Name: Techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu guza podścieliskowego przewodu pokarmowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym modelu mysim guza GIST. Protokół obejmuje hodowlę, preparację tkanki i izolację komórek do badań translacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KitV558Δ/+ myszy zostały genetycznie zmodyfikowane i udostępnione przez Dr. Petera Besmera10. Prace te były wspierane przez granty NIH R01 CA102613 i T32 CA251063.

Wszystkie myszy były trzymane w warunkach wolnych od patogenów na Uniwersytecie Pensylwanii zgodnie z wytycznymi NIH i za zgodą IACUC Uniwersytetu Pensylwanii. Eutanazja została przeprowadzona zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources.
1. ZestawV558Δ/+ hodowla myszy
<ol>
	<li>Krzyżuj wstecznie myszy Kit V558Δ/+ ponad 10 razy na tle C57BL/6J za pomocą myszy C57BL/6J. Aby to zrobić, wyhoduj samce myszy Kit V558Δ/+ z samicami myszy C57BL/6J w stosunku 1:2. 
	UWAGA: Genotyp homozygotycznyKit V558Δ/V558Δ jest śmiertelny w macicy. Możliwe jest rozmnażanie samic myszy KitV558Δ/+ z samcami myszy C57BL/6J, ale wielkość miotu jest o połowę mniejsza niż w przypadku samic myszy C57BL/6J typu dzikiego. Co więcej, samice myszy Kit V558Δ/+ produkują ograniczoną liczbę miotów po 4 miesiącu życia.</li>
	<li>Genotyp szczeniąt w wieku 7-14 dni poprzez obcinanie palców u nóg w celu potwierdzenia obecności genotypu KitV558Δ/+. Użyj startera do przodu: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; sprawozdawca 1: CCTCGACAACCTTCCA; podkład odwrotny: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; oraz reporter 2: TCTCCTCGACCTTCCA do genotypowania.</li>
</ol>
2. ZestawV558Δ/+ leczenie myszy
<ol>
	<li>Wiek i płeć pasują do myszy KitV558Δ/+ przed leczeniem. Użyj myszy dopasowanych pod względem wieku i płci w kohortach, ponieważ guzy u samic myszyKit V558Δ / + są większe niż u samców. Leczenie myszy w wieku 8-12 tygodni, w którym to czasie ustalają się guzy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1).</li>
	<li>Inhibitory kinazy tyrozynowej należy podawać doustnie lub we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.); Guzy KitV558Δ/+ są wrażliwe na inhibitory kinazy tyrozynowej. Imatynib należy podawać w dawce 600 mg/l w wodzie do picia lub w iniekcjach 45 mg/kg mc. dwa razy na dobę. Zmierz zmniejszenie masy guza za pomocą wag cyfrowych po rozcięciu guza, jak pokazano w kroku 3, co wynosi około 50% po 1 tygodniu i 80% po 4 tygodniach po leczeniu imatynibem (<silna klasa = "xfig">Rycina 2).</li>
</ol>
3. ZestawV558Δ/+ pobieranie organów myszy
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji za pomocą narkozy CO2 przy natężeniu przepływu 60% objętości komory na minutę. Pozostaw myszy w komorze na co najmniej 2 minuty po ustaniu oddychania, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić śmierć.</li>
	<li>Sterylizuj wszystkie narzędzia, noś rękawiczki przez cały czas trwania zabiegu i utrzymuj sterylne pole. Przygotuj skórę za pomocą 70% etanolu. Wykonaj 2 cm pionowe nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek i wejdź do jamy brzusznej. Ostro zlikwiduj wszelkie zrosty wewnątrz brzucha.</li>
	<li>Aby usunąć drenujący węzeł chłonny krezkowy, wykonaj czynności opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj jelito ślepe i podnieś jego krezkę wyżej. Mniej więcej w połowie drogi do podstawy krezki zidentyfikuj węzeł chłonny krezki i ostro go wypreparuj. Węzeł chłonny jest białawy i ma wymiary około 0,5 cm x 0,5 cm.</li>
		<li>Podziel tkankę węzła chłonnego na trzy części w celu izolacji białka, histologii i zawieszenia pojedynczej komórki, w razie potrzeby. W przypadku zawiesin jednokomórkowych należy umieścić tkankę węzłów chłonnych w 20 ml pożywki wolnej od surowicy (RPMI) i trzymać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu odizolowania GIST i jelita ślepego należy postępować zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
	<ol>
		<li>Jelito ślepe w myszach KitV558Δ/+ jest w większości zastępowane przez GIST. Ostrożnie podziel połączenie krętniczo-kolkowe od podstawy guza. Aby zebrać jelito ślepe, ponownie podziel okrężnicę, 2 cm proksymalnie do podstawy guza.</li>
		<li>U 50%-60% myszy KitV558Δ/+ głowa guza zawiera czapeczkę z tkanki jelita ślepego, która zwykle zawiera płyn surowiczy, ale rzadko może zawierać ropę (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3). Ostro wypreparuj tkankę czapeczki z dala od tkanki nowotworowej.</li>
		<li>Podziel tkankę nowotworową i/lub jelito ślepe na trzy części w celu izolacji białka, histologii i zawieszenia pojedynczej komórki, w razie potrzeby. W przypadku zawiesin pojedynczych komórek umieść tkankę nowotworową lub jelito ślepe w HBSS z 2% FCS, wystarczającym do przykrycia próbki i utrzymania na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza Western blot tkanki GIST
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy tkanek zawierający 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% detergentu niedenaturującego, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF i mieszaninę inhibitorów proteinaz 20 μl/ml.</li>
	<li>Przygotuj 1x Tris-buforowany roztwór soli fizjologicznej z 1% Tween 20 (TBST), łącząc 1800 ml wody dejonizowanej, 2 ml Tween 20 i 200 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS).</li>
	<li>Zawiesić tkankę z kroku 3.4.3 w probówce FACS w 5 ml/g buforu do lizy tkanek i dwukrotnie homogenizować za pomocą homogenizatora mechanicznego z prędkością 15 000 obr./min przez 15 s na lodzie. Inkubować lizat przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Uruchom lizaty na żelu o gradiencie od 4% do 15%, a następnie przenieś do membrany nitrocelulozowej, zgodnie z opisem w14.</li>
	<li>Membranę myć raz w 1x TBS przez 5 min, a następnie zablokować membranę w 5% mleku na 1 godzinę. Ponownie umyj membranę raz na 1x TBS przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować błonę w przeciwciałie pierwszorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w 5% BSA w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj membranę 3x w 1x TBST przez 10 min każdy. Inkubować blot z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:2500 w 2,5% mleku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj membranę raz na 1x TBS przez 5 minut. Dodaj wystarczającą ilość substratu HRP, aby pokryć membranę, zwykle 200-500 μl, i użyj cyfrowego imagera do wykrycia i ilościowego określenia chemiluminescencji.</li>
</ol>
5. Immunohistochemia tkanki GIST
<ol>
	<li>Utrwalić tkankę z kroku 3.3.2 lub 3.4.3 w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez noc. Przechowuj tkankę w 70% EtOH do momentu, gdy będzie gotowa do przetwarzania. Osadzaj i dziel bloki o grubości 5 μm na szkiełkach podstawowych, zgodnie z opisem15,16.</li>
	<li>Pełna detekcja immunohistochemiczna przy użyciu podstawowego zestawu do immunodetekcji, jak opisano wcześniej17.</li>
</ol>
6. Jednokomórkowe zawiesina krezki węzła chłonnego
<ol>
	<li>Wlać pożywkę RPMI z próbką węzłów chłonnych z kroku 3.3.2 przez filtr 100 μm. Przenieś filtr do nowego stożkowego węzła chłonnego o pojemności 50 ml i zacier miękkim końcem plastikowej strzykawki o pojemności 3 ml. Umyj filtr 20 ml pożywki RPMI.</li>
	<li>Odwirować filtrat przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant. </li>
	<li>Zawiesić osad w 20 ml 1% FBS w PBS (bufor perełkowy) i zalać filtrem 40 μm. Zebrać filtrat komórkowy. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować filtrat przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant. Zawiesić w buforze kulkowym o stężeniu 6 x 107 komórek/ml do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
7. Jednokomórkowe zawiesiny GIST
<ol>
	<li>Przygotować bufor kolagenazy, dodając 250 mg kolagenazy dożylnej, jedną tabletkę inhibitora proteazy wolnej od EDTA i 100 μl DNazy I do 50 ml HBSS. Obracaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aż się rozpuści.</li>
	<li>Umieść GIST w sterylnym naczyniu i dodaj 2,5 ml buforu kolagenazy. Miel guz za pomocą sterylnego skalpela i nożyczek, aż guz będzie w drobnych fragmentach. Użyj pipety o dużym otworze, aby zassać guz i kolagenazę do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 100 obr./min w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Reakcję gaszenia z użyciem 2 ml FBS.</li>
	<li>Wlać kolagenazę z próbką GIST przez filtr 100 μm i rozgnieść guz miękką końcówką plastikowej strzykawki o pojemności 3 ml i zebrać w probówce o pojemności 50 ml. Umyj filtr 20 ml HBSS. Odwirować filtrat w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 5 min. Odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 20 ml buforu perełkowego i zalać filtrem 40 μm. Zebrać filtrat i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odwirować filtrat w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 5 min. Odessać supernatant. Zawiesić w buforze kulkowym o stężeniu 6 x 107 komórek/ml do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
8. Jednokomórkowe zawieszenie jelita ślepego
<ol>
	<li>Przygotuj bufor kolagenazy jak w kroku 7.1. Za pomocą nożyczek rozłup jelito ślepe wzdłużnie, aby odsłonić wewnętrzną błonę śluzową. Pokrój na odcinki o długości 0,5 cm i umieść w probówce o pojemności 50 ml z 5 ml HBSS z 2% FBS. Wstrząsać energicznie przez 30 s, odwirowywać przy 450 x g przez 20 s, a następnie zassać supernatant.</li>
	<li>Dodać 5 ml HBSS z 2 mM EDTA. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przy 100 obr./min przez 15 min. Wirować przy 450 x g przez 20 s. Odessać supernatant.</li>
	<li>Dodaj 5 ml HBSS. Wstrząsać energicznie przez 30 s, odwirowywać przy 450 x g przez 20 s, a następnie zassać supernatant. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Dodaj 5 ml buforu kolagenazy. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy 100 obr./min. Wstrząsać energicznie co 10 minut. Reakcję gaszenia za pomocą 2 ml FBS.</li>
	<li>Wlać kolagenazę z próbką jelita ślepego przez filtr 100 μm i rozgnieść miękką końcówką plastikowej strzykawki o pojemności 3 ml. Umyj filtr 20 ml HBSS. Zebrać filtrat.</li>
	<li>Odwirować filtrat o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant. Zawiesić granulat w 20 ml buforu perełkowego i zalać filtrem 40 μm. Zebrać filtrat i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować filtrat o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant. Zawiesić w buforze kulkowym o stężeniu 6 x 107 komórek/ml do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond%3A+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li>
<li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors%3A+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li>
<li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li>
<li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+%28GRID%29%3A+an+international%2C+multicentre%2C+randomised%2C+placebo-controlled%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li>
<li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li>
<li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li>
<li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors%3A+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996(2020).</li>
<li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li>
<li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li>
<li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li>
<li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li>
<li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li>
<li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+CD8%28%2B%29+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li>
<li>General Protocol for Western Blotting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022).</li>
<li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSadeghipour%2C+A+%22Biobanking%3A+Methods+and+Protocols%22">Biobanking: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. 253-268 (2019).</li>
<li>Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSy%2C+J+%22Biobanking%3A+Methods+and+Protocols%22">Biobanking: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. 269-278 (2019).</li>
<li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1%2FPD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li>
<li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Mysi model KitV558Δ/+ jest potężnym narzędziem badawczym w molekularnej i immunologicznej analizie GIST. Chociaż strategia hodowlana wymaga pojedynczego krzyżowania, użycie kohort myszy KitV558Δ/+ w eksperymentach analizujących odpowiedź guza wymaga ekstensywnej hodowli. Myszy powinny być dopasowane pod względem wieku i płci, aby zapewnić podobną masę guza, a 10% myszy umiera przed 8 tygodniem życia, kiedy guzy się utrwalą. Mniej rozległe strategie hodowlane są możliwe w przypadku ...

GIST to najczęstszy mięsak u ludzi, z częstością występowania około 6 000 przypadków w Stanach Zjednoczonych Ameryki1. Wydaje się, że GIST pochodzi z komórek rozrusznika przewodu pokarmowego zwanych komórkami śródmiąższowymi Cajala i jest zwykle napędzany przez pojedynczą mutację w kinazie tyrozynowej KIT lub PDGFRA2. Chirurgia jest podstawą leczenia GIST i może być lecznicza, ale pacjenci z zaawansowaną chorobą mogą być leczeni inhibitorem kinazy tyrozynowej (TKI), imatynibem. Od czasu wprowadzenia na rynek ponad 20 lat temu, imatynib zmienił paradygmat leczenia GIST, poprawiając przeżywalność w zaawansowanej chorobie z 1 do ponad 5 lat3,4,5. Niestety, imatynib rzadko jest leczniczy ze względu na nabyte mutacje KIT, dlatego potrzebne są nowe metody leczenia tego nowotworu.
Modele mysie są ważnym narzędziem badawczym w badaniach nad nowymi terapiami raka. Wiele modeli ksenoprzeszczepów podskórnych i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów zostało opracowanych i zbadanych w GIST6,7. Jednak myszy z niedoborem odporności nie reprezentują w pełni ludzkiego GIST, ponieważ GIST mają zróżnicowane profile immunologiczne w zależności od ich mutacji onkogennej, a zmiana mikrośrodowiska guza przewodu pokarmowego poprawia efekty terapii TKI 8,9. Mysz KitV558Δ/+ ma heterozygotyczną delecję linii zarodkowej w eksonie 11 Kit, która koduje domenę przybłonową, najczęściej zmutowane miejsce w ludzkiej klasie GIST10. Myszy z zestawuV558Δ/+ rozwijają pojedynczy GIST jelita ślepego ze 100% penetracją, a guzy mają podobną histologię, sygnalizację molekularną, infiltrację immunologiczną i odpowiedź na terapię jak ludzki GIST8,11,12,13. W tym miejscu opisujemy hodowlę, leczenie oraz izolację i przetwarzanie próbek u myszy KitV558Δ/+ do stosowania w badaniach molekularnych i immunologicznych w GIST.

<table><tbody><tr><td>Filtr 100 mikronów</td><td>EMSCO</td><td>1194-2360</td><td></td></tr><tr><td>1x bufor do lizy RBC</td><td>Life Technologies</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe, 30 i mikro; l</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>4% roztwór paraformaldehydu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 40 mikronów</td><td>EMSCO</td><td>1194-2340</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 70 mikronów</td><td>EMSCO</td><td>1194-2350</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało AKT (C67E7)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4691</td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Kolagenaza Laboratorium</td><td></td><td></td>Jacksona</tr><tr><td>IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny mini inhibitor proteazy wolnej od edta</td><td>Thomas Scientific</td><td>C852A34</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe skalpele</td><td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td><td>14-840-00</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza I</td><td>Przeciwciało</td> Thomas <td>Scientific C756V81</td><td></td></tr><tr><td>Dog1</td><td>ABCAM</td><td>ABC64085</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało ERK (p44/42)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thomas Scientific</td><td>C788U23</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie</td><td>FIJI FIJI</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji</td></tr><tr><td>Homogenizator Fisherbrand 850</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-340-169</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td> Centrum <td></td><td></td><td>komórkowe Uniwersytetu Pensylwanii</td></tr><tr><td>Metylan imatynibu</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1026</td><td></td></tr><tr><td>KIT Przeciwciało (D13A2)</td><td>Zestaw sygnalizacji komórkowej</td><td>3074V558</td><td></td></tr><tr><td>&Delta;/+ Genotypowanie</td><td>Transnetyx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do immunodetekcji myszy na myszy, Basic</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa, wstępnie nacięta, 0,45 i mikro; m</td><td>Rio-Rad</td><td>1620145</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9121673</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Substytut</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało p-AKT (S473)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało p-ERK (p44/42)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało p-KIT (Y719)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3391</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy PMSF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proeinaza K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP170050</td><td></td></tr><tr><td>probówki do okrągłodennego polistyrenu (FACS)</td><td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>201154</tr><tr><td>Ortowanadan sodu (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>34076</td><td></td></tr><tr><td>TBS buffer (10x)</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych (100mm2)</td><td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>TrisHCL</td><td>Thermo Fisher Scientific BP1757500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Rio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Platforma vivaCT 80</td><td>Scanco medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu guza podścieliskowego przewodu pokarmowego

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Guz podścieliskowy przewodu pokarmowego (GIST) jest najczęstszym ludzkim mięsakiem i zazwyczaj jest spowodowany pojedynczą mutacją w receptorze KIT. We wszystkich typach nowotworów opracowano liczne modele mysie w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych nowej generacji. Jednak w GIST większość badań in vivo wykorzystuje mysie modele ksenoprzeszczepów, które mają nieodłączne ograniczenia. Tutaj opisujemy immunokompetentny, genetycznie zmodyfikowany mysi model guza podścieliska przewodu pokarmowego z mutacją KitV558Δ/+. W tym modelu zmutowany KIT, onkogen odpowiedzialny za większość GIST, jest napędzany przez swój endogenny promotor, co prowadzi do GIST, który naśladuje wygląd histologiczny i naciek immunologiczny obserwowany w ludzkich GIST. Co więcej, model ten został z powodzeniem wykorzystany do zbadania zarówno celowanych terapii molekularnych, jak i immunologicznych. Tutaj opisujemy hodowlę i utrzymanie kolonii myszy KitV558Δ/+. Ponadto w artykule szczegółowo opisano leczenie i pobieranie GIST, drenaż krezkowego węzła chłonnego i przylegającego jelita ślepego u myszy KitV558Δ / +, a także przygotowanie próbek do analiz molekularnych i immunologicznych.

Model myszy KitV558Δ/+ umożliwia badanie terapii w modelu mysim z zachowaną kompetencją immunologiczną. Myszy KitV558Δ/+ mają średnią długość życia wynoszącą 8 miesięcy z powodu postępującego niedrożności jelit (Rysunek 4). Guzy u myszy KitV558Δ/+ wykazują ekspresję kanonicznych markerów GIST, w tym tyrozynokinazy KIT i kanału transbłonowego DOG1 (Rysunek 5</...

Celem tego manuskryptu jest opisanie modelu myszy KitV558Δ/+ oraz technik udanej sekcji i przetwarzania próbek myszy.

Techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu guza podścieliskowego przewodu pokarmowego

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Nasz protokół opisuje hodowlę, utrzymanie, sekcję i przetwarzanie próbek jedynego obecnie używanego immunokompetentnego modelu myszy, GIST. Mamy nadzieję, że przyszli badacze będą w stanie wykorzystać ten mysi model do dalszych badań translacyjnych w GIST. Tradycyjne terapie w GIST obejmują celowaną terapię molekularną inhibitorami kinazy tyrozynowej.Model ten umożliwia naukowcom testowanie immunoterapii w GIST. Na początek wysterylizuj wszystkie narzędzia, noś rękawiczki przez cały czas trwania zabiegu i utrzymuj sterylne pole. Przygotuj miejsce nacięcia za pomocą 70% etanolu.Za pomocą nożyczek wykonaj dwucentymetrowe pionowe nacięcie w linii środkowej i wejdź do jamy brzusznej. Ostro zlikwiduj wszelkie zrosty wewnątrz brzucha. Aby usunąć drenujący węzeł chłonny krezkowy, zidentyfikuj jelito ślepe i unieś jego krezkę wyżej.Mniej więcej w połowie drogi do podstawy krezki zidentyfikuj węzeł chłonny krezki i ostro go wypreparuj. W razie potrzeby podziel tkankę węzłów chłonnych na trzy części w celu izolacji białka, histologii i zawieszenia pojedynczej komórki. Umieść tkankę węzłów chłonnych w 20 mililitrach pożywki RPMI do zawiesin jednokomórkowych i trzymaj na lodzie.Jelito ślepe jest najczęściej zastępowane przez GIST u myszy Kit558. W celu wyizolowania GIST i jelita ślepego ostrożnie oddzielić połączenie krętniczo-kolkowe od podstawy guza. Następnie ponownie podziel jelito ślepe, dwa centymetry dystalnie do podstawy guza.U 50 do 60% myszy Kit558 głowa guza zawiera czapeczkę z tkanki jelita ślepego, która zwykle zawiera płyn surowiczy, ale rzadko może zawierać ropę. Ostro wypreparuj tkankę czapeczki z dala od tkanki nowotworowej. Podziel tkankę nowotworową i jelito ślepe na trzy części w celu izolacji białka, histologii i zawieszenia pojedynczej komórki.W przypadku zawiesin jednokomórkowych umieść tkankę nowotworową lub jelito ślepe w HBSS z 2% FCS, wystarczającym do pokrycia próbki, i trzymaj na lodzie. Wlej pożywkę RPMI z próbką węzłów chłonnych przez filtr 100 mikrometrów. Przenieś filtr do nowego 50-mililitrowego stożkowego i zetrzyj węzeł chłonny miękkim końcem trzymililitrowej plastikowej strzykawki.Umyj filtr 20 mililitrami środka RPMI. Odwirować próbki i odessać supernatant. Ponownie zawiesić granulat w 20 mililitrach bufora perełkowego i zalać 40-mikrometrowym filtrem.Zebrać filtrat komórkowy. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Odwirować próbki i odrzucić supernatant.Następnie ponownie zawiesić w buforze kulkowym do cytometrii przepływowej. Przygotować bufor kolagenazy zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. Umieść GIST w sterylnym naczyniu i dodaj 2,5 mililitra buforu kolagenazy.Za pomocą sterylnego skalpela i nożyczek zmiel guz, aż znajdzie się w drobnych fragmentach. Użyj pipety o dużej średnicy, aby zassać guz i kolagenazę do 50-mililitrowej probówki. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przy 100 obrotach na minutę, a następnie wygaszaj reakcję dwoma mililitrami FBS.Wlej kolagenazę z próbką GIST na filtr 100 mikrometrów i rozgnieć guz miękkim końcem trzymililitrowej plastikowej strzykawki i zbierz w 50-mililitrowej probówce. Umyj filtr 20 mililitrami HBSS. Odwirować filtrat w temperaturze 450 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach bufora perełkowego i zalać filtrem 40-mikrometrowym Zebrać filtrat i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odwirować i odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić w buforze kulkowym do cytometrii przepływowej. Za pomocą nożyczek rozłup jelito ślepe wzdłużnie, aby odsłonić wewnętrzną błonę śluzową.Pokrój go na 0,5-centymetrowe odcinki i umieść w 50-mililitrowej tubie z pięcioma mililitrami HBSS i 2% FBS. Wstrząsać energicznie przez 30 sekund i wirować w temperaturze 450 RCF przez 20 sekund. Następnie odrzucić supernatant.Dodaj od pięciu do 20 mililitrów HBSS z dwumilimolowym EDTA. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 100 obrotach na minutę przez 15 minut. Odwirować i wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w pięciu do 20 mililitrach HBSS.Potrząsać mieszaniną energicznie przez 30 sekund, następnie odwirować w temperaturze 450 RCF przez 20 sekund i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces jeszcze raz. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu kolagenazy, a następnie inkubować go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przy 100 obrotach na minutę.Wstrząsać energicznie co 10 minut i ugasić reakcję dwoma mililitrami FBS. Wlej kolagenazę z próbką jelita ślepego na filtr 100 mikrometrów i rozgnieć miękką końcówką trzymililitrowej plastikowej strzykawki. Umyj filtr 20 mililitrami HBSS i zbierz filtrat.Odwirować i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulat w 20 mililitrach bufora perełkowego i zalać 40-mikrometrowym filtrem. Zebrać filtrat i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.Powtórzyć proces wirowania jeszcze raz i ponownie zawiesić osad w buforze kulkowym do cytometrii przepływowej. Myszy Kit558 miały średnią długość życia wynoszącą osiem miesięcy z powodu postępującej niedrożności jelit. Guzy myszy Kit558 wykazywały ekspresję kanonicznych markerów GIST, w tym kinazy tyrozynowej KIT, kanału transbłonowego Dog1 i czynnika transkrypcyjnego ETV1.Guzy badano pod kątem zmian w szlaku sygnałowym KIT, takich jak dalsze markery ERK i AKT lub mikrośrodowisko immunologiczne, które ściśle naśladowało ludzki GIST. Rezonans magnetyczny lub CT używano do śledzenia objętości guza jako dokładnego pomiaru odpowiedzi guza. Wypreparowanie guza z dala od połączenia krętniczo-kolniczego i z dala od czapeczki kątowej jest ważne dla uchwycenia prawdziwej masy guza oraz analizy immunologicznej i molekularnej.W ramach GIST model ten pozwolił na badanie mikrośrodowiska guza, a także immunoterapii.

molecular-immunologic-techniques-genetically-engineered-mouse-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Ten protokół opisuje powstawanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J oraz monitorowanie wzrostu guza.

Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów

Przedstawiono protokół tworzenia genetycznie modyfikowanego mysiego modelu raka jelita grubego poprzez segmentowe zakażenie adeno-cre i jego nadzorowanie za pomocą kolonoskopii o wysokiej rozdzielczości.

Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Opracowaliśmy metodologię oceny, czy nowotwory układu nerwowego u genetycznie modyfikowanych myszy dokładnie odwzorowują patologię ich ludzkich odpowiedników. Tutaj stosujemy te techniki histologiczne, zdefiniowane kryteria patologiczne i metodologie hodowli do nerwiakowłókniaków i złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych powstających w mysim modelu P 0-GGFβ3.

Identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Poznaj techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym modelu mysim guza GIST. Protokół obejmuje hodowlę, preparację tkanki i izolację komórek do badań translacyjnych.

Techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu guza podścieliskowego przewodu pokarmowego

Przeglądaj więcej filmów