Name: Ładowanie kulek białek i kwasów nukleinowych do przylegających komórek ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj technikę ładowania kulek do wprowadzania białek, DNA i RNA do żywych komórek ssaczych. Ta metoda umożliwia efektywne dostarczanie makrocząsteczek do badań mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni członkom laboratorium Stasevich za niezliczone rozmowy, które pomogły ulepszyć i rozwinąć ten protokół. W szczególności dr Linda Forero i dr Phil Fox w celu uzyskania porad dotyczących ładowania kulek różnych typów komórek. Chcielibyśmy serdecznie podziękować dr Yoko Hayashi-Takanaka, dr Yuko Sato i dr Hiroshi Kimura za podzielenie się swoim protokołem ładowania szklanych kulek. Jesteśmy bardzo wdzięczni dr Ashokowi Prasadowi i dr Diego Krapfowi za hojne podzielenie się swoimi protokołami ładowania kulek w celu wprowadzenia cząstek nieorganicznych do komórek. Jesteśmy wdzięczni dr Travisowi Sandersowi, Craigowi Marshallowi i dr Thomasowi Santangelo za hojne podzielenie się ich znakowanym odczynnikiem RNA. ALK, MNS, CAC, GG i TJS były wspierane przez grant National Institutes of Health (NIH) R35GM119728 oraz grant National Science Foundation (NSF) CAREER MCB-1845761, oba dla TJS. CAC był również wspierany przez nagrodę NSF NRT DGE-1450032.

1. Oczyść, wysterylizuj i wysusz szklane koraliki, aby uniknąć zbrylania się i zapewnić równomierne rozprowadzenie na wierzchu komórek.
<ol>
	<li>Wysterylizuj około 5 ml szklanych kulek w wodorotlenku sodu (NaOH). Odmierz koraliki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 25 ml 2 M NaOH i delikatnie mieszać za pomocą shakera lub rotatora przez 2 godziny.</li>
	<li>Zdekantować NaOH, zachowując jak najwięcej kulek. Jeśli kulki są w zawiesinie, odwiruj krótko probówkę z kulkami w wirówce (1 min w temperaturze ~1000 × g, temperatura pokojowa).</li>
	<li>Dokładnie umyj kulki wodą z kultur komórkowych, aż pH będzie neutralne (użyj paska testowego pH na eluencie, aby potwierdzić neutralne pH). Za każdym razem dekantować wodę do mycia, tak jak poprzednio.</li>
	<li>Umyj koraliki dokładnie 100% etanolem 2-3x. Za każdym razem dekantować etanol, tak jak poprzednio.</li>
	<li>Wysuszyć koraliki. Posyp koraliki, aby utworzyły cienką warstwę wewnątrz sterylnego pojemnika (takiego jak szalka Petriego o średnicy 10 cm). Pozostawiając pojemnik otwarty, pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego na noc. Upewnij się, że kulki są całkowicie suche, stukając lub delikatnie potrząsając pojemnikiem i sprawdzając, czy kulki mają piaszczystą teksturę bez zbrylania się lub łuszczenia.</li>
	<li>Sterylizuj suche kulki promieniami UV przez 15 minut.</li>
</ol>
2. Zmontuj urządzenie do ładowania koralików.
<ol>
	<li>Przymocuj łatkę siatki (polipropylen lub równoważny materiał, otwory 105 μm, aby umożliwić przejście koralików), aby zakryć cały otwór komory na koraliki taśmą lub zaciskając siatkę między męskim i żeńskim końcem metalowej komory obrazowania wielokrotnego użytku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Sterylizuj aparat promieniami UV przez 15 minut. Dodaj koraliki do aparatu i szczelnie zamknij go woskową folią. 
	UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby koraliki były całkowicie czyste i suche. Powinny być luźne i wyglądać na piaszczyste, bez grudek. Jeśli tak się nie stanie, ponownie umyj i całkowicie wysusz koraliki.</li>
	<li>Przechowywać aparat w szczelnym, suchym pojemniku wysuszonym żelem krzemionkowym lub innym środkiem osuszającym. Jeśli koraliki ulegną zawilgoceniu, co będzie widoczne przez zbrylanie się koralików, dokładnie wysusz i wysterylizuj ładowarkę do koralików, a następnie zastąp ją świeżymi. 
	UWAGA: Wszystkie te środki ostrożności zapobiegną rozwojowi pleśni lub bakterii na lub wokół koralików w ładowarce koralików. Aparat do ładowania koralików może być wykonany na różne sposoby. Zapoznaj się ze szczegółami w dyskusji.</li>
</ol>
3. Przygotuj komory ze szklanym dnem z przylegającymi komórkami.
<ol>
	<li>Wysiewać przylegające komórki ssaków do komory o szklanym dnie o średnicy 35 mm. Upewnij się, że ogniwa są w około 80% zlewające się w momencie ładowania ściegu. (Patrz Tabela 1, aby uzyskać więcej informacji na temat różnych typów ogniw i uwagi na temat skuteczności ładowania kulek w różnych typach komórek). 
	UWAGA: Komórki można wysiewać tylko w mikrostudzience w środku komory, aby zachować liczbę użytych komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki w normalnych warunkach, aż całkowicie przylegają do szkła. 
	UWAGA: Istotne jest, aby gęstość komórek była wystarczająco wysoka i aby komórki były bezpiecznie przylegające do szkła. Jeśli te wymagania nie zostaną spełnione, komórki prawdopodobnie odkleją się podczas ładowania ściegu. Czas między wysiewem komórek a ładowaniem kulek można wydłużyć, aby zapewnić prawidłową adhezję komórek i zbieganie się.</li>
</ol>
4. Komórki wczytujące koraliki
UWAGA: Jeśli to konieczne, krótko przemyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie dodaj 2 ml optymalnej pożywki. Inkubować przez co najmniej 30 minut.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór o objętości 3-8 μl zawierający pożądane plazmidy, białko i/lub cząstki. Użyj ~1 μg (0,1-1 pmol) każdego typu plazmidu i ~0,5 μg (0,01 nmol) białka, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Użyj rurki o niskiej retencji do białek, aby nie pozostały one na ściankach rurki. Doprowadź roztwór do minimum 3 μl za pomocą PBS i dostosuj objętość roztworu tak, aby pokryć cały obszar komórek, które mają być załadowane (tj. mikrostudzienkę komory, <silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Dokładnie wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół i/lub przesuwając probówkę. Na krótko odwiruj roztwór do dna probówki w stołowym mikrofuge.</li>
	<li>Przenieś roztwór ładujący kulki i komorę komórek do kaptura do hodowli tkankowej. Pozostałe kroki należy wykonać w kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnej techniki.</li>
	<li>Usuń pożywkę z komórek i tymczasowo przechowuj ją w sterylnej probówce. Delikatnie zassaj całe medium z okolic krawędzi komory i przechyl komorę pod kątem około 45° i usuń pozostałą kroplę pożywki ze środkowej mikrostudzienki. Podczas usuwania podłoża należy unikać dotykania końcówki pipety do szkła, co może spowodować łuszczenie się i utratę komórek. Przejdź szybko do następnego kroku, aby komórki nie wyschły długo.</li>
	<li>Delikatnie odpipetuj roztwór ładujący kulki do szklanej mikrostudzienki na środku komory. Opcjonalnie: Inkubować z delikatnym kołysaniem przez ~30 s, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia komory.</li>
	<li>Delikatnie rozprowadź monowarstwę szklanych kulek na wierzchu komórek, najlepiej za pomocą urządzenia do ładowania kulek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Upewnij się, że kulki całkowicie zakrywają komórki w mikrostudzience ze szklanym dnem.</li>
	<li>Ściskając komorę dwoma palcami, uderz nią o powierzchnię okapu, podnosząc ją na ~2 cale i mocno opuszczając. Użyj siły w przybliżeniu równej upuszczeniu naczynia z tej wysokości. Powtórz w sumie ~10 stuknięć. 
	UWAGA: Upewnij się, że krany nie odklejają się znacząco od komórek. Stukanie można zoptymalizować pod kątem typu ogniwa. Jeśli komórki ładują się słabo, stuknij mocniej; Jeśli jednak wiele komórek odkleja się, stuknij delikatniej.</li>
	<li>Delikatnie dodaj pożywkę z powrotem do komory, powoli pipetując na plastikową stronę komory. Spróbuj zassać wszelkie pływające koraliki bez naruszania komórek. Na tym etapie dodaj więcej wstępnie podgrzanego nośnika, jeśli usunięto zbyt dużo. Inkubować komórki przez 0,5-2 godziny w inkubatorze.</li>
	<li>Sterylizuj UV ładowarkę koralików przez 15 minut przed powrotem do przechowywania w warunkach wysuszania.</li>
	<li>Dodaj barwnik (np. barwnik ligandowy DAPI lub HaloTag, jeśli jest to wymagane w eksperymencie) do komórek zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta.</li>
	<li>Umyj komórki 3x pożywką przed obrazowaniem, aby usunąć kulki i nadmierne składniki ładujące w roztworze. Należy unikać pipetowania bezpośrednio na komórki, aby zapobiec ich łuszczeniu się.</li>
</ol>
5. Obrazowanie komórek obciążonych koralikami
<ol>
	<li>Zobrazuj komórki natychmiast lub gdy wymaga tego eksperyment. Użyj mikroskopu zdolnego do uchwycenia fluorescencji (lasery lub monochromatyczne źródło światła). Upewnij się, że długości fal wzbudzenia są odpowiednie dla wybranego fluoroforu lub barwnika (np. światło o długości fali 488 nm dla białka zielonej fluorescencji (GFP)). 
	UWAGA: Białka obciążone kulkami mogą być obrazowane po odzyskaniu sprawności przez komórki (już po 30 minutach od załadowania dla opisanych tutaj linii komórkowych). Ekspresja plazmidu trwa ≥2 godziny w zależności od elementów wektora ekspresji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C i dalsze wyjaśnienie w dyskusji). Obrazowanie komórek obciążonych kulkami można przeprowadzić na dowolnym mikroskopie wyposażonym w odpowiednie źródła fluorescencyjne związane z załadowanymi sondami, kamerą zdolną do rejestrowania obrazów fluorescencyjnych, taką jak urządzenie ze sprzężeniem ładunku zwielokrotniającym elektrony (EMCCD) lub naukową kamerę z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (sCMOS) oraz inkubator do kontrolowania temperatury, wilgotności i dwutlenku węgla. Przewodnik po mikroskopii fluorescencyjnej znajduje się w 27.</li>
</ol>

<ol><li>Stewart, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+strategies+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery.</a> Nature. 538 (7624), 183-192 (2016).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).</li>
<li>Schenborn, E. T., Goiffon, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEAE-dextran+tansfection+of+mammalian+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DEAE-dextran tansfection of mammalian cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 130, 147-153 (2000).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+somatic+cells+with+micropipettes%3A+comparison+with+other+transfer+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques.</a> Biochemical Journal. 223 (2), 281-291 (1984).</li>
<li>Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+monoclonal+antibodies+into+mammalian+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15494-15500 (1989).</li>
<li>Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+electroinjection+method+for+introducing+proteins+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells.</a> American Journal of Physiology. 260 (2), 355-363 (1991).</li>
<li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 62 (1), 1-6 (2003).</li>
<li>Fawell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat-mediated+delivery+of+heterologous+proteins+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (2), 664-668 (1994).</li>
<li>Prior, T. I., FitzGerald, D. J., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+mediated+by+domain+II+of+Pseudomonas+exotoxin+A%3A+transport+of+barnase+into+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol.</a> Biochemistry. 31 (14), 3555-3559 (1992).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3185-3190 (2001).</li>
<li>Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+single+molecule+microscopy+reveals+two+kinetically+distinct+pathways+for+microRNA+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly.</a> EMBO Reports. 13 (8), 709-715 (2012).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (4), 1556-1564 (1984).</li>
<li>Ortiz, D., Baldwin, M. M., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+correction+of+genetic+defects+in+cultured+animal+cells+by+introduction+of+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient correction of genetic defects in cultured animal cells by introduction of functional proteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 3012-3017 (1987).</li>
<li>McNeil, P. L., Warder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glass+beads+load+macromolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Glass beads load macromolecules into living cells.</a> Journal of Cell Science. 88 (5), 669-678 (1987).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Research. 39 (15), 6475-6488 (2011).</li>
<li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352 (6292), 1425-1429 (2016).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li>
<li>Zhao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+probe+for+imaging+nascent+and+mature+HA-tagged+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded probe for imaging nascent and mature HA-tagged proteins in vivo.</a> Nature Communications. 10 (1), 2947(2019).</li>
<li>Jedlitzke, B., Mootz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocaged+nanobodies+delivered+into+cells+for+light+activation+of+biological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhotoChem%22%5BJournal%5D)">Photocaged nanobodies delivered into cells for light activation of biological processes.</a> ChemPhotoChem. 5 (1), 22-25 (2021).</li>
<li>Coulon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+competition+during+the+transcription+cycle+results+in+stochastic+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Kinetic competition during the transcription cycle results in stochastic RNA processing.</a> eLife. 3, 03939(2014).</li>
<li>Pichon, X., Robert, M. -C., Bertrand, E., Singer, R. H., Tutucci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+generations+of+MS2+variants+and+MCP+fusions+to+detect+single+mRNAs+in+living+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New generations of MS2 variants and MCP fusions to detect single mRNAs in living eukaryotic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 121-144 (2020).</li>
<li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+dynamics+of+IRES+and+cap+translation+with+single-molecule+resolution+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying the dynamics of IRES and cap translation with single-molecule resolution in live cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27, 1095-1104 (2020).</li>
<li>Moon, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+single-molecule+tracking+of+mRNA+interactions+with+RNP+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Multicolor single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules.</a> Nature cell biology. 21 (2), 162-168 (2019).</li>
<li>Moon, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+translation+quality+control+and+mRNA+targeting+to+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules.</a> Journal of Cell Biology. 219 (8), 202004120(2020).</li>
<li>Cialek, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+translational+control+by+Argonaute+with+single-molecule+resolution+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Forero-Quintero, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+spatiotemporal+organization+of+endogenous+RNA+polymerase+II+phosphorylation+at+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the spatiotemporal organization of endogenous RNA polymerase II phosphorylation at a single gene.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Lyon, K., Aguilera, L. U., Morisaki, T., Munsky, B., Stasevich, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+single+RNA+imaging+reveals+bursts+of+translational+frameshifting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell single RNA imaging reveals bursts of translational frameshifting.</a> Molecular Cell. 75 (1), 172-183 (2019).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Fluorescence+Microscopy.+General+Laboratory+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Introduction to Fluorescence Microscopy. General Laboratory Techniques.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., Yamagata, K., Nozaki, N., Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+histone+modifications+in+living+cells%3A+spatiotemporal+dynamics+of+H3+phosphorylation+during+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing histone modifications in living cells: spatiotemporal dynamics of H3 phosphorylation during interphase.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 781-790 (2009).</li>
<li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+viability+by+the+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell viability by the MTT assay.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Stasevich, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RNA+polymerase+II+activation+by+histone+acetylation+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells.</a> Nature. 516 (7530), 272-275 (2014).</li>
<li>Besteiro, S., Michelin, A., Poncet, J., Dubremetz, J. -F., Lebrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+a+Toxoplasma+gondii+rhoptry+neck+protein+complex+at+the+host+cell+membrane+to+form+the+moving+junction+during+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion.</a> PLOS Pathogens. 5 (2), 1000309(2009).</li>
<li>Gilmore, A. P., Romer, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+focal+adhesion+kinase+%28FAK%29+signaling+in+focal+adhesions+decreases+cell+motility+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of focal adhesion kinase (FAK) signaling in focal adhesions decreases cell motility and proliferation.</a> Molecular Biology of the Cell. 7 (8), 1209-1224 (1996).</li>
<li>Emerson, N. T., Hsia, C. -H., Rafalska-Metcalf, I. U., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanodelivery+of+nanoparticles+to+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Mechanodelivery of nanoparticles to the cytoplasm of living cells.</a> Nanoscale. 6 (9), 4538-4543 (2014).</li>
<li>Manders, E. M. M., Kimura, H., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+of+DNA+in+living+cells+reveals+the+dynamics+of+chromosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics of chromosome formation.</a> Journal of Cell Biology. 144 (5), 813-822 (1999).</li>
<li>Memedula, S., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+recruitment+of+HAT+and+SWI%2FSNF+components+to+condensed+chromatin+by+VP16%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16.</a> Current Biology. 13 (3), 241-246 (2003).</li>
<li>Becker, T., Volchuk, A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+use+of+endoplasmic+reticulum+membrane+for+phagocytosis+in+J774+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential use of endoplasmic reticulum membrane for phagocytosis in J774 macrophages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4022-4026 (2005).</li>
<li>Molenaar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+telomere+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+PNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes.</a> The EMBO Journal. 22 (24), 6631-6641 (2003).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nature Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li>
<li>Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+origin+of+heterogeneous+anomalous+diffusion+in+the+cytoplasm+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells.</a> Physical Review Letters. 125 (5), 053901(2020).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+system+to+track+histone+modification+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded system to track histone modification in vivo.</a> Scientific Reports. 3, 2436(2013).</li>
<li>Sato, Y., Stasevich, T. J., Kimura, H. Visualizing the dynamics of inactive X chromosomes in living cells using antibody-based fluorescent probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSato%2C+Y+%22X-Chromosome+Inactivation.+Methods+in+Molecular+Biology%22">X-Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology</a>. 1861, Humana. New York, NY, USA. 91-102 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj technika ładowania kulek jest opłacalną i efektywną czasowo metodą wprowadzania makrocząsteczek i innych cząstek do przylegających komórek. Ten wszechstronny proces może obciążyć białko (ryc. 2A) 15,16,26,27, kombinację białka i plazmidów (ryc. 2B, C) 22,25, RNA (ryc. 4C), kulki polistyrenowe o długości 100 i 250 nm (korespondencja osobista), barwniki syntetyczne39 lub kropki kwantowe34,40. Obciążenie kulkami może mieć również możliwość ładowania innych rodzajów cząstek nieprzepuszczalnych dla membrany. Jego najczęściej stosowanym zastosowaniem jest ładowanie przeciwciał lub Fab w celu celowania w endogenne epitopy, takie jak modyfikacje potranslacyjne (PTM), do żywych komórek. Cele, takie jak PTM, są często trudne do oznakowania w żywych komórkach bez ustalonych, specyficznych dla PTM, genetycznie kodowanych sond 41,42. W przeciwieństwie do tego, ładowanie kulek może wprowadzić wiele typów sond, reporterów lub innych narzędzi molekularnych razem do tej samej komórki w celu jednoczesnego monitorowania wielu odczytów. Przewidujemy, że ładowanie kulkowe będzie przydatną techniką ładowania różnych makrocząsteczek lub cząstek.
Główną zaletą ładowania koralików jest niski koszt: każdy eksperyment kosztuje mniej niż 0,01 USD. Urządzenie do ładowania koralików można łatwo wykonać przy użyciu niedrogich materiałów kosztujących łącznie ~ 150 USD, co jest znacznie tańsze niż jakakolwiek inna metoda ładowania komórek. Koszt urządzenia do ładowania koralików można jeszcze bardziej obniżyć do mniej niż 10 USD, zastępując metalową komorę wielokrotnego użytku plastikową. W tym celu wywierć otwór w komorze 35 mm lub wyjmij szkło z komory ze szklanym dnem 35 mm, a następnie bezpiecznie przymocuj siatkę taśmą. Zamiast aparatu, ładowanie kulek można nawet przeprowadzić za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze 1000 μl do nabierania i rozsypywania kulek na komórkach, chociaż ta odmiana utrudnia nasypywanie monowarstwy kulek na komórki (krok 4.6).
Inną korzyścią z ładowania kulek jest to, że komórki mogą zachować normalną ogólną morfologię, szybko się regenerować i nadal rosnąć i dzielić, przynajmniej dla badanych tutaj komórek U2OS, RPE1 i HeLa oraz dla innych linii komórkowych badanych gdzie indziej (ryc. 3; Rysunek 4A,B; Dodatkowy film 1; oraz w tabeli 1)31. Podczas ładowania kulek komórki są poddawane stresowi fizycznemu, a czasami przemieszczają się i łuszczą (~ 5% komórek złuszcza się w optymalnych warunkach, ale większa utrata komórek może nastąpić, jeśli ładowanie kulek jest wykonywane zbyt mocno lub zbyt wiele szklanych kulek jest ładowanych na komórki, jak pokazano na rysunku 3B). Jednak komórki obciążone kulkami, które pozostają przyczepione do szkiełka nakrywkowego, zwykle wyglądają na zdrowe i można je zobrazować już po 30 minutach od obciążenia ściegu (ryc. 3A). Generalnie pozwalamy komórkom na 30-minutowy okres rekonwalescencji, ale przewidujemy, że możliwe jest szybsze obrazowanie po obciążeniu kulki.
Główną wadą tej techniki jest to, że komórki muszą być w stanie wytrzymać niewielkie naprężenia fizyczne podczas ładowania i bezpiecznie przylegać do szkiełka nakrywkowego. Słabo/nieprzylegające linie komórkowe lub komórki wyhodowane na powlekanych płytkach (np. HEK i komórki macierzyste) często odrywają się po delikatnym stuknięciu podczas ładowania ściegów. Co więcej, doświadczenie wykazało, że neurony pierwotne są zbyt wrażliwe na obciążenie koralikami.
Ładowanie kulkowe najlepiej nadaje się do eksperymentów z pojedynczymi komórkami lub pojedynczymi cząsteczkami. Z naszego doświadczenia wynika, że ładowanie kulkami ma około 20-40% wydajności ładowania białka, a ~ 20% komórek obciążonych kulkami również wyrażało współobciążony plazmid (Figura 2A, B). W związku z tym plazmidy ładujące kulki mogą być mniej wydajne w ekspresji białek niż białka oczyszczone ładowane kulkami, ponieważ plazmidy muszą nie tylko dostać się do komórek, ale także ulec ekspresji (co obejmuje między innymi import jądrowy, transkrypcję i translację, z których każda może obniżyć wydajność ekspresji). Niska skuteczność ekspresji plazmidu obciążonego kulkami może być ominięta poprzez zastosowanie alternatywnych protokołów transfekcji, takich jak lipofekcja, przed załadowaniem białek perełkowych lub sond16,27. Dodatkowo, inkubacja komórek w optymalnym podłożu przez 30 minut przed załadowaniem kulek może wspomóc ekspresję plazmidu. Ze względu na niską ekspresję plazmidu, ładowanie kulkami nie było często stosowane jako alternatywa dla transfekcji opartej na lipofekcji w tym laboratorium. Jedynym wyjątkiem jest sytuacja, gdy oczyszczone białko, takie jak Fab, ma być jednocześnie ładowane, w którym to przypadku całkiem wygodne jest jednoczesne ładowanie białka i plazmidu za pomocą kulek. Co więcej, w przypadku komórek, które nie reagują lub nie tolerują lipofekcji, ładowanie kulkami może stanowić alternatywną, choć mało wydajną, metodę przejściowej ekspresji plazmidu.

Ładowanie makromolekuł do komórek ssaków wymaga metodologii, która pozwala im przekroczyć błonę plazmatyczną komórki1. Kilka metod może wprowadzić plazmidy do komórek ssaków poprzez transfekcję, w tym transfekcja liposomalna2 i transfekcja dietyloaminoetylo-dekstranu3. Jednak metody ładowania białek lub cząstek nieprzepuszczalnych dla błony do komórek są bardziej ograniczone.
Kilka technik ominęło tę trudną przeszkodę, stosując różne strategie. Po pierwsze, mikroiniekcja dostarcza cząstki przez mikropipetę do żywych komórek pod mikroskopem4. Chociaż jest to prawdopodobnie najbardziej kontrolowana i najmniej inwazyjna metoda, technika ta ma stosunkowo niską przepustowość, ponieważ komórki muszą być ładowane jedna po drugiej. Ponadto mikroiniekcja wymaga specjalistycznego sprzętu i jest wymagająca technicznie.
Po drugie, elektroporacja to sposób na elektro-wstrzykiwanie białek do komórek poprzez zakłócenie błony wywołane napięciem5,6,7. Jednak ta metoda ponownie wymaga specjalistycznego, drogiego sprzętu, a wstrząs może powodować stres komórkowy i śmiertelność. Ponadto komórki muszą być trypsynizowane przed elektroporacją, a następnie ponownie platerowane, co ogranicza ramy czasowe, w których komórki mogą być badane po elektroporacji.
Po trzecie, błony komórkowe mogą być chemicznie modyfikowane w celu tymczasowej, odwracalnej przepuszczalności8,9. Ładowanie streptolizyną-O wprowadza endotoksynę do błon komórkowych, która tworzy tymczasowe pory, umożliwiając egzogennym cząstkom nieprzepuszczalnym dla błony, w tym białkom i plazmidom DNA, przedostanie się do komórek10. Po 2 godzinach rekonwalescencji około połowa komórek naprawia te pory i zatrzymuje internalizujące cząsteczki z roztworu. Jednak ta technika wymaga długiego czasu rekonwalescencji i jest niekompatybilna z typami komórek, które nie tolerują endotoksyn.
Po czwarte, mechaniczne zakłócenia ładują cząstki do komórek poprzez fizyczne zakłócenia błony komórkowej11. Można to zrobić na wiele sposobów, w tym drapanie, skrobanie i zwijanie koralików na komórkach12,13. Już w 1987 roku koraliki były używane do mechanicznego ładowania białek do komórek14. Ostatnio technika ładowania kulek została zoptymalizowana i dostosowana poza białkami, aby uwzględnić ładowanie plazmidów i RNA, jak opisano tutaj.
Ładowanie koralików to łatwa, tania i szybka metoda ładowania białek i plazmidów do przylegających komórek ludzkich. Szklane kulki są na krótko zwijane na komórki, tymczasowo naruszając ich błonę komórkową. Pozwala to na przedostanie się cząstek w roztworze. Ponieważ ładowanie kulkowe ma niską wydajność, najlepiej nadaje się do eksperymentów mikroskopowych na pojedynczych cząsteczkach lub pojedynczych komórkach. Ładowanie kulkami może wprowadzić szeroką gamę białek, w tym rozdrobnione przeciwciała (Fab),15,16 oczyszczonych białek, takich jak scFvs,17 intrabodies,18,19, lub białka płaszcza mRNA, np. MS2 coat protein (MCP)20,21. Wektory ekspresji plazmidu mogą być również dodawane do roztworu białkowego i jednocześnie ładowane kulkami22,23,24,25.
Poza białkami i plazmidami, cząsteczki o wielkości 250 nm z polistyrenu zostały wprowadzone do komórek poprzez ładowanie kulek (komunikacja osobista). Ładowanie koralików jest niewiarygodnie tanie, kosztuje mniej niż 0,01 USD za eksperyment z materiałami i nie wymaga dodatkowego drogiego sprzętu. Koszt jest dodatkowo zmniejszony poprzez zminimalizowanie liczby sond używanych w eksperymencie, ponieważ ładowane są tylko komórki w centralnej mikrostudzience o średnicy 14 mm komory obrazowania. Należy zauważyć, że ograniczona powierzchnia załadunku oznacza, że załadunek stopek nie jest idealny do załadunku ogniw masowych.
Ten manuskrypt przedstawia proces ładowania koralików, w tym jak skonstruować urządzenie do ładowania koralików i przeprowadzić eksperyment. Pokazuje to, że białka, RNA i DNA mogą być ładowane do różnych typów komórek i że dwa różne, jednocześnie naładowane kulkami białka mają wysoce skorelowane stężenia komórkowe i stosunkowo niską wariancję. Omówiono również różnice w protokole w zależności od typu komórki i obciążenia białkiem, plazmidem lub RNA. Chociaż uważa się, że kulki perforują i rozrywają błonę komórkową, odpowiednio przeprowadzony proces ładowania kulek usuwa tylko niewielką liczbę komórek z dna komory obrazowania. Po krótkim okresie rekonwalescencji komórki nadal rosną i dzielą się. Ta metodologia jest idealna do eksperymentów z mikroskopią żywych komórek, w tym śledzenia pojedynczych cząsteczek białek i RNA, wykrywania modyfikacji potranslacyjnych, obserwacji dynamicznych mechanizmów komórkowych lub monitorowania lokalizacji subkomórkowej15,16,22,26,27.

<table><tbody><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych 10 cm</td><td>VWR</td><td>82050-916</td><td>Służy do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Służy do budowy ładowarki perełkowej</td></tr><tr><td>Attofluor Komora komórkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>Służy do budowy niestandardowej ładowarki koralików</td></tr><tr><td>DMEM, o wysokiej zawartości glukozy, bez glutaminy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960069</td><td>Zastosowanie w komórce ogólnej kultura</td></tr><tr><td>Drierite Indicating Absorbents</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-578-3B</td><td>Przechowuj ładowarkę kulek w eksykatorze z tymi chłonnymi granulkami</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Atlas Biologics</td><td>F-0050-A Stosować</td><td>w ogólnej hodowli komórkowej i jako suplement przed załadowaniem kulek</td></tr><tr><td>Koraliki szklane, myte kwasem &le; 106 &mikro; m *</td> <td>Millipore Sigma</td><td>G4649</td><td>Posyp komórki, aby załadować plazmidowe DNA i białka</td></tr><tr><td>Naczynia szklane, 35 mm, #1,5, szkło 14 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1,5-14-C</td><td>Komórki nasienne do tych komór do obrazowania</td></tr><tr><td>L-glutaminy-200 mM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Służy do wytwarzania DMEM + podłoża</td></tr><tr><td>Opti-MEM, Medium o zredukowanej surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Optymalna pożywka do inkubacji komórek przed załadowaniem kulek (krok opcjonalny)</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-032</td><td>folia woskowa używana do budowy ładowarki perełkowej</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Służy do wytwarzania DMEM + podłoża</td></tr> Bez <tr><td>fenolu DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31053036</td><td>Stosować na komórkach przed obrazowaniem</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>Zapas roboczy sterylnego wodorotlenku</td></tr><tr><td>sodu 1X PBS (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>Użyj 2 M roztworu do mycia szklanych kulek</td></tr><tr><td>Filtry tkane z siatki Spectra, polipropylen, 105 i mikro; m otwarcie</td><td>Spectrum Labs</td><td>148496</td><td>Służy do budowy ładowarki perełkowej</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300062</td><td>Zastosowanie w ogólnej hodowli komórkowej</td></tr></tbody></table>

Ładowanie kulek białek i kwasów nukleinowych do przylegających komórek ludzkich

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

Wiele eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek wykorzystuje egzogenne cząstki (np. peptydy, przeciwciała, kulki) do oznaczania lub funkcjonowania w komórkach. Jednak wprowadzenie białek do komórki przez jej błonę jest trudne. Ograniczony wybór obecnych metod boryka się z niską wydajnością, wymaga drogiego i wymagającego technicznie sprzętu lub funkcji w wąskich parametrach. Tutaj opisujemy stosunkowo prostą i opłacalną technikę ładowania DNA, RNA i białek do żywych komórek ludzkich. Obciążenie kulkami indukuje tymczasowe mechaniczne zakłócenie błony komórkowej, umożliwiając makrocząsteczkom przedostanie się do przylegających, żywych komórek ssaków. Przy cenie poniżej 0,01 USD za eksperyment, ładowanie koralików jest najtańszą dostępną metodą ładowania komórek. Co więcej, obciążenie kulkami nie obciąża znacząco komórek ani nie wpływa na ich żywotność lub proliferację. Manuskrypt ten opisuje etapy procedury ładowania ściegu, adaptacje, zmiany i ograniczenia techniczne. Metodologia ta jest szczególnie przydatna do obrazowania żywych komórek, ale stanowi praktyczne rozwiązanie dla innych zastosowań wymagających wprowadzenia białek, kulek, RNA lub plazmidów do żywych, przylegających komórek ssaków.

Najczęstszym zastosowaniem wprowadzania za pomocą kulek (bead loading) jest dostarczenie jednego lub kilku typów białek do adherentnych ludzkich komórek. Aby to zilustrować, do komórek wprowadzono za pomocą kulek roztwór białka Fab skoniugowanego z Cy3 i Alexa488. Chociaż nie każda komórka w mikrodoubliezku została poddana tej procedurze, komórki, w których wprowadzono białka, niemal zawsze zawierały jednocześnie białka znakowane Cy3 i Alexa488 (Rysunek 2A). Zgodnie z wcześniejszymi szacunkami, gdy za pomocą kulek wprowadza się 0,5 µg Fab rozcieńczonego w 4 µl29, jak pokazano na Rysunku 2A, do każdej komórki dostarczanych jest około 106 cząsteczek Fab.
Do komórek wprowadzono również za pomocą załadunku koralikowego plazmidowe DNA kodujące GFP (1 µg plazmidowego DNA, 1,8 µL roztworu o stężeniu 557 ng/µL) oraz 0,5 µg Fab znakowanego Cy3, które następnie wykazano w ekspresji i wizualizacji (Rycyna 2B). Fluorescencja GFP wskazała, że plazmid kodujący GFP został nie tylko wprowadzony do komórek, ale również wykazano jego ekspresję. Zatem w tej samej komórce załadunek koralikowy może wprowadzić sondę białkową (np. Fab znakowany Cy3) oraz plazmid reporterowy (np. GFP), zgodnie z procedurami przeprowadzonymi wcześniej w tym laboratorium22,23,24. Ustalono, że 40% komórek zostało poddanych załadunkowi koralikowemu z białkiem Fab, a 21% komórek z załadunkiem koralikowym wykazało ekspresję współwprowadzonego plazmidu, co pokazano na reprezentatywnych polach widzenia na Rycynie 2B. Typowo do każdej komory wprowadza się 1-2 µg plazmidu, co stanowi ilość zbliżoną do tej stosowanej w lipofekcji.
Komórki obciążone koralikami wykazują bardzo zróżnicowane poziomy plazmidów (Rysunek 2C,D). Aby precyzyjnie to zmierzyć, zastosowano test współczynnika Fishera w celu porównania rozkładów danych dotyczących intensywności białek i plazmidów. Wyniki wykazały, że choć białka 1 i 2 miały podobne rozkłady intensywności (p = ~1), rozkład każdego z białek był znacząco mniejszy niż w przypadku plazmidu (p = 3.2e-6 oraz 1.8e-5). Choć może to wynikać ze zmienności liczby plazmidów wprowadzonych do pojedynczej komórki, głównym źródłem zmienności mogą być liczne etapy wymagane do ekspresji plazmidu, które prawdopodobnie znacznie różnią się między komórkami, w tym import do jądra komórkowego, transkrypcja i translacja. W przeciwieństwie do tego, poziomy białek wprowadzonych za pomocą koralików wykazywały niewielką zmienność międzykomórkową, a poziomy dwóch jednocześnie wprowadzonych białek były ze sobą silnie skorelowane (Rysunek 2D,E).
Ekspresja plazmidu może być widoczna już od 2-4 h po załadowaniu kulek, ale może wystąpić później, w zależności od tego, kiedy uzyskuje się optymalną ekspresję plazmidu. Zalecamy przeprowadzenie badania kinetyki w celu określenia najlepszego okna ekspresji dla konkretnego plazmidu w przedziale od 2-24 h po załadowaniu kulek. Można to przeprowadzić w jednej komorze za pomocą obrazowania w długim przedziale czasowym lub poprzez załadowanie kulek i przesunięcie czasowe w wielu komorach. Komórki z załadowanymi kulkami pozostają przylegające i są wystarczająco zdrowe, aby rosnąć i dzielić się. Ludzkie komórki U2OS z załadowanymi kulkami obrazowano bezpośrednio przed, bezpośrednio po oraz 24 h po załadowaniu kulek. Prawidłowe załadowanie kulek prawie nie miało zauważalnego wpływu na liczbę komórek ani ich morfologię, co pokazano na Rysunku 3A (lewo, środek).
W przeciwieństwie do tego, niewłaściwe obciążenie kuleczkami, objawiające się zbyt dużą ich liczbą oraz nadmierną siłą opukiwania, przedstawiono na Rysunku 3B. Doprowadziło to do znacznej utraty komórek (duże obszary szkiełka podstawowego pozbawione komórek oraz oddzielone, pływające, nieostre komórki), zaburzeń morfologii komórek (komórki wydają się zaokrąglone i słabo przylegające) oraz pozostania skupisk kuleczek na szkiełku podstawowym po procesie obciążania. Choć przypuszcza się, że podczas obciążania kuleczkami komórki ulegają uszkodzeniom mechanicznym, w komorze prawidłowo obciążonej kuleczkami komórki rosły i proliferowały, o czym świadczy zwiększona liczba komórek 24 h po obciążaniu (Rysunek 3A, po prawej). Wpływ na żywotność komórek można ocenić za pomocą różnych testów, takich jak test 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolium bromku (MTT), aby porównać komórki obciążone kuleczkami z komórkami kontrolnymi (mock-loaded)30. Ponadto, niniejsze oraz poprzednie prace pokazują, że komórki obciążone kuleczkami ulegają podziałom (Rysunek 3C oraz Supplemental Video 1), a czas trwania mitozy nie jest zaburzony przez obciążanie kuleczkami31, co stanowi dalszy dowód na utrzymanie zdrowia komórek po procesie obciążania.
Ładowanie kulek jest wszechstronną techniką, możliwą do zastosowania dla wielu linii komórek adherentnych oraz różnych makrocząsteczek. W niniejszym przypadku różnorodność tę zademonstrowano poprzez załadowanie linii komórkowych RPE1 i HeLa fragmentami Fab (Rysunek 4A,B). Tabela 1 przedstawia kolejne przykłady ładowania kulek w różnych liniach komórkowych, zarówno w tym laboratorium, jak i w innych, oraz wskazuje na pewne subtelne różnice między protokołami ładowania kulek stosowanymi w innych ośrodkach. Warto zauważyć, że średnica szklanych kulek używanych do ładowania znacznie różni się w zależności od laboratorium, choć w kilku liniach komórkowych stwierdzono, że najefektywniejsze ładowanie uzyskuje się przy użyciu małych kulek o średnicy 75 µm14. Ponadto w tym laboratorium rozpoczęto również ładowanie kulek RNA (dane nie pokazane). Na Rysunku 4C przedstawiono reprezentatywną komórkę U2OS z załadowanym jednocześnie 9-merem Cy5-RNA oraz 28-merem Cy3-DNA.
<img alt="Metoda wprowadzania hodowli komórkowej z wykorzystaniem techniki załadunku kulek. Schemat i procedura krok po kroku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62559/62559fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Aparatura do załadunku kulek, technika i harmonogram <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/62559fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej; analiza ekspresji białek, A488-H3K11ac, Cy3-Pa57, plazmid sfGFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62559/62559fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ładowanie za pomocą kulek wprowadza niską zmienność stężenia białka, ale wysoką zmienność ekspresji plazmidu. (A) Komórki zostały obciążone za pomocą kulek 0,5 µg każdego z przeciwciał: Fab anty-H3K27 acetyl koniugowanego z Alexa488 (zielony) oraz Fab anty-RNAPII-fosforylowanego po serynie 5 koniugowanego z Cy3 (czerwony) w 4 µL roztworu do ładowania kulek. Komórki barwiono DAPI (niebieski), a następnie natychmiast obrazowano na żywo. Paski skali = 20 µm. (B) Komórki zostały obciążone za pomocą kulek 0,5 µg białka Fab (białko anty-RNAPII-fosforylowane po serynie 5 koniugowane z Cy3, czerwone) oraz 1 µg plazmidu kodującego superfolder GFP-H2B (zielony) w 4 µL roztworu do ładowania kulek. Po 24 h komórki barwiono DAPI (niebieski) i obrazowano na żywo. Paski skali = 30 µm. (C-E) Białko 1 (HaloTag-MCP znakowane JF646-HaloLigand), białko 2 (Fab anty-FLAG koniugowany z Cy3) oraz plazmid kodujący EGFP (λN-EGFP-LacZ) zostały wprowadzone do komórek jednocześnie za pomocą kulek. Całkowitą intensywność w każdym kanale fluorescencyjnym mierzono w obszarze 1,3 x 1,3 µm w cytoplazmie każdej komórki. N = 25 komórek. (C) Reprezentatywne komórki wykazujące ekspresję wprowadzonego za pomocą kulek plazmidu λN-EGFP-LacZ. Dla wszystkich komórek zastosowano te same warunki obrazowania i intensywności. Kropki są agregatami wyrażonego białka. Paski skali = 10 µm. (D) Wykres przedstawia całkowitą intensywność białka 1, białka 2 lub EGFP wyrażonego z plazmidu dla każdej komórki. Każdy kanał został znormalizowany do mediany. Wartości P skorygowane metodą Bonferroniego obliczono za pomocą testu współczynnika Fishera, aby określić, czy rozkład danych dotyczących intensywności białka lub plazmidu wykazuje taką samą zmienność. Każdy punkt reprezentuje jedną komórkę. (E) Całkowite intensywności dla obu białek, białka 1 i plazmidu lub białka 2 i plazmidu są naniesione względem siebie. Wyświetlone są obliczone wartości R2. Każdy punkt reprezentuje jedną komórkę. Skróty: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EGFP = enhanced green fluorescent protein; A.U. = jednostki dowolne; MCP = MS2 coat protein; RNAPII = polimeraza RNA II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/62559fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza odpowiedzi hodowli komórkowej; mikrografie time-lapse przedstawiają zmiany komórkowe w różnych odstępach czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62559/62559fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Komórki obciążone kuleczkami pozostają przylegające i są wystarczająco zdrowe, aby rosnąć i dzielić się. (A) Komórki U2OS zostały obciążone 0,5 µg anty-FLAG Fab sprzężonego z Cy3 w 4 µL roztworu do obciążania kuleczkami. Obrazowanie komórek wykonano bezpośrednio przed, bezpośrednio po oraz 24 h po obciążeniu kuleczkami. Pomarańczowe strzałki wskazują obszary, w których komórki oddzieliły się podczas obciążania kuleczkami. Paski skali = 2 mm. (B) Reprezentatywny obraz komórek U2OS obciążonych komponentami z (A), lecz z zastosowaniem gwałtownego opukiwania i zbyt dużej liczby kuleczek. Czerwona strzałka wskazuje dodatkowe szklane kuleczki. Pasek skali = 2 mm. (C) Komórki U2OS zostały obciążone 1,5 µg plazmidu smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2 o wielkości 14,4 kbp, 0,5 µg anty-FLAG Fab sprzężonego z Cy3 (zielony), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) w 8 µL roztworu do obciążania kuleczkami. Bezpośrednio przed obrazowaniem HaloTag został zabarwiony JF646-HaloLigand. Pętle spinki MS2 mRNA transkrybowanego z plazmidu reporterowego są znakowane przez MCP (magenta punkty), a translacyjne białko reporterowe z tagiem FLAG jest znakowane przez anty-FLAG Fab (zielona kolokalizacja z mRNA). Dojrzałe białko znakowane Fab lokalizuje się w jądrze. Komórka ta była obrazowana od 4 do 15 h po obciążeniu kuleczkami. Żółte strzałki wskazują jądro komórkowe przed oraz jądra po podziale komórki. Paski skali = 5 µm. Skrót: MCP = białko otoczki MS2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/62559fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna; linie komórkowe RPE1, HeLa; oznakowane jądra (nuc) i cytoplazma (cyto); obraz złożony, Cy3-DNA, Cy5-RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62559/62559fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zmienność w zależności od typu komórek podczas wprowadzania materiału zgodnie z protokołem ładowania koralików. (A-B) Do komórek RPE1 (A) i HeLa (B) wprowadzono za pomocą koralików 1,5 µg jądrowego białka Fab (anty-RNAPII-fosforylacja seryny 5) w 4 µL roztworu do ładowania. Oznaczono jądro (nuc) oraz cytoplazmę (cyto) każdej komórki. Obrazy wykonano 6 h po wprowadzeniu koralików. Paski skali = 5 µm. (C) Do ludzkich komórek U2OS wprowadzono za pomocą koralików oligosy Cy5-RNA 9mer (magenta) i Cy3-DNA 28mer (zielony), po 10 picomoli każdego, w 4 µL roztworu do ładowania koralików. Obrazy wykonano 4 h po wprowadzeniu koralików. Wszystkie jądra komórkowe zostały zaznaczone linią przerywaną. Paski skali = 5 µm. Skróty: RNAPII = polimeraza RNA II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/62559fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody style="font-size: 14px;">
		<tr>
			<td>Linia komórkowa</td>
			<td>Typ komórek</td>
			<td>Efektywność nakładania kulek</td>
			<td>Uwagi/referencje</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komórki macierzyste (ludzkie)</td>
			<td>Zarodkowe komórki macierzyste</td>
			<td>Trudne</td>
			<td>*Wiele komórek odkleja się podczas nakładania kulek, jeśli są wysiane na płytkach pokrytych żelatyną</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293</td>
			<td>Ludzkie komórki embrionalnej nerki</td>
			<td>Trudne</td>
			<td>*Przed nakładaniem kulek należy nałożyć macierz żelową na powierzchnię komory obrazowania. Na początku nakładania kulek należy delikatnie opukiwać</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurony (szczurze)</td>
			<td>Pierwotne neurony embrionalne (e-18), dysocjowane</td>
			<td>Bardzo nieefektywne</td>
			<td>*Stosując ten standardowy protokół nakładania kulek, nie zaobserwowano efektywnego nakładania kulek w przypadku neuronów. Może to wynikać z nieprzywierającej natury neuronów lub z wynikającego z tego uszkodzenia wypustek nerwowych.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK (psie)</td>
			<td>Komórki nerki psa Madin-Darby</td>
			<td>Patrz McNeil i Warder (1987)14</td>
			<td>*Niska efektywność nakładania kulek14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS (ludzkie)</td>
			<td>Osteosarcoma</td>
			<td>Standardowy protokół nakładania kulek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa (ludzkie)</td>
			<td>Rak szyjki macicy</td>
			<td>Standardowy protokół nakładania kulek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE1 (ludzkie)</td>
			<td>Komórki nabłonkowe unieśmiertelnione hTERT</td>
			<td>Standardowy protokół nakładania kulek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFF (ludzkie)</td>
			<td>Pierwotne fibroblasty napletka</td>
			<td>Patrz Besteiro i in. (2009)31 </td>
			<td>*Zmodyfikowany protokół polegający na przechylaniu zamiast opukiwania31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">BALB/c 3T3, NIH 3T3 i Swiss 3T3 (mysie)</td>
			<td rowspan="3">Fibroblasty zarodkowe</td>
			<td rowspan="3">Patrz Gilmore i Romer (1996)32, Emerson i in. (2014)33 oraz McNeil i Warder (1987)14</td>
			<td>*Zgłoszono zastosowanie szklanych kulek 425–600 μm32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Zastosowano szklane kulki 200–300 μm33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Szklane kulki 75 μm dały lepsze wyniki niż 400 μm14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM (muntjak indyjski)</td>
			<td>Fibroblasty skóry</td>
			<td>Patrz Manders, Kimura i Cook (1999)34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO (chomik)</td>
			<td>Komórki jajnika o charakterze nabłonkowym</td>
			<td>Patrz Memedula i Belmont (2003)35</td>
			<td>*Zastosowano szklane kulki 425–600 μm35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAE (bydlęce)</td>
			<td>Bydlęce komórki śródbłonka aorty (BAEC-11)</td>
			<td>Patrz McNeil i Warder (1987)14</td>
			<td>*Szklane kulki 75 μm dały lepsze wyniki niż 400 μm14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PtK-2 (Potomus tridaclylis)</td>
			<td>Nabłonkowe komórki nerki</td>
			<td>Patrz McNeil i Warder (1987)14</td>
			<td>*Szklane kulki 75 μm dały lepsze wyniki niż 400 μm14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC (ludzkie)</td>
			<td>Komórki śródbłonka żyły pępowinowej</td>
			<td>Patrz Gilmore i Romer (1996)32</td>
			<td>*Zastosowano szklane kulki 425–600 μm32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774 i J774.2 (mysie)</td>
			<td>Komórki monocytarno-makrofagiczne</td>
			<td>Patrz Becker i in. (2005)36 oraz McNeil i Warder (1987)14</td>
			<td>*Delikatne wytrząsanie (zamiast opukiwania) i szklane kulki 425–600 μm36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-5 (mysie)</td>
			<td>Komórki zrębu szpiku kostnego</td>
			<td>Patrz Molenaar i in. (2003)37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">WPE1-NB11 (ludzkie)</td>
			<td rowspan="2">Nabłonkowe komórki prostaty</td>
			<td>Patrz Gilmore i Romer (1996)32 oraz</td>
			<td>*Zastosowano szklane kulki 425–600 μm32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emerson i in. (2014)33</td>
			<td>*Zastosowano szklane kulki 200–300 μm33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Obciążenie koralikami w różnych liniach komórkowych. W przypadku linii komórkowych, które nie zostały jeszcze obciążone koralikami w tym laboratorium, podano referencje oraz uwagi dotyczące modyfikacji protokołu.
Wideo dodatkowe 1: Przykład komórki z załadowanymi koralikami w trakcie podziału komórkowego. Komórki U2OS załadowano 1,5 µg plazmidu smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2 o wielkości 14,4 kbp, 0,5 µg przeciwciała Fab anty-FLAG sprzężonego z Cy3 (kolor zielony) oraz 130 ng HaloTag-MCP (kolor magenta) w 8 µL roztworu do ładowania koralików. Bezpośrednio przed obrazowaniem HaloTag zabarwiono za pomocą JF646-HaloLigand. Pętle spinki MS2 mRNA transcribeowanego z plazmidu reporterowego są znakowane przez MCP (magenta kropki), a przetłumaczone białko reporterowe z tagiem FLAG jest znakowane za pomocą Fab anty-FLAG (zielona kolokalizacja z mRNA). Dojrzałe białko znakowane Fab lokalizuje się w jądrze. Komórkę obrazowano od 4 do 15 h po załadowaniu koralików. Pasek skali = 10 µm. Skrót: MCP = białko kapsydu MS2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/bead_load_cell_divides.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Ładowanie koralików wprowadza białka, plazmidy i cząsteczki do przylegających komórek ssaków. Ta technika ładowania komórek jest niedroga, szybka i nie wpływa znacząco na zdrowie komórek. Najlepiej nadaje się do obrazowania żywych komórek.

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing ...

Ładowanie kulek to niedrogi test do ładowania membranowych, nieprzepuszczalnych cząstek do żywych przylegających komórek. Protokół ten okazał się niezwykle przydatny do ładowania sond dla pojedynczej komórki lub pojedynczej cząsteczki lub eksperymentów z mikroskopią fluorescencyjną. Ładowanie kulek pozwala naukowcom szybko ładować wszelkiego rodzaju cząsteczki, w tym białka, DNA, RNA, cząstki syntetyczne lub ich kombinację jednocześnie do pojedynczych komórek.Podczas pierwszego załadunku ściegu ważne jest, aby przetestować siłę gwintowania. Linie komórkowe różnie reagują na obciążenie koralikami. W ten sposób liczba i siła gwintowników mogą być modyfikowane w celu optymalnego obciążenia komórek, jednocześnie minimalizując ich łuszczenie.Aby zademonstrować procedurę, Matthew Saxton i ja dołączymy do naszych kolegów, dr Amandy Cook i Gabriela Galindo. Zacznij od zmierzenia około pięciu mililitrów szklanych koralików w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Dodać 25 mililitrów dwumolowego wodorotlenku sodu do probówki i delikatnie mieszać przez dwie godziny za pomocą shakera lub rotora.Odkręć krótko rurkę z kulkami w wirówce, jeśli kulki są w zawiesinie, a następnie zdekantuj wodorotlenek sodu, zachowując jak najwięcej kulek. Dokładnie umyj kulki wodą z kultur komórkowych, aż pH będzie neutralne i za każdym razem przelewaj wodę. Użyj paska testowego pH na ściekach, aby potwierdzić neutralne pH, a następnie dokładnie umyj kulki 100% etanolem, dwa do trzech razy.Dekantacja etanolu za każdym razem. Wysusz koraliki i posyp je tak, aby utworzyły cienką warstwę w sterylnym pojemniku. Następnie pozostaw pojemnik otwarty w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby wysuszyć kulki na powietrzu przez noc.Delikatnie postukaj lub potrząśnij pojemnikiem i sprawdź, czy koraliki mają piaszczystą teksturę bez zbrylania się lub łuszczenia, aby upewnić się, że kulki są całkowicie suche. Dodaj kulki do aparatu i przykryj cały otwór komory na kulki za pomocą siatki polipropylenowej lub równoważnego materiału z otworami o średnicy 105 mikrometrów, aby umożliwić przejście kulek. Zacisnąć siatkę między męskim i żeńskim końcem metalowej komory obrazowania wielokrotnego użytku, a następnie szczelnie zamknąć ją woskową folią i sterylizować aparat UV przez 15 minut.Aparat do ładowania kulek może być teraz używany do wykonywania setek testów obciążenia. Przechowywać aparat w suchym pojemniku wysuszonym żelem krzemionkowym lub innym środkiem osuszającym i zamknąć go. Jeśli kulki zostaną wyrzucone, dokładnie wysusz i wysterylizuj ładowarkę koralików i zastąp ją świeżymi kulkami, jak pokazano wcześniej.Usuń pożywkę z komórek i delikatnie odessaj całą pożywkę z okolic krawędzi komory. Następnie przechyl komorę pod kątem około 45 stopni i usuń pozostałą kroplę pożywki ze środkowej mikrostudzienki. Delikatnie odpipetuj roztwór do ładowania kulek na szklaną mikrostudzienkę znajdującą się w środku komory.Użyj aparatu do ładowania kulek, aby delikatnie rozprowadzić monowarstwę szklanych kulek na wierzchu komórek. Upewnij się, że koraliki całkowicie zakrywają komórki. Ściśnij komorę dwoma palcami, podnieś ją o około dwa cale i mocno opuść, używając siły w przybliżeniu równej upuszczeniu naczynia z tej wysokości, delikatnie dodaj pożywkę z powrotem do komory, powoli pipetując na plastikową stronę komory.Zasysaj wszelkie pływające kulki bez naruszania komórek, cała procedura ładowania kulek powinna być wykonana stosunkowo szybko. Dzięki temu komórki nie wysychają, gdy nie mają pożywki. Następnie inkubuj komórki przez 4,5 do dwóch godzin w inkubatorze.Przed obrazowaniem przemyj komórki trzykrotnie pożywką, aby usunąć kulki i nadmiar składników obciążających w roztworze ładującym. Wyobraź sobie komórki natychmiast lub gdy jest to wymagane w eksperymencie, korzystając z instrukcji zawartych w rękopisie tekstowym. Komórki, które zostały pomyślnie załadowane kulkami, prawie zawsze miały Cy3-Pa57 i A488-H3K11ac znakowane białka razem.Jeden mikrogram plazmidowego DNA i kodującego GFP oraz 0,5 mikrograma białka znakowanego Cy3 wprowadzono również do komórek poprzez ładowanie perełkowe, wyrażone i uwidocznione. 40% komórek było naładowanych białkiem fab, a 21% komórek obciążonych kulkami wyraża plazmid obciążony rdzeniem. Komórki naładowane koralikami wyrażały różne poziomy plazmidu.Wynik tego testu współczynnika Fishera wykazał, że chociaż białka 1 i 2 miały podobny rozkład intensywności, każde białko miało znacznie mniejszą dystrybucję niż plazmid. Poziomy białek naładowanych kulkami miały niewielką wariancję między komórkami, a poziomy dwóch jednocześnie załadowanych białek były ze sobą silnie skorelowane. Prawidłowe ładowanie kulek nie miało prawie żadnego zauważalnego wpływu na liczbę ludzkich komórek U2OS lub ich morfologię, gdy były obrazowane bezpośrednio przed, bezpośrednio po i 24 godziny po załadowaniu kulek.Słabe ładowanie kulek z nadmierną siłą stukania i siłą stukania powodowało utratę komórek, słabą morfologię komórek i skupiska koralików pozostające na szkle nakrywkowym. Mimo że uważa się, że komórki ulegają uszkodzeniom mechanicznym podczas ładowania kulek, komórki rosły i rozmnażały się w prawidłowo załadowanej komorze koralików. Zaobserwowano również, że komórki obciążone kulkami ulegają podziałowi komórkowemu.Linie komórkowe RPE1 i HeLa zostały załadowane koralikami fab, aby zademonstrować wszechstronność techniki ładowania kulek. Komórki U2OS były również wypełnione koralikami Cy5-RNA 9-mer i Cy3-DNA 28-mer razem. Próbując tego protokołu, upewnij się, że dodajesz do komórek tylko jedną warstwę koralików, ponieważ zbyt wiele koralików powoduje odłączanie się komórek.Tak więc po krótkiej, 30-minutowej rekonwalescencji komórki ładujące koraliki są gotowe do obrazowania natychmiast lub kilka godzin lub dni później, jeśli procedura wymaga dalszych kroków, takich jak barwienie, można to również wykonać po okresie rekonwalescencji.

bead-loading-proteins-and-nucleic-acids-into-adherent-human-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje prosty test adhezji bakteryjnej, polegający na zliczaniu jednostek tworzących kolonie bakterii, które przylgnęły do hodowli komórkowych. Test ten jest wiarygodny, niezależny od badanej adhezyny, a jego liczne modyfikacje są stosowane w większości laboratoriów zajmujących się patogenezą bakteryjną.

In Vitro Analiza Adhezji Bakteryjnej do Komórek Nabłonkowych Ssaków

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

W tym filmie opisujemy procedurę wprowadzania kwasów nukleinowych do przylegających komórek ssaków za pomocą ładowania koralików.

Ładowanie kulek w celu wprowadzenia kwasów nukleinowych do przylegających komórek hodowlanych: technika ładowania plazmidów kodujących białka fluorescencyjne do przylegających komórek ssaków

W tym filmie opisujemy metodę badania dynamiki organelli w limfocytach B po ich aktywacji za pomocą mikrogranulek pokrytych antygenem.

Dynamika organelli w limfocytach B po aktywacji kulkami pokrytymi antygenem

Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek.  Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach.  Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Zrosty powierzchniowe komórek są kluczowe w mechanotransdukcji, ponieważ przenoszą napięcie mechaniczne i inicjują szlaki sygnałowe zaangażowane w homeostazę i rozwój tkanek. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparowania szlaków biochemicznych, które są aktywowane w odpowiedzi na napięcie, przy użyciu mikrokulek magnetycznych pokrytych ligandem i przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych.

Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Poznaj technikę ładowania kulek do wprowadzania białek, DNA i RNA do żywych komórek ssaczych. Ta metoda umożliwia efektywne dostarczanie makrocząsteczek do badań mikroskopii fluorescencyjnej.

Ładowanie kulek białek i kwasów nukleinowych do przylegających komórek ludzkich

Przeglądaj więcej filmów