oddzielenia kompleksu montażowego od N0P i nadmiaru RNA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).
<ol>
	<li>Wymieszać i inkubować oczyszczony kompleks N0P z oligo RNA o stosunku cząsteczkowym 1:1,5 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, zwykle 1 ml białka N0P o stężeniu 1 mg / ml wystarcza do następnego etapu. Ustawić próbkę kontrolną, która zawiera tylko taką samą ilość białka N0P.</li>
	<li>Wstępnie zrównoważyć kolumnę filtracji żelowej Superdex 200 Increase 10/300 GL z buforem E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 21,130 x g przez 15 minut, usunąć wszelkie osady i załadować supernatant do kolumny SEC.</li>
	<li>Porównaj obrazy chromatograficzne SEC próbki złożonej N: RNA i próbki kontrolnej N0P, połącz stosunek A260 / A280, aby określić, które piki są złożonym N-RNA, N0P i wolnym RNA.</li>
	<li>Zbierz frakcje pików, uruchom żel SDS-PAGE lub utwórz siatki.</li>
	<li>W celu złożenia kompleksu N-RNA zbierz wszystkie frakcje piku N-RNA, wykonaj ekstrakcję RNA i uruchom żel Urea-PAGE, aby dwukrotnie sprawdzić długość specyficznego RNA, która jest taka sama, jak zmieszana i inkubowana w pierwszym etapie.</li>
</ol>
4. Wykonywanie siatek z ujemnymi plamami
UWAGA: Mikroskopia elektronowa z ujemnym zabarwieniem (EM) to metoda, w której cząsteczki są adsorbowane do warstwy węglowej, a następnie zatapiane w warstwie atomów metali ciężkich. Barwienie ujemne EM zapewnia wysoki kontrast obrazu, dzięki czemu łatwo jest dostrzec i obliczeniowo wyrównać cząstki. Kolejną zaletą jest to, że adsorpcja cząstek do filmu węglowego zwykle skłania cząsteczki do przylegania do siatki w kilku preferowanych orientacjach. Gdy cząsteczki są w podobnej orientacji, łatwo jest podzielić je na strukturalnie odrębne klasy. Barwienie ujemne EM jest zatem odpowiednią techniką do przygotowania próbki25,26 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).
<ol>
	<li>Podgrzej w kuchence mikrofalowej lub podgrzej 5 ml ddH2O w małej szklanej zlewce za pomocą grzałki wolframowej, aż się zagotuje. </li>
	<li>Odważyć 37,5 mg mrówczanu uranylu i dodać do 5 ml podgrzanego ddH2O, aby uzyskać 0,75% roztwór barwiący mrówczan uranylu. Wymieszać pod zlewką pokrytą folią aluminiową, aby chronić przed światłem.</li>
	<li>Dodać 4 μl 10 M NaOH do roztworu barwiącego i kontynuować mieszanie przez 15 minut, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 mm do probówki.</li>
	<li>Użyj wyładowania jarzeniowego, aby ciągłe siatki EM pokryte węglem były hydrofilowe27. 
	UWAGA: Kratki umieszczone są w komorze podłączonej do źródła zasilania. Po przyłożeniu wysokiego napięcia gaz w komorze jonizuje, a ujemnie naładowane jony osadzają się na siatkach węglowych, nadając im hydrofilowość.</li>
	<li>Wytnij i złóż pasek parafilmu. Odpipetować 2 krople po 40 μl buforu po jednej stronie parafilmu i odpipetować kolejne 2 krople po 40 μl roztworu barwiącego na drugą stronę.</li>
	<li>Aby wykonać siatki węglowe EM, nałóż 3 μl próbki białka na 1 minutę.</li>
	<li>Osusz kratki na bibułce. 
	UWAGA: Kratki myje się 2x buforem i 1x 0,75% roztworem barwiącym mrówczan uranylu osusza się po każdym kroku.</li>
	<li>Przytrzymaj powierzchnię siatki w drugiej kropli 0,75% roztworu barwiącego mrówczanu uranylu przez 30 sekund.</li>
	<li>Zetrzyj siatkę na bibułce, aby usunąć nadmiar roztworu plamy i pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Przechowuj siatki w pudełku siatki przed obrazowaniem.</li>
</ol>

<ol><li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li>
<li>Lamb, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLamb%2C+RA+%22Fields+virology%22">Fields virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).</li>
<li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus%3A+virology%2C+reverse+genetics%2C+and+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li>
<li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses%3A+Inhibiting+the+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li>
<li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+is+directed+by+the+N%2C+P%2C+and+L+proteins%3B+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li>
<li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368(2020).</li>
<li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li>
<li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li>
<li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li>
<li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li>
<li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627(2016).</li>
<li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li>
<li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429(2013).</li>
<li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li>
<li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li>
<li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li>
<li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li>
<li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li>
<li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+chemically+competent+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li>
<li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy+Technique%22%5BJournal%5D)">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li>
<li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li>
<li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li>
<li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li>
<li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li>
<li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles%3A+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Interntional+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li>
<li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znane struktury cząstek podobnych do nukleokapsydu (NCLP) niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnym znaczeniu (NNS) pokazują, że złożone NCLP są kompleksem N z RNA komórki gospodarza, gdy są nadekspresyjne w bakteryjnych lub eukariotycznych systemach ekspresyjnych 15,16,17,18,19. Poprzednie badania próbowały uzyskać N wolny od RNA za pomocą różnych metod, takich...

Niesegmentowane wirusy RNA o ujemnym znaczeniu (NNS) zawierają wiele istotnych ludzkich patogenów, takich jak wścieklizna, Ebola i syncytialny wirus oddechowy (RSV)1,2. RSV jest główną przyczyną chorób układu oddechowego, takich jak zapalenie oskrzelików i zapalenie płuc u małych dzieci i osób starszych na całym świecie3. Obecnie nie są dostępne żadne skuteczne szczepionki ani terapie przeciwwirusowe zapobiegające lub leczące RSV4. W ramach cyklu życiowego genom RSV służy jako matryca do replikacji przez polimerazę RNA zależną od RNA RSV w celu wytworzenia antygenomu, który z kolei działa jako matryca do generowania genomu potomnego. Zarówno RNA genomu, jak i antygenomu są całkowicie zamknięte w nukleoproteinie (N), tworząc nukleokapsydy (NC)3. Ponieważ NC służą jako matryce zarówno do replikacji, jak i transkrypcji przez polimerazę RSV, prawidłowe złożenie NC ma kluczowe znaczenie dla polimerazy, aby uzyskać dostęp do matryc do syntezy RNA5. Co ciekawe, na podstawie analiz strukturalnych polimeraz wirusowych NNS przypuszcza się, że kilka białek N przejściowo dysocjuje od NC, aby umożliwić dostęp polimerazy i ponowne związanie się z RNA po syntezie RNA6,7,8,9,10,11,12.  
Obecnie, test polimeryzacji RSV RNA został opracowany przy użyciu oczyszczonej polimerazy RSV na krótkich szablonach nagiego RNA13,14. Jednak aktywność polimerazy RSV nie osiąga optymalnej wartości, co obserwuje się w produktach nieprocesowych i nieudanych wytwarzanych przez polimerazę RSV przy użyciu nagich matryc RNA. Brak NC z RNA specyficznym dla wirusa jest główną barierą dla dalszego mechanistycznego zrozumienia syntezy RNA RSV. Dlatego korzystanie z autentycznej matrycy RNA staje się krytyczną potrzebą do pogłębienia podstawowej wiedzy na temat syntezy RNA RSV. Znane struktury cząstek nukleokapsydopodobnych (NCLP) z RSV i innych wirusów RNA NNS ujawniają, że RNA w NCLP są albo losowymi komórkowymi RNA, albo średnimi wirusowymi genomowymi RNA15,16,17,18,19. Razem główną przeszkodą jest to, że N wiąże się niespecyficznie z komórkowymi RNA, tworząc NCLP, gdy N ulega nadekspresji w komórkach gospodarza.
Aby pokonać tę przeszkodę, opracowaliśmy protokół pozwalający najpierw uzyskać wolne od RNA (N0) i złożyć N0 z autentycznym wirusowym genomowym RNA w NCLPs20. Zasada tego protokołu polega na uzyskaniu dużej ilości rekombinowanego N wolnego od RNA (N0) poprzez koekspresję N z chaperonem, N-końcową domeną fosfoproteiny RSV (PNTD). Oczyszczony N0P może być stymulowany i łączony w NCLP przez dodanie oligonukleotydów RNA specyficznych dla RSV, a podczas procesu składania opiekun PNTD jest przemieszczany po dodaniu oligonukleotydów RNA.
Tutaj szczegółowo opisujemy protokół generowania i składania NC specyficznych dla RNA RSV. W tym protokole opisujemy klonowanie molekularne, przygotowanie białka, składanie in vitro i walidację złożenia złożonego. Zwracamy uwagę na strategię klonowania w celu wygenerowania bi-cistronicznych konstruktów do koekspresji białek do klonowania molekularnego. W przypadku przygotowania białka opisujemy procedury hodowli komórkowej, ekstrakcji białek i oczyszczania kompleksu białkowego. Następnie omówiono metodę składania in vitro NC specyficznych dla RNA RSV. Na koniec używamy chromatografii wykluczania wielkości (SEC) i mikroskopii elektronowej z ujemnym barwieniem (EM) do scharakteryzowania i wizualizacji zmontowanych NCLP.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>SIgma</td><td>A9539-500G</td><td>wytwarzanie konstruktu metodą LIC</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15</td><td>Miliporowy</td><td>UFC901024</td><td>zagęszczenia próbki białka</td></tr><tr><td>Ampicylina sodowa</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>5118.111317A</td><td>antybiotyk do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>AseI</td><td>NEB</td><td>R0526S</td><td>wytwarzanie konstruktu metodą LIC</td></tr><tr><td>Kobalt (Wysoka gęstość) Koraliki agarozy</td><td>Gold Bio</td><td>H-310-500</td><td>Do oczyszczania białka His-tag</td></tr><tr><td>Cyfrowy podgrzewacz do suchej kąpieli Corning LSE</td><td>CORNING</td><td>6885-DB</td><td>Podgrzej próbkę</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>10217016</td><td>wykonanie konstrukcji metodą LIC</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Invitrogen</td><td>10218014</td><td>wykonanie konstruktu metodą LIC</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-4L</td><td>roztwór do produkcji</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td>roztwór do produkcji</td></tr><tr><td>HiTrap Q HP</td><td>Sigma</td><td>GE29-0513-25</td><td>Oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I5513-100G</td><td>roztwór do wytwarzania</td></tr><tr><td>IPTG (izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd)</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>1116.071717A</td><td>indukuje ekspresję białek</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>do PCR</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator XL2020 Ultradźwiękowy procesor cieczy</td><td>SpectraLab</td><td>MSX-XL-2020</td><td>sonikator do lizy komórek</td></tr><tr><td>Siatki barwienia ujemnego</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>CF400-Cu-TH</td><td>Do wytwarzania siatek barwiących ujemne</td></tr><tr><td>Nowy Brunszwik Innova 44/44R</td><td>eppendorf</td><td>M1282-0000</td><td>Wytrząsarka do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Substytut</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td>roztwór do wytwarzania</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA OneTaq</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick QIAGEN</td><td></td><td>28706</td><td>Oczyszczanie</td></tr><tr><td>DNA SSPI-HF</td><td>NEB</td><td>R3132S</td><td>tworzenie konstrukcji metodą LIC</td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>Sigma</td><td>GE29-0915-96</td><td>Oczyszczanie białka</td></tr><tr><td>DNA T4 polimeraza</td><td>Sigma</td><td>70099-3</td><td>wytwarzanie konstrukcji metodą LIC</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Wirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-0816</td><td>Wirówka, najwyższa prędkość 20 000 obr./min</td></tr><tr><td>Chlorowodorek Trizma</td><td>Roztwór do wytwarzania</td><td>Sigma</td><td>T3253-250G</td></tr><tr><td>Mrówczan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>22451</td><td>wytwarzanie roztworu barwienia ujemnego</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Użycie autentycznego szablonu RNA jest kluczowe dla rozwoju podstawowej wiedzy na temat syntezy wirusowego RNA, która może kierować zarówno odkryciami mechanistycznymi, jak i rozwojem testów w wirusologii. Matryca RNA niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnym znaczeniu (NNS), takich jak syncytialny wirus oddechowy (RSV), nie jest samą cząsteczką RNA, ale raczej kompleksem rybonukleoproteinowym zamkniętym w nukleoproteinie (N). Pomimo znaczenia autentycznej matrycy RNA, generowanie i składanie takiego kompleksu rybonukleoproteinowego pozostaje wyrafinowane i wymaga dogłębnego wyjaśnienia. Głównym wyzwaniem jest to, że nadekspresja RSV N wiąże się niespecyficznie z komórkowymi RNA, tworząc losowe cząstki podobne do nukleokapsydu (NCLP). Tutaj ustaliliśmy protokół otrzymywania wolnego od RNA N (N0) najpierw poprzez koekspresję N z fosfoproteiną opiekuńczą (P), a następnie składanie N0 z oligonukleotydami RNA z sekwencją RNA specyficzną dla RSV w celu uzyskania nukleokapsydów specyficznych dla wirusa (NC). Protokół ten pokazuje, jak przezwyciężyć trudności w przygotowaniu tego tradycyjnie trudnego kompleksu rybonukleoprotein wirusa.

Oczyszczanie białka N0P wolnego od RNA 
Zgodnie z tym protokołem można uzyskać rozpuszczalny kompleks heterodimeryczny RSV N0P w dużej skali. Pełna długość białka N oraz część N-końcowa białka P zostały koekspresowane w E. coli z zastosowaniem 10X His-Tag na białku N. Kompleks N0P oczyszczano przy użyciu kolumny kobaltowej, chromatografii wymiany jonowej oraz chromatografii wykluczania żelowego. N0P zawiera zarówno pełnej długości białko N, jak i N-...

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N0) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Metoda ta wykorzystuje różne sposoby rozwiązania problemów związanych z ekspresją rekombinowanych białek wirusowych, stosując jedno białko wirusowe P jako chaperon dla innego białka wirusowego N w celu uzyskania białek N wolnych od RNA. Białko N wirusa RSV wolne od RNA jest otrzymywane przed złożeniem specyficznego dla wirusa RNA w nukleokapsyd in vitro. Metoda ta może być również stosowana w przypadku innych niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnej polarności. Metoda klonowania niezależnego od ligacji jest szybką techniką pozyskiwania konstruktów do koekspresji. Ponieważ elektronowa mikroskopia z barwieniem negatywowym jest szybką metodą sprawdzania dużych kompleksów w surowych komórkach, chcielibyśmy przekazać dwie wskazówki. Po pierwsze, należy uzyskać wysoką wydajność i wiarygodne wyniki na każdym etapie przed przejściem do kolejnego kroku. Po drugie, należy skonfigurować odpowiednie programy do chromatografii oraz poćwiczyć pobieranie siatek pęsetą.Aby uzyskać konstrukt bicistronowy do koekspresji białek N i P, należy wyhodować cztery jedno litrowe kultury komórek szczepu E coli BL21DE3 w pożywce LB w temperaturze 37°C. Gdy gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 0,6, należy obniżyć temperaturę do 16°C. Po godzinie należy indukować ekspresję białek, dodając 0,5 mM IPTG i inkubując kulturę przez noc. Następnego ranka komórki należy zebrać poprzez wirowanie, a osady resuspenderć w 200 ml buforu do lizy. Komórki należy poddać lizie za pomocą sonikacji przez 15 minut, stosując impulsy trwające trzy sekundy włączone i trzy sekundy wyłączone, a następnie zebrać lizaty przez wirowanie. Nadpłyn należy nałożyć na kobaltową kolumnę grawitacyjną o wymiarach 2,5 × 10 cm, zawierającą około 10 ml kulek uprzednio równoważonych 5–10 objętościami kolumny buforu do lizy, a następnie przemyć kolumnę pięcioma objętościami buforu B i pięcioma objętościami buforu C. Do elucji białka z kulek należy użyć dwóch objętości buforu D. Następnie należy zrównoważyć kolumnę Q, stosując pięć porcji po 1 ml buforu QA.Użyj pompy perystaltycznej, aby nanieść rozcieńczoną próbkę na kolumnę. Zamontuj załadowaną kolumnę Q w urządzeniu HPLC wraz ze świeżymi buforami QA i QB. Uruchom przemywanie pompy, aby skutecznie przemyć urządzenie od jedną do dwóch objętości buforów QB i QA.Po ostatnim płukaniu ustaw prędkość przepływu na 1 ml/min, a detektory UV1 na 280 nm i UV2 na 260 nm, wykorzystując płytkę 96-dołkową do głębokich studni do zbierania frakcji. Następnie zastosuj stopniowanie gradientowe, podając od trzech do czterech objętości każdego stężenia eluenta w celu elucji białek, zaczynając od 0% stężenia QB i zwiększając ten procent o 5% w każdym kroku. Kompleks białkowy N0 P zostanie elucyjny przy stężeniu buforu QB wynoszącym 15%.Wyizoluj białko metodą filtracji żelowej, wykorzystując kolumnę do oczyszczania w małej skali o wymiarach 1x30 cm, wyrównaną buforem E. Następnie przeanalizuj frakcje zawierające białko za pomocą elektroforezy SDS-PAGE.W celu specyficznego dla wirusa montażu nukleokapsydu, zmieszaj i inkubuj oczyszczony kompleks N0P z oligonukleotydem RNA w stosunku molowym 1:1,5 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Wstępnie zrównoważ kolumnę do żelowej filtracji do oczyszczania w małej skali za pomocą buforu E i usuń wszelkie osady poprzez wirowanie.Nanieś supernatant na kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczek. Porównaj obrazy z chromatografii wykluczania cząsteczek dla próbek kompleksu białko-RNA oraz próbek kontrolnych zawierających samo białko, uwzględniając wskaźniki czystości kwasów nukleinowych, aby zidentyfikować piki odpowiadające kompleksom N-RNA, białku N oraz wolnemu RNA. W celu wyizolowania kompleksu N-RNA zbierz wszystkie frakcje piku N-RNA, przeprowadź ekstrakcję RNA, a następnie wykonaj elektroforezę w żelu PAGE z mocznikiem, aby potwierdzić długość konkretnego RNA.Aby przygotować siatkę do barwienia negatywowego w celu przeprowadzenia elektronowej mikroskopii z barwieniem negatywowym, należy użyć płyty grzewczej, aby doprowadzić 5 mL wody dwukrotnie destylowanej do wrzenia, a następnie dodać do niej 37,5 mg uranyloformianu, aby otrzymać 0,75% roztwór barwiący uranyloformianu. Roztwór należy przenieść do zlewki przykrytej folią aluminiową i dodać cztery µL 10 M wodorotlenku sodu.Po 15 minutach mieszania w warunkach ochrony przed światłem, przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 mikrona do probówki. Aby uczynić siatki do mikroskopii elektronowej z ciągłą powłoką węglową hydrofilowymi, umieścić siatki w komorze podłączonej do zasilacza i przyłożyć do nich jony o ładunku ujemnym. Odciąć i złożyć pasek parafilmu o wymiarach dwóch na dwa cale. Nanieść dwie krople wody destylowanej o objętości 40 µL na jeden koniec paska oraz dwie krople 0,75% roztworu barwiącego uranylowo-formianowego o objętości 40 µL na drugi koniec. Nanieść 3 µL próbki białka na każdą siatkę. Po jednej minucie, przykładając siatki do papieru filtracyjnego, zanurzyć je dwukrotnie w kroplach wody destylowanej, a następnie raz w pierwszej kropli roztworu barwiącego. Następnie zanurzyć siatkę w drugiej kropli roztworu barwiącego na 30 sekund, po czym osuszyć siatki na papierze filtracyjnym, aby usunąć nadmiar roztworu barwiącego, i pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu przed obrazowaniem.Stosując niniejszy protokół, można uzyskać rozpuszczalny kompleks heterodimeryczny N0P wirusa RSV (oddechowego syncytialnego) w dużej skali. W komórkach E coli pełna długość białka N oraz fragmenty N-końcowe białek P są koekspresjonowane z 10X His-tagiem przyłączonym do białka N. Na podstawie współczynnika czystości kwasów nukleinowych mierzonego metodą absorbancji UV stwierdzono, że kompleks N0P zawierał zarówno pełną długość białka N, jak i N-końcowy fragment białka P, lecz nie zawierał komórkowego RNA.Oczyszczone N0P można było następnie stymulować i składać w cząstki przypominające nukleokapsydy na siatkach do mikroskopii elektronowej poprzez inkubację ze specyficznymi oligonukleotydami RNA, zgodnie z zaprezentowaną metodą.Podczas oczyszczania białka należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas oczyszczania kolumnowego oraz rozcieńczyć próbkę buforem QA w celu dostosowania pH i stężenia soli przed nałożeniem próbki na kolumnę. Należy uważać, aby trzymać siatki do mikroskopii elektronowej za zewnętrzną krawędź, aby uniknąć ich zanieczyszczenia.Pomoże to rozstrzygnąć kwestie dotyczące długoterminowego upakowania genomu RSV, w szczególności czy posiada on lewo- czy prawoskrętną strukturę helikalną. Po zastosowaniu tych procedur i uwierzytelnieniu matrycy RNA można przeprowadzić test aktywności polimerazy RSV, a tak przygotowany swoisty dla wirusa RSV nukleokapsyd może zostać wykorzystany do wysokorozdzielczej analizy cryo-EM.

generation-assembly-virus-specific-nucleocapsids-respiratory

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Generowanie i montaż wirusowo-specyficznych nukleokapsydów wirusa RSV (wirusowego zapalenia dróg oddechowych)

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Ten film przedstawia test do pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV). Wstępna inkubacja z surowicą zawierającą przeciwciała neutralizujące RSV neutralizuje cząsteczki wirusa, zmniejszając infekcję komórkową i tworzenie się blaszek miażdżycowych. Komórki zakażone wirusem są następnie poddawane utrwalaniu, blokowaniu i znakowaniu przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem w celu wizualizacji płytki nazębnej. Proces ten umożliwia identyfikację...

Test do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących specyficznego dla syncytialnego wirusa oddechowego

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (HRSV) może powodować ciężkie zapalenie oskrzelików u małych niemowląt. Część patogenezy ciężkiej choroby HRSV jest spowodowana odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Stymulacja pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych za pomocą HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania aktywacji szlaków zapalnych i infekcji.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Prezentujemy zoptymalizowany protokół in vitro do wytwarzania cząsteczek podobnych do wirusa SARS-CoV-2, które ściśle naśladują autentycznego wirusa. Takie podejście umożliwia badanie mechanizmów infekcji wirusowej, montażu i wychodzenia bez ograniczeń związanych z koniecznością posiadania laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3.

Produkcja systemu cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 do badania cykli życiowych wirusa in vitro

Poznaj metodę in vitro składania nukleokapsydów RSV przy użyciu fosfoproteiny P jako szaperonu dla wolnego od RNA nukleoproteiny N. Technika ta umożliwia uzyskanie rekombinowanych białek wirusowych i ma zastosowanie w badaniach nad innymi wirusami RNA.

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Przeglądaj więcej filmów