Name: Eksperymentalna kwantyfikacja interakcji między systemami dostarczania leków a komórkami in vitro: przewodnik po przedklinicznej ocenie nanomedycyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji interakcji nośników leków z komórkami in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia racjonalną ocenę systemów dostarczania leków w badaniach przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC; Grant Programowy nr GNT1149990), Australijskie Centrum Badań nad Wirusologią HIV i Wirusowym Zapaleniem Wątroby (ACH2), a także dar od spadkobierców Réjane Louise Langlois. FC przyjmuje do wiadomości przyznanie stypendium National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806). Rysunek 1 i rysunek 2 zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

<ol><li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48(2014).</li>
<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ORgan+Targeting+%28SORT%29+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR%2FCas+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li>
<li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+mRNA+vaccines%3A+A+biotech+and+industrial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Vaccines%22%5BJournal%5D)">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li>
<li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22NPG+Asia+Materials%22%5BJournal%5D)">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444(2017).</li>
<li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems%3A+Considerations+for+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li>
<li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-nano+science%3A+Better+metrics+would+accelerate+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li>
<li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li>
<li>Lozano-Andrés, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li>
<li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cell-particle+association+in+vitro%3A+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li>
<li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li>
<li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447(2021).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li>
<li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+counting%3A+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li>
<li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISD3%3A+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation%2C+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6(2018).</li>
<li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221(2020).</li>
<li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li>
<li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Scharakteryzowanie interakcji między nośnikami leków a komórkami staje się coraz ważniejsze w opracowywaniu nowych systemów dostarczania leków. W szczególności, aby umożliwić racjonalną ocenę i porównanie różnych konstruktów nośników, kluczowe znaczenie ma bezwzględna kwantyfikacja wydajności wspomnianego nośnika w interakcji z komórkami docelowymi i niedocelowymi. Protokół ten opisuje dwustrumieniową metodologię, która pozwala każdemu badaczowi pracującemu z nośnikiem leku przekształcić względne, półilościowe dane cytom...

Projektowanie konstruktów dostarczających leki, które wykazują specyficzne, zaprojektowane zachowanie w zależności od typu komórek, z którymi się zetkną, wzbudziło duże zainteresowanie badawcze. Potencjalne konstrukty lub "nośniki" dostarczania leków obejmują preparaty lipidowe, nanohodowane substancje nieorganiczne, zespoły polimerowe, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, funkcjonalizowane komórki bakteryjne lub zmodyfikowane wirusy. Wszystkie te czynniki mogą wykazywać specyficzność narządów, tkanek lub komórek ze względu na właściwości fizyczne, właściwości powierzchni lub zmodyfikowane funkcjonalne funkcje chemiczne, takie jak przyłączanie przeciwciał1,2.
Prawie powszechnym krokiem w ocenie nośnika in vitro jest inkubacja komórek z zawiesiną zawierającą wspomniany nośnik naładowany lekiem. Po inkubacji wydajność nośnika mierzy się za pomocą funkcjonalnego odczytu wydajności ładunku leku, na przykład skuteczności transfekcji lub toksyczności. Odczyty funkcjonalne są przydatne, ponieważ są dalszą miarą efektywności nośnika. Jednak w przypadku bardziej złożonych konstruktów dostarczania leków coraz ważniejsze staje się wyjście poza odczyty funkcjonalne i oddzielne określenie ilościowe stopnia interakcji nośnika z komórką będącą przedmiotem zainteresowania. Jest ku temu kilka powodów.
Po pierwsze, rośnie zainteresowanie odkrywaniem (i iteracyjnym ulepszaniem) technologii przewoźników "platformowych", które mogą przewozić różne ładunki. Na przykład nanocząstki lipidowe (LNP) zaprojektowane do enkapsulacji RNA mogą wymieniać jedną sekwencję RNA na inną z kilkoma zastrzeżeniami3. W związku z tym, aby iteracyjnie ulepszać technologię nośnika, kluczowe znaczenie ma ilościowe określenie jej wydajności niezależnie od funkcjonalności ładunku. Po drugie, odczyty funkcjonalne mogą nie być proste dla ładunku będącego przedmiotem zainteresowania, co ogranicza zdolność do szybkiej iteracji i oceny receptur nośników. Podczas gdy można przeprowadzić optymalizację in vitro przy użyciu modelowego ładunku z prostym odczytem funkcjonalnym (na przykład fluorescencją), zmiana ładunku może zmienić odpowiedź biologiczną na carrier4, a zatem może nie dać reprezentatywnych wyników. Po trzecie, wiele nośników jest zaprojektowanych do interakcji z określonym typem komórek i bycia przez nie wchłanianymi. Taka zdolność przewoźnika do namierzania może i powinna być odróżniana od skuteczności jego terapeutycznego namierzania słupków ładunkowych. Kontynuując przykład LNP, ładunek RNA może być niezwykle silny, ale jeśli LNP nie jest w stanie związać się z komórką, zostać zinternalizowanym i uwolnić RNA, nie zaobserwuje się żadnego dalszego efektu funkcjonalnego. Może to stanowić problem szczególnie dla nośników przeznaczonych do celowania w trudne do transfekcji typy komórek, takie jak limfocyty T5. I odwrotnie, LNP może celować niezwykle skutecznie, ale ładunek RNA może nie działać. Test na dalszym etapie, który mierzy tylko funkcjonalność ładunku, nie będzie w stanie rozróżnić tych dwóch sytuacji, komplikując w ten sposób rozwój i optymalizację systemów dostarczania leków na nośniki.
W tej pracy omawiane jest bezwzględne ilościowe określenie powiązania przewoźnika. Asocjacja to termin odnoszący się do eksperymentalnie zmierzonego stopnia interakcji między nośnikiem a komórką. Asocjacja nie rozróżnia między wiązaniem błony a internalizacją - nośnik może być powiązany, ponieważ jest związany z powierzchnią komórki lub dlatego, że komórka go zinternalizowała. Asocjacja jest zwykle mierzona w ramach eksperymentów inkubacji nośnika komórkowego. Historycznie rzecz biorąc, asocjacja była zgłaszana albo w dowolnych jednostkach fluorescencyjnych (zazwyczaj "mediana intensywności fluorescencji" lub MFI) lub jako "procentowe powiązanie", metryki, których ograniczenia zostały wcześniej omówione6. Krótko mówiąc, pomiary te nie są porównywalne między eksperymentami, laboratoriami i nośnikami leków ze względu na różnice w protokołach eksperymentalnych, ustawieniach cytometru przepływowego i intensywności znakowania różnych nośników. Podjęto wysiłki, aby przezwyciężyć ten pierwszy problem poprzez kalibrację cytometru, przekształcając w ten sposób względną miarę MFI w absolutnie ilościową miarę fluorescencji7. Jednak metoda ta nie uwzględnia zmienności intensywności etykietowania różnych nośników, a zatem nie pozwala na racjonalne porównanie różnych parametrów nośników w wybranej komórce docelowej8.
Tutaj, jak praktycznie przekształcić względne, arbitralne jednostki fluorescencyjne na bezwzględną ilościową metrykę "liczba nośników na komórkę" demonstruje się poprzez przeprowadzenie niewielkiej liczby dodatkowych eksperymentów charakteryzujących. Jeśli pożądana jest inna miara stężenia nośnika (np. masa nośnika na komórkę lub objętość nośnika na komórkę), łatwo jest przeliczyć z nośników na komórkę, pod warunkiem, że przeprowadzono charakterystykę nośnika. Dla zwięzłości i uniknięcia żargonu, słowo "przewoźnik" jest używane w tej pracy w odniesieniu do szerokiego asortymentu konstruktów dostarczania leków. Te techniki kwantyfikacji mają równie duże zastosowanie, niezależnie od tego, czy stosuje się je do nanoinżynieryjnej cząsteczki złota, czy do bakterii poddanych bioinżynierii.
Kilka faktów umożliwia konwersję z dowolnych jednostek fluorescencyjnych na nośniki na komórkę. Po pierwsze, zmierzona intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do stężenia fluoroforu9 (lub nośnika znakowanego fluorescencyjnie), zakładając, że fluorescencja mieści się w granicach wykrywalności przyrządu, a ustawienia oprzyrządowania są takie same. Tak więc, jeśli znana jest fluorescencja nośnika i fluorescencja próbki, można określić, ile nośników jest obecnych w tej próbce, jeśli wszystkie pomiary zostały wykonane w tych samych ustawieniach i warunkach. Jednak, szczególnie w przypadku mniejszych nośników, pomiar fluorescencji nośnika, autofluorescencji komórek i fluorescencji komórek związanych z nosicielami na tym samym urządzeniu przy tych samych ustawieniach może nie być możliwy. W tym przypadku istnieje drugi wymóg, aby umożliwić konwersję między fluorescencją zmierzoną na jednym urządzeniu a zmierzoną fluorescencją na innym. W tym celu można ustalić standardową krzywą stężenia fluoroforu w celu pomiaru intensywności fluorescencji na obu instrumentach, korzystając z normy Molekuły równoważnego rozpuszczalnego fluorochromu (MESF)9. Pozwala to na pomiar fluorescencji nośnika luzem na urządzeniu innym niż cytometr, pomiar, który można wykonać na nośnikach o dowolnej wielkości lub charakterystyce. Gdy takie zbiorcze oznaczanie ilościowe przeprowadza się na zawiesinie nośnika o znanym stężeniu, można ponownie obliczyć liczbę nośników na komórkę próbki.
Podczas gdy ta praca demonstruje proces pomiaru asocjacji nośników (określanej przez zmierzoną intensywność fluorescencji), analogiczny protokół mógłby być przeprowadzony dla innych pomiarów interakcji komórka-nośnik (np. eksperymentalny protokół, który odróżnia nośniki zinternalizowane i związane z błoną). Ponadto protokół ten byłby w dużej mierze taki sam, gdyby asocjacja była mierzona za pomocą testu niefluorescencyjnego (na przykład za pomocą cytometrii masowej).

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Invitrogen</td><td>A20347</td><td>Barwnik stabilny pod względem pH stosowany do znakowania nośników PMA150 nm, 235 nm lub 633 nm PMASH; Przykład dobrego barwnika do stosowania w badaniach asocjacyjnych nośników komórkowych</td></tr><tr><td>Apogee A50 Microflow</td><td>Apogee</td><td></td><td>Czuły cytometr przepływowy zdolny do wykrywania małych nośników do liczenia</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Czuły cytometr przepływowy zdolny do wykrywania małych nośników do liczenia i odczytywania do końcowych eksperymentów z barierą komórkową Oprogramowanie</td></tr><tr><td>FCS Express</td><td>De Novo Oprogramowanie</td><td></td><td>służące do analizy danych cytometrii przepływowej, tj. wykonywania bramkowania i wyznaczania średnich wartości intensywności fluorescencji wybranych populacji. Alternatywy obejmują FlowJo, OMIQ, Python</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO</td><td>Tecan Lifesciences</td><td></td><td>Standardowy czytnik mikropłytek używany do masowych pomiarów fluorescencji nośników w roztworze</td></tr><tr><td>LSRFortessa Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Mniej czuły cytometr przepływowy, ale bardziej ogólnie dostępny dla badaczy. Może być używany do odczytu końcowego eksperymentu z nośnikiem komórkowym</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Instrument używany do analizy śledzenia nanocząstek</td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Oprogramowanie służące do tworzenia wykresów i obliczania krzywych standardowych. Alternatywy obejmują między innymi Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python Zestawy</td></tr><tr><td>Quantum MESF, Alexa Fluor 647</td>, <td>Bangs Laboratories</td><td>647</td>, <td>Absolutne kulki ilościowe do cytometrii przepływowej. Służy do przeliczania intensywności fluorescencji mierzonej masowo na czytniku mikropłytek na intensywności fluorescencji mierzonej na cytometrze przepływowym przy użyciu wzorca MESF</td></tr></tbody></table>

eksperymentalna kwantyfikacja interakcji między systemami dostarczania leków a komórkami in vitro: przewodnik po przedklinicznej ocenie nanomedycyny

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Głównym elementem projektowania systemów dostarczania leków jest sposób wzmacniania lub tłumienia interakcji z określonymi typami komórek. Na przykład chemioterapeutyk może być funkcjonalizowany przeciwciałem w celu zwiększenia wiązania z komórkami rakowymi ("celowanie") lub funkcjonalizowany glikolem polietylenowym, aby uniknąć rozpoznania komórek odpornościowych ("podstęp"). Nawet na poziomie komórkowym optymalizacja wiązania i wychwytu nośnika leku jest złożonym problemem projektowania biologicznego. W związku z tym cenne jest oddzielenie tego, jak silnie nowy przewoźnik oddziałuje z komórką, od skuteczności funkcjonalnej ładunku przewoźnika po dostarczeniu do tej komórki.
Kontynuując przykład z chemioterapeutyką, "jak dobrze wiąże się z komórką rakową" jest oddzielnym problemem od "jak dobrze zabija komórkę rakową". Ilościowe testy in vitro dla tych ostatnich są dobrze ugruntowane i zwykle opierają się na pomiarze żywotności. Jednak większość opublikowanych badań nad interakcjami komórka-nośnik ma charakter jakościowy lub półilościowy. Ogólnie rzecz biorąc, pomiary te opierają się na znakowaniu fluorescencyjnym nośnika, a w konsekwencji raportują interakcje z komórkami w jednostkach względnych lub dowolnych. Jednak praca ta może być ustandaryzowana i może być całkowicie ilościowa przy niewielkiej liczbie eksperymentów charakteryzujących. Taka bezwzględna kwantyfikacja jest cenna, ponieważ ułatwia racjonalne, między- i wewnątrzklasowe porównania różnych systemów dostarczania leków – nanocząstek, mikrocząstek, wirusów, koniugatów przeciwciało-lek, zmodyfikowanych komórek terapeutycznych lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
Ponadto, kwantyfikacja jest warunkiem wstępnym dla kolejnych metaanaliz lub podejść do modelowania in silico. W tym artykule przedstawiono przewodniki wideo, a także drzewo decyzyjne dotyczące sposobu osiągnięcia kwantyfikacji in vitro dla systemów dostarczania leków na nośniki, które uwzględniają różnice w wielkości nośnika i modalności znakowania. Ponadto omówiono dalsze rozważania dotyczące oceny ilościowej zaawansowanych systemów dostarczania leków. Ma to służyć jako cenne źródło informacji na temat poprawy racjonalnej oceny i projektowania leków nowej generacji.

Jak omówiono wcześniej, różne rodzaje nośników leków wymagają zastosowania różnych technik do absolutnego ilościowego oznaczenia asocjacji komórka-nośnik. Na przykład cząstki rdzeń-powłoka z poli(kwasu metakrylowego) stabilizowanego wiązaniami disiarczkowymi (PMASH) o długości fali 63 nm są wystarczająco duże i gęste, aby można było je wykryć za pomocą czułego cytometru przepływowego. W związku z tym cząstki te zostały znakowane fluorescencyjnie, a następnie poddane bramkowaniu i zliczone z wykorzystaniem bocz...

Pokazano przepływ pracy do bezwzględnej kwantyfikacji interakcji nośnik leku z komórką za pomocą cytometrii przepływowej, aby umożliwić lepszą racjonalną ocenę nowych systemów dostarczania leków. Ten przepływ pracy ma zastosowanie do nośników leków dowolnego typu.

Eksperymentalna kwantyfikacja interakcji między systemami dostarczania leków a komórkami in vitro: przewodnik po przedklinicznej ocenie nanomedycyny

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Protokół ten dostarcza danych ilościowych na temat interakcji systemów nośników z komórkami. Dane ilościowe mają kluczowe znaczenie dla inżynierii i optymalizacji. Pozwala nam przejść od pytań biologicznych "tak" lub "nie" do tego, ile pytań.Technika ta jest przydatna do przekształcania wyników z przedklinicznej wydajności nośnika leku, które były jakościowe, w wyniki ilościowe. Działa to nawet wtedy, gdy scharakteryzujesz swojego nosiciela w innym systemie niż charakteryzujesz swoje komórki. Znalezienie optymalnego rozcieńczenia nośnika, które mieści się w zakresach liniowych lub ilościowych strony nano, może zająć kilka iteracji.Nie spiesz się ze znalezieniem odpowiednich warunków. Aby rozpocząć, zamontuj komórkę przepływową na module laserowym. Powoli przepłucz komórkę przepływową z szybkością 0,1 mililitra na sekundę jednym mililitrem wody destylowanej.Jeśli w komorze przepływowej tworzą się pęcherzyki, przed kontynuowaniem częściowo wycofaj zawiesinę, aby połączyć pęcherzyk z interfejsem powietrze-ciecz. Następnie zablokuj cały moduł laserowy na miejscu wewnątrz instrumentu. Uruchom aparat mniej więcej w połowie spłukiwania.Pamiętaj, aby upewnić się, że zanieczyszczenia z nośnika są wypłukane. Wybierz przechwytywanie, aby otworzyć kartę ustawień przechwytywania i kliknij uruchom kamerę. Napędzaj system jednym mililitrem powietrza.Jeśli na ekranie widoczne są jakiekolwiek nośniki statyczne, wyczyść komorę przepływową zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotuj nośniki do analizy śledzenia nanocząstek, upewniając się, że nośniki są dobrze zawieszone za pomocą sonikacji lub wirowania, w zależności od zaangażowanego systemu nośnego. Rozcieńczyć nośniki w wodzie, aby przygotować co najmniej 0,6 do jednego mililitra każdej próbki o stężeniu nośnika między 1x10 do siódmego i 1x10 do dziewiątego nośnika na mililitr.Wyjmij moduł laserowy i ustaw go pionowo. Wrzuć pierwszą próbkę nośnika do jednomililitrowej strzykawki i przymocuj strzykawkę do wlotu probówki. Następnie ostrożnie załaduj próbkę do komory przepływowej.Jeśli w komorze przepływowej tworzą się pęcherzyki, przed kontynuowaniem należy częściowo wycofać zawiesinę, aby połączyć pęcherzyk z interfejsem powietrze-ciecz. Upewnij się, że cała komora przepływowa jest wypełniona cieczą, a następnie wstrzymaj ładowanie. W razie potrzeby dostosuj ostrość kamery, aby zobrazować poszczególnych przewoźników.Dokonaj zgrubnej regulacji ostrości za pomocą pokrętła po prawej stronie instrumentu. Dokonaj dokładniejszych regulacji, wybierając kartę sprzętu. Zmień ostrość, dostosowując suwak ostrości.Aby upewnić się, że nie ma przesycenia, wybierz optymalny poziom kamery, przesuwając suwak na karcie przechwytywania. Jeśli przyrząd jest wyposażony w to akcesorium, załaduj strzykawkę zawierającą próbkę nośnika do pompy strzykawkowej. Na karcie SOP wybierz pomiar standardowy, aby wykonać pięć ujęć po 30 sekund każde.Wprowadź nazwę pliku podstawowego i w razie potrzeby dodaj dodatkowe informacje o próbce, klikając przycisk zaawansowane, który otworzy modalne okno dialogowe z różnymi opcjami. Naciśnij utwórz i uruchom skrypt i poczekaj, aż pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o przejście próbki. Jeśli używasz pompy strzykawkowej, wybierz zakładkę sprzęt, a następnie zakładkę pompy strzykawkowej.Ustaw żądaną szybkość infuzji i naciśnij przycisk zaparzania. Jeśli pompka strzykawkowa nie jest używana, należy ręcznie przesunąć próbkę. W wyskakującym okienku wybierz OK, aby rozpocząć przechwytywanie.Po każdym z pięciu przechwyceń, gdy ponownie pojawi się wyskakujące okienko z zaawansowaną próbką, sprawdź, czy próbka nadal porusza się w komórce przepływowej. Następnie wybierz przycisk OK, aby kontynuować następne przechwytywanie. Na karcie procesu ustaw suwak progu wykrywania w zakresie od czterech do ośmiu, aby poprawnie zidentyfikować różnych nośników widocznych na ekranie.Możesz dostosować wzmocnienie ekranu, aby ułatwić wizualizację, nie wpłynie to na dalszą analizę. W wyskakującym okienku naciśnij OK, aby rozpocząć analizę śledzenia. Monitoruj postęp analizy, klikając na zakładkę analizy w pojedynczej analizie.Po zakończeniu analizy poszukaj monitu o ustawienia eksportu. Upewnij się, że jest zaznaczona opcja dołączania pliku PDF i dołączania podsumowania eksperymentu. Wybierz dowolne inne formaty eksportu zgodnie z potrzebami.W sekcji wyników eksportu danych PDF, aby upewnić się, że zmierzone stężenie jest wiarygodne, sprawdź, czy zmierzone stężenie nośnika mieści się w przedziale od 1x10 do siódmego i od 1x10 do dziewiątego nośnika na mililitr i sprawdź, czy pod wynikiem pomiaru stężenia nie ma komunikatów o błędach lub komunikatów ostrzegawczych. Powtórzyć procedurę dwa lub więcej razy z różnymi rozcieńczeniami z podstawki i upewnić się, że stężenie każdej próbki mieści się w liniowym zakresie przyrządu. Obliczyć stężenie nośnika materiału zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.Przygotować wolny lub sprzężony z przeciwciałami roztwór fluorochromu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Obliczyć stężenie roztworu podstawowego na podstawie stężenia, masy cząsteczkowej i liczby Avogadro, jak pokazano w równaniu. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczanie barwnika w rozcieńczalniku nośnika, aby wygenerować próbki krzywej wzorcowej.Następnie dodaj próbkę nośnika do płytki pomiarowej i zmierz fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek. Wygeneruj krzywą standardową zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Obliczyć bezwzględną intensywność fluorescencji na nośnik, dzieląc fluorescencję objętościową przez stężenie nośnika.Ustaw cytometr przepływowy do końcowego eksperymentu z komórką nośną, określając optymalne ustawienia napięcia PMT w odpowiednich kanałach. Uruchomić ujemną próbkę kontrolną, w której komórki nie są inkubowane z nośnikami, aby określić fluorescencję tła. Przygotować i ponownie zawiesić kulki kwantymetryczne cytometrii przepływowej.Użyj tego samego buforu, który jest używany do próbek komórek. Jeśli populacje ściegów są podane osobno, połącz je ze sobą. Uruchomić kulkę kwantymetryczną cytometrii przepływowej i próbki komórek nośnych, aby określić intensywność fluorescencji na komórkę.Uruchom kulki ilościowe cytometru przepływowego, aby wygenerować krzywą standardową, przekształcając bezwzględną intensywność fluorescencji na MFI. Służy do obliczenia teoretycznej MIF przewoźników zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Uruchom próbki nośników komórek, aby określić intensywność fluorescencji na komórkę każdej próbki.Na koniec oblicz liczbę nośników na komórkę dla każdej próbki, odejmując fluorescencję tła od zmierzonej fluorescencji próbki, a następnie dzieląc przez fluorescencję na cząstkę. W przypadku cząstek rdzenia rdzeniowego z kwasu polimetakrylowego o długości 633 nanometrów, stężenie i intensywność fluorescencji na nośnik były bezpośrednio mierzalne za pomocą strumienia cytometru. Natomiast superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza o wielkości 100 nanometrów były zbyt małe, aby można je było wykryć pojedynczo i analizowano je przy użyciu strumienia masowego.Znakowane kulki ilościowe były używane przez wiele dni do generowania standardowych krzywych na cytometrze przepływowym. Korelacja między zmierzonym MFI a wartością MESF kulek ilościowych była liniowa i zasadniczo podobna między zmierzonymi datami. Eksperymenty z użyciem znakowanych fluorescencyjnie komórek HeLa z kapsułkami z polimetakrylowym o długości 235 nanometrów od zera do 24 godzin wykazały wzrost MFI w czasie, co wskazuje, że kapsułki kojarzyły się z komórkami HeLa.Różnica w pozornej odpowiedzi komórkowej na nosicieli była wyraźna, w zależności od względnej lub bezwzględnej kwantyfikacji. Bezwzględna kwantyfikacja była niezależna od intensywności znakowania, a zatem bardziej porównywalna. Techniki te stanowią podstawę do głębszej analizy i porównania wydajności cząstek.Jesteśmy podekscytowani możliwością wykorzystania tych technik do parametryzacji modeli matematycznych, co pozwoli nam scharakteryzować wydajność cząstek niezależnie od konkretnego eksperymentu.

experimental-quantification-interactions-between-drug-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Wiele zastosowań terapeutycznych wymaga bezpiecznego i wydajnego transportu nośników leków i ich ładunków przez bariery komórkowe w ciele.  W artykule opisano adaptację uznanych metod do oceny szybkości i mechanizmu transportu nanonośników leków (NC) przez bariery komórkowe, takie jak nabłonek przewodu pokarmowego (GI).

Modele i metody oceny transportu systemów dostarczania leków przez bariery komórkowe

Celem tego protokołu jest opisanie przygotowania i charakterystyki fizycznie uwięzionych, słabo rozpuszczalnych w wodzie leków w systemach dostarczania leków micelarnych składających się z amfifilowych kopolimerów blokowych.

Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

Nanocząsteczki stają się obiecującymi systemami dostarczania leków dla szerokiego zakresu wskazań. Tutaj opisujemy prostą, ale potężną metodę wytwarzania nanocząstek jedwabiu przy użyciu odwróconego jedwabiu Bombyx mori. Te nanocząstki jedwabiu można łatwo załadować ładunkiem terapeutycznym, a następnie zbadać pod kątem zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

Produkcja i dostarczanie leków Zastosowania nanocząstek jedwabiu

Słabe zrozumienie skuteczności nanoleków in vivo utrudnia ich kliniczne tłumaczenie. Opisano tutaj procedury oceny zachowania in vivo nanoleków przeciwnowotworowych na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym, jednokomórkowym i subkomórkowym u myszy immunokompetentnych z nowotworem. Podejście to może pomóc naukowcom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków przeciwnowotworowych do zastosowania klinicznego.

Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

Obrazowanie żywych komórek to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych procesów. Badanie nieruchomych komórek dostarcza jedynie statycznych obrazów, co może prowadzić do błędnej interpretacji i zamieszania co do procesu. W pracy przedstawiono metodę badania wychwytu, uwalniania leków i lokalizacji wewnątrzkomórkowej nanocząstek liposomalnych w żywych komórkach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek in vitro do badania chemioterapeutyków dostarczanych przez nanocząstki na bazie lipidów

Ten protokół opisuje efektywny i wygodny proces analityczny pobierania próbek i jednoczesnego oznaczania wielu leków, doksorubicyny (DOX), mitomycyny C (MMC) i kardiotoksycznego metabolitu DOX, doksorubicyny (DOXol), w próbkach biologicznych z przedklinicznego modelu guza piersi traktowanego preparatami nanocząsteczkowymi synergicznego połączenia leków.

Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

Tutaj prezentujemy szczegółowe metody przygotowania i oceny nosowej samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsji in vitro i in vivo.

Przygotowanie, charakterystyka, toksyczność i skuteczność oceny samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsją do nosa in vitro i in vivo

Wprowadzamy cztery metody oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząsteczek i powierzchni nanostrukturalnych za pomocą technik in vitro. Metody te można zaadaptować do badania interakcji różnych nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych z szeroką gamą gatunków drobnoustrojów.

Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych in vitro

Poznaj metodę kwantyfikacji interakcji nośników leków z komórkami in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia racjonalną ocenę systemów dostarczania leków w badaniach przedklinicznych.

Eksperymentalna kwantyfikacja interakcji między systemami dostarczania leków a komórkami in vitro: przewodnik po przedklinicznej ocenie nanomedycyny (Wideo) | JoVE Journal

Eksperymentalna kwantyfikacja interakcji między systemami dostarczania leków a komórkami in vitro: przewodnik po przedklinicznej ocenie nanomedycyny

Przeglądaj więcej filmów