Ładowanie kulek białek i kwasów nukleinowych do przylegających komórek ludzkich

Ładowanie kulek to niedrogi test do ładowania membranowych, nieprzepuszczalnych cząstek do żywych przylegających komórek. Protokół ten okazał się niezwykle przydatny do ładowania sond dla pojedynczej komórki lub pojedynczej cząsteczki lub eksperymentów z mikroskopią fluorescencyjną. Ładowanie kulek pozwala naukowcom szybko ładować wszelkiego rodzaju cząsteczki, w tym białka, DNA, RNA, cząstki syntetyczne lub ich kombinację jednocześnie do pojedynczych komórek.

Podczas pierwszego załadunku ściegu ważne jest, aby przetestować siłę gwintowania. Linie komórkowe różnie reagują na obciążenie koralikami. W ten sposób liczba i siła gwintowników mogą być modyfikowane w celu optymalnego obciążenia komórek, jednocześnie minimalizując ich łuszczenie.

Aby zademonstrować procedurę, Matthew Saxton i ja dołączymy do naszych kolegów, dr Amandy Cook i Gabriela Galindo. Zacznij od zmierzenia około pięciu mililitrów szklanych koralików w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Dodać 25 mililitrów dwumolowego wodorotlenku sodu do probówki i delikatnie mieszać przez dwie godziny za pomocą shakera lub rotora.

Odkręć krótko rurkę z kulkami w wirówce, jeśli kulki są w zawiesinie, a następnie zdekantuj wodorotlenek sodu, zachowując jak najwięcej kulek. Dokładnie umyj kulki wodą z kultur komórkowych, aż pH będzie neutralne i za każdym razem przelewaj wodę. Użyj paska testowego pH na ściekach, aby potwierdzić neutralne pH, a następnie dokładnie umyj kulki 100% etanolem, dwa do trzech razy.

Dekantacja etanolu za każdym razem. Wysusz koraliki i posyp je tak, aby utworzyły cienką warstwę w sterylnym pojemniku. Następnie pozostaw pojemnik otwarty w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby wysuszyć kulki na powietrzu przez noc.

Delikatnie postukaj lub potrząśnij pojemnikiem i sprawdź, czy koraliki mają piaszczystą teksturę bez zbrylania się lub łuszczenia, aby upewnić się, że kulki są całkowicie suche. Dodaj kulki do aparatu i przykryj cały otwór komory na kulki za pomocą siatki polipropylenowej lub równoważnego materiału z otworami o średnicy 105 mikrometrów, aby umożliwić przejście kulek. Zacisnąć siatkę między męskim i żeńskim końcem metalowej komory obrazowania wielokrotnego użytku, a następnie szczelnie zamknąć ją woskową folią i sterylizować aparat UV przez 15 minut.

Aparat do ładowania kulek może być teraz używany do wykonywania setek testów obciążenia. Przechowywać aparat w suchym pojemniku wysuszonym żelem krzemionkowym lub innym środkiem osuszającym i zamknąć go. Jeśli kulki zostaną wyrzucone, dokładnie wysusz i wysterylizuj ładowarkę koralików i zastąp ją świeżymi kulkami, jak pokazano wcześniej.

Usuń pożywkę z komórek i delikatnie odessaj całą pożywkę z okolic krawędzi komory. Następnie przechyl komorę pod kątem około 45 stopni i usuń pozostałą kroplę pożywki ze środkowej mikrostudzienki. Delikatnie odpipetuj roztwór do ładowania kulek na szklaną mikrostudzienkę znajdującą się w środku komory.

Użyj aparatu do ładowania kulek, aby delikatnie rozprowadzić monowarstwę szklanych kulek na wierzchu komórek. Upewnij się, że koraliki całkowicie zakrywają komórki. Ściśnij komorę dwoma palcami, podnieś ją o około dwa cale i mocno opuść, używając siły w przybliżeniu równej upuszczeniu naczynia z tej wysokości, delikatnie dodaj pożywkę z powrotem do komory, powoli pipetując na plastikową stronę komory.

Zasysaj wszelkie pływające kulki bez naruszania komórek, cała procedura ładowania kulek powinna być wykonana stosunkowo szybko. Dzięki temu komórki nie wysychają, gdy nie mają pożywki. Następnie inkubuj komórki przez 4,5 do dwóch godzin w inkubatorze.

Przed obrazowaniem przemyj komórki trzykrotnie pożywką, aby usunąć kulki i nadmiar składników obciążających w roztworze ładującym. Wyobraź sobie komórki natychmiast lub gdy jest to wymagane w eksperymencie, korzystając z instrukcji zawartych w rękopisie tekstowym. Komórki, które zostały pomyślnie załadowane kulkami, prawie zawsze miały Cy3-Pa57 i A488-H3K11ac znakowane białka razem.

Jeden mikrogram plazmidowego DNA i kodującego GFP oraz 0,5 mikrograma białka znakowanego Cy3 wprowadzono również do komórek poprzez ładowanie perełkowe, wyrażone i uwidocznione. 40% komórek było naładowanych białkiem fab, a 21% komórek obciążonych kulkami wyraża plazmid obciążony rdzeniem. Komórki naładowane koralikami wyrażały różne poziomy plazmidu.

Wynik tego testu współczynnika Fishera wykazał, że chociaż białka 1 i 2 miały podobny rozkład intensywności, każde białko miało znacznie mniejszą dystrybucję niż plazmid. Poziomy białek naładowanych kulkami miały niewielką wariancję między komórkami, a poziomy dwóch jednocześnie załadowanych białek były ze sobą silnie skorelowane. Prawidłowe ładowanie kulek nie miało prawie żadnego zauważalnego wpływu na liczbę ludzkich komórek U2OS lub ich morfologię, gdy były obrazowane bezpośrednio przed, bezpośrednio po i 24 godziny po załadowaniu kulek.

Słabe ładowanie kulek z nadmierną siłą stukania i siłą stukania powodowało utratę komórek, słabą morfologię komórek i skupiska koralików pozostające na szkle nakrywkowym. Mimo że uważa się, że komórki ulegają uszkodzeniom mechanicznym podczas ładowania kulek, komórki rosły i rozmnażały się w prawidłowo załadowanej komorze koralików. Zaobserwowano również, że komórki obciążone kulkami ulegają podziałowi komórkowemu.

Linie komórkowe RPE1 i HeLa zostały załadowane koralikami fab, aby zademonstrować wszechstronność techniki ładowania kulek. Komórki U2OS były również wypełnione koralikami Cy5-RNA 9-mer i Cy3-DNA 28-mer razem. Próbując tego protokołu, upewnij się, że dodajesz do komórek tylko jedną warstwę koralików, ponieważ zbyt wiele koralików powoduje odłączanie się komórek.

Tak więc po krótkiej, 30-minutowej rekonwalescencji komórki ładujące koraliki są gotowe do obrazowania natychmiast lub kilka godzin lub dni później, jeśli procedura wymaga dalszych kroków, takich jak barwienie, można to również wykonać po okresie rekonwalescencji.