Eksperymentalna kwantyfikacja interakcji między systemami dostarczania leków a komórkami in vitro: przewodnik po przedklinicznej ocenie nanomedycyny
September 28th, 2022
Pokazano przepływ pracy do bezwzględnej kwantyfikacji interakcji nośnik leku z komórką za pomocą cytometrii przepływowej, aby umożliwić lepszą racjonalną ocenę nowych systemów dostarczania leków. Ten przepływ pracy ma zastosowanie do nośników leków dowolnego typu.
Protokół ten dostarcza danych ilościowych na temat interakcji systemów nośników z komórkami. Dane ilościowe mają kluczowe znaczenie dla inżynierii i optymalizacji. Pozwala nam przejść od pytań biologicznych "tak" lub "nie" do tego, ile pytań.
Technika ta jest przydatna do przekształcania wyników z przedklinicznej wydajności nośnika leku, które były jakościowe, w wyniki ilościowe. Działa to nawet wtedy, gdy scharakteryzujesz swojego nosiciela w innym systemie niż charakteryzujesz swoje komórki. Znalezienie optymalnego rozcieńczenia nośnika, które mieści się w zakresach liniowych lub ilościowych strony nano, może zająć kilka iteracji.
Nie spiesz się ze znalezieniem odpowiednich warunków. Aby rozpocząć, zamontuj komórkę przepływową na module laserowym. Powoli przepłucz komórkę przepływową z szybkością 0,1 mililitra na sekundę jednym mililitrem wody destylowanej.
Jeśli w komorze przepływowej tworzą się pęcherzyki, przed kontynuowaniem częściowo wycofaj zawiesinę, aby połączyć pęcherzyk z interfejsem powietrze-ciecz. Następnie zablokuj cały moduł laserowy na miejscu wewnątrz instrumentu. Uruchom aparat mniej więcej w połowie spłukiwania.
Pamiętaj, aby upewnić się, że zanieczyszczenia z nośnika są wypłukane. Wybierz przechwytywanie, aby otworzyć kartę ustawień przechwytywania i kliknij uruchom kamerę. Napędzaj system jednym mililitrem powietrza.
Jeśli na ekranie widoczne są jakiekolwiek nośniki statyczne, wyczyść komorę przepływową zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotuj nośniki do analizy śledzenia nanocząstek, upewniając się, że nośniki są dobrze zawieszone za pomocą sonikacji lub wirowania, w zależności od zaangażowanego systemu nośnego. Rozcieńczyć nośniki w wodzie, aby przygotować co najmniej 0,6 do jednego mililitra każdej próbki o stężeniu nośnika między 1x10 do siódmego i 1x10 do dziewiątego nośnika na mililitr.
Wyjmij moduł laserowy i ustaw go pionowo. Wrzuć pierwszą próbkę nośnika do jednomililitrowej strzykawki i przymocuj strzykawkę do wlotu probówki. Następnie ostrożnie załaduj próbkę do komory przepływowej.
Jeśli w komorze przepływowej tworzą się pęcherzyki, przed kontynuowaniem należy częściowo wycofać zawiesinę, aby połączyć pęcherzyk z interfejsem powietrze-ciecz. Upewnij się, że cała komora przepływowa jest wypełniona cieczą, a następnie wstrzymaj ładowanie. W razie potrzeby dostosuj ostrość kamery, aby zobrazować poszczególnych przewoźników.
Dokonaj zgrubnej regulacji ostrości za pomocą pokrętła po prawej stronie instrumentu. Dokonaj dokładniejszych regulacji, wybierając kartę sprzętu. Zmień ostrość, dostosowując suwak ostrości.
Aby upewnić się, że nie ma przesycenia, wybierz optymalny poziom kamery, przesuwając suwak na karcie przechwytywania. Jeśli przyrząd jest wyposażony w to akcesorium, załaduj strzykawkę zawierającą próbkę nośnika do pompy strzykawkowej. Na karcie SOP wybierz pomiar standardowy, aby wykonać pięć ujęć po 30 sekund każde.
Wprowadź nazwę pliku podstawowego i w razie potrzeby dodaj dodatkowe informacje o próbce, klikając przycisk zaawansowane, który otworzy modalne okno dialogowe z różnymi opcjami. Naciśnij utwórz i uruchom skrypt i poczekaj, aż pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o przejście próbki. Jeśli używasz pompy strzykawkowej, wybierz zakładkę sprzęt, a następnie zakładkę pompy strzykawkowej.
Ustaw żądaną szybkość infuzji i naciśnij przycisk zaparzania. Jeśli pompka strzykawkowa nie jest używana, należy ręcznie przesunąć próbkę. W wyskakującym okienku wybierz OK, aby rozpocząć przechwytywanie.
Po każdym z pięciu przechwyceń, gdy ponownie pojawi się wyskakujące okienko z zaawansowaną próbką, sprawdź, czy próbka nadal porusza się w komórce przepływowej. Następnie wybierz przycisk OK, aby kontynuować następne przechwytywanie. Na karcie procesu ustaw suwak progu wykrywania w zakresie od czterech do ośmiu, aby poprawnie zidentyfikować różnych nośników widocznych na ekranie.
Możesz dostosować wzmocnienie ekranu, aby ułatwić wizualizację, nie wpłynie to na dalszą analizę. W wyskakującym okienku naciśnij OK, aby rozpocząć analizę śledzenia. Monitoruj postęp analizy, klikając na zakładkę analizy w pojedynczej analizie.
Po zakończeniu analizy poszukaj monitu o ustawienia eksportu. Upewnij się, że jest zaznaczona opcja dołączania pliku PDF i dołączania podsumowania eksperymentu. Wybierz dowolne inne formaty eksportu zgodnie z potrzebami.
W sekcji wyników eksportu danych PDF, aby upewnić się, że zmierzone stężenie jest wiarygodne, sprawdź, czy zmierzone stężenie nośnika mieści się w przedziale od 1x10 do siódmego i od 1x10 do dziewiątego nośnika na mililitr i sprawdź, czy pod wynikiem pomiaru stężenia nie ma komunikatów o błędach lub komunikatów ostrzegawczych. Powtórzyć procedurę dwa lub więcej razy z różnymi rozcieńczeniami z podstawki i upewnić się, że stężenie każdej próbki mieści się w liniowym zakresie przyrządu. Obliczyć stężenie nośnika materiału zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.
Przygotować wolny lub sprzężony z przeciwciałami roztwór fluorochromu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Obliczyć stężenie roztworu podstawowego na podstawie stężenia, masy cząsteczkowej i liczby Avogadro, jak pokazano w równaniu. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczanie barwnika w rozcieńczalniku nośnika, aby wygenerować próbki krzywej wzorcowej.
Następnie dodaj próbkę nośnika do płytki pomiarowej i zmierz fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek. Wygeneruj krzywą standardową zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Obliczyć bezwzględną intensywność fluorescencji na nośnik, dzieląc fluorescencję objętościową przez stężenie nośnika.
Ustaw cytometr przepływowy do końcowego eksperymentu z komórką nośną, określając optymalne ustawienia napięcia PMT w odpowiednich kanałach. Uruchomić ujemną próbkę kontrolną, w której komórki nie są inkubowane z nośnikami, aby określić fluorescencję tła. Przygotować i ponownie zawiesić kulki kwantymetryczne cytometrii przepływowej.
Użyj tego samego buforu, który jest używany do próbek komórek. Jeśli populacje ściegów są podane osobno, połącz je ze sobą. Uruchomić kulkę kwantymetryczną cytometrii przepływowej i próbki komórek nośnych, aby określić intensywność fluorescencji na komórkę.
Uruchom kulki ilościowe cytometru przepływowego, aby wygenerować krzywą standardową, przekształcając bezwzględną intensywność fluorescencji na MFI. Służy do obliczenia teoretycznej MIF przewoźników zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Uruchom próbki nośników komórek, aby określić intensywność fluorescencji na komórkę każdej próbki.
Na koniec oblicz liczbę nośników na komórkę dla każdej próbki, odejmując fluorescencję tła od zmierzonej fluorescencji próbki, a następnie dzieląc przez fluorescencję na cząstkę. W przypadku cząstek rdzenia rdzeniowego z kwasu polimetakrylowego o długości 633 nanometrów, stężenie i intensywność fluorescencji na nośnik były bezpośrednio mierzalne za pomocą strumienia cytometru. Natomiast superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza o wielkości 100 nanometrów były zbyt małe, aby można je było wykryć pojedynczo i analizowano je przy użyciu strumienia masowego.
Znakowane kulki ilościowe były używane przez wiele dni do generowania standardowych krzywych na cytometrze przepływowym. Korelacja między zmierzonym MFI a wartością MESF kulek ilościowych była liniowa i zasadniczo podobna między zmierzonymi datami. Eksperymenty z użyciem znakowanych fluorescencyjnie komórek HeLa z kapsułkami z polimetakrylowym o długości 235 nanometrów od zera do 24 godzin wykazały wzrost MFI w czasie, co wskazuje, że kapsułki kojarzyły się z komórkami HeLa.
Różnica w pozornej odpowiedzi komórkowej na nosicieli była wyraźna, w zależności od względnej lub bezwzględnej kwantyfikacji. Bezwzględna kwantyfikacja była niezależna od intensywności znakowania, a zatem bardziej porównywalna. Techniki te stanowią podstawę do głębszej analizy i porównania wydajności cząstek.
Jesteśmy podekscytowani możliwością wykorzystania tych technik do parametryzacji modeli matematycznych, co pozwoli nam scharakteryzować wydajność cząstek niezależnie od konkretnego eksperymentu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół zapewnia przepływ pracy do absolutnej ilościowej oceny interakcji nośników leków z komórkami przy użyciu cytometrii przepływowej. Umożliwia racjonalną ocenę nowych systemów dostarczania leków i jest zastosowany do różnych typów nośników leków.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Systemy dostarczania leków
- Interakcje komórkowe
- Analiza ilościowa
Tło
- Dane ilościowe są niezbędne do inżynierii i optymalizacji nośników leków.
- To podejście przenosi skupienie z binarnych pytań biologicznych na ilościowe oceny.
- Pozwalla na konwersję jakościowych wyników przedklinicznych na dane ilościowe.
- Technika może być zastosowana nawet przy charakteryzowaniu nośników i komórek w różnych systemach.
Cel badania
- Dostarczyć metodę ilościowej oceny interakcji nośników leków z komórkami.
- Poprawić zrozumienie działania nośników leków.
- Ułatwić optymalizację systemów dostarczania leków.
Stosowane metody
- Cytometria przepływowa do ilościowej oceny interakcji.
- Iteracyjne testowanie w celu określenia optymalnego rozcieńczenia nośnika.
- Charakteryzacja nośników i komórek w oddzielnych systemach.
- Analiza wyników w celu upewnienia się, że leżą one w liniowych zakresach.
Główne wyniki
- Przedstawiony przepływ pracy do ilościowej oceny interakcji.
- Zidentyfikowano optymalne warunki do charakteryzacji nośnika.
- Dostarczono ilościowych wglądów w działanie nośników leków.
- Umożliwiono przejście od analizy jakościowej do ilościowej.
Wnioski
- Przepływ pracy poprawia ocenę systemów dostarczania leków.
- Dane ilościowe są kluczowe dla przyszłej inżynierii nośników leków.
- Ta metoda może być dostosowana do różnych typów nośników leków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of drug carrier-cell interactions is critical for rational design and optimization of nanomedicine platforms in preclinical R&D. This protocol enables absolute measurement of carrier binding and uptake, decoupling delivery efficiency from downstream functional effects and supporting robust, cross-platform comparisons. Standardized quantification strengthens predictive confidence at the target validation and lead selection stages, directly impacting portfolio triage and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of carrier-cell binding and uptake, clarifying delivery pathway mechanisms.
- Supports biological de-risking by distinguishing carrier interaction from payload efficacy.
- Facilitates predictive confidence in selecting and advancing delivery modalities.
- Provides a quantitative foundation for mechanistic modeling and hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Standardizes quantification of carrier-cell interactions for reproducible assay development.
- Delivers absolute, not relative, readouts to enable reliable compound and carrier evaluation.
- Supports scalability and platform reuse across diverse carrier types and labeling modalities.
- Prepares validated systems for downstream screening and optimization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro quantification with translational biomarker strategies for preclinical modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by providing comparable, absolute data.
- Reduces risk of late-stage failure by clarifying delivery system performance independent of functional outcome.
- Supports parameterization of in silico models for predictive translational research.
Pipeline & Workflow Integration
This quantification protocol integrates at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical evaluation, providing a standardized metric for delivery system performance.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing by quantifying carrier-cell interactions and supporting pathway clarification.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility with absolute quantitative outputs.
- Analytics: Delivers robust measurements and statistical outputs for cross-condition and cross-platform comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models through standardized, comparable data.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for diverse drug delivery platforms and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in delivery system evaluation.
- Operational Value: Drives standardization, reproducibility, and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling rational portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and reduces late-stage biological risk through robust quantification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, fluorescence quantitation, and nanoparticle tracking analysis.
- Demands access to calibrated instrumentation and analytical infrastructure for absolute quantification.
- Necessitates cross-team standardization of labeling, dilution, and measurement protocols.
- Adaptable to a range of carrier sizes and labeling modalities with protocol-specific adjustments.
- Dependent on maintaining measurements within instrument linear ranges and robust standard curve generation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Preparation
1:58
Measurement
3:53
Analysis
5:11
Determination of the Absolute Fluorescence Intensity per Carrier
5:56
Cell Experiment
7:08
Results: A Two-Stream Methodology to Convert Relative, Semiquantitative Flow Cytometry Cell-Carrier Association Data into Absolute Quantification
8:17
Conclusion
