Name: Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj metodę CRISPR/Cas9 i rAAV do modelowania heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich komórkach macierzystych krwi. Ta technika umożliwia precyzyjne badanie transformacji leukemicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF; numer P32783 i I5021) dla A.R. Dodatkowe fundusze dla A.R. są również zapewnione przez Austriackie Towarzystwo Medycyny Wewnętrznej (Joseph Skoda Fellowship), Austriackie Towarzystwo Hematologii i Onkologii (OeGHO; Clinical Research Grant) oraz MEFOgraz. T.K. jest Specjalnym Członkiem Towarzystwa Białaczki i Chłoniaka.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Skuteczna i precyzyjna manipulacja genetyczna ludzkich pierwotnych HSPC stanowi doskonałą okazję do zbadania i zrozumienia procesów wpływających na prawidłową hematopoezę, a co najważniejsze, na białaczkową transformację komórek krwiotwórczych.
W protokole tym opisano skuteczną strategię inżynierii ludzkich HSPC w celu ekspresji nawracających heterozygotycznych mutacji GOF. W procedurze tej wykorzystano technologię CRISPR/Cas9 i wektory rAAV6 jako dawców matryc DNA w celu precyzyjnego wprowadzenia WT i zmutowanych sekwencji DNA do ich endogennych loci genów. Sprzężenie zmodyfikowanych cDNA (WT i mutanta) z oddzielonymi fluorescencyjnymi białkami reporterowymi pozwala na wzbogacenie i śledzenie komórek o określonym stanie heterozygotycznym.
Strategia ta ma kilka zalet w porównaniu z często stosowanymi metodami opartymi na lentiwirusach (LV). Jedną z głównych zalet jest to, że system oparty na CRISPR/Cas9 pozwala na precyzyjną edycję w endogennych loci, co skutkuje zachowaniem endogennych promotorów i elementów regulatorowych. Prowadzi to do jednorodności ekspresji edytowanego genu w komórkach, co jest celem trudno osiągalnym, gdy stosuje się metodę opartą na LV. Transfer genów z wektorami LV prowadzi do półlosowej integracji genu z preferencją dla miejsc aktywnych transkrypcyjnie34. Może to przekładać się na nadekspresję przenoszonego genu i niejednorodność między edytowanymi komórkami, co ostatecznie skutkuje trudnościami w badaniu i analizowaniu roli mutacji i interakcji genów. Drugą zaletą jest to, że opisywany system, będąc systemem edycji specyficznym dla danego miejsca, eliminuje ryzyko mutagenezy insercyjnej35.
Strategia podwójnego fluorescencyjnego reportera pozwala na precyzyjne wzbogacanie i śledzenie komórek, które zostały pomyślnie edytowane na obu allelach, przy czym jeden allel integruje cDNA WT, a drugi allel integruje zmutowane sekwencje cDNA. Komórki wyrażające tylko pojedynczy reporter reprezentują albo tylko integrację monoalleliczną, albo całkowanie bialleliczne matryc HDR z tym samym reporterem fluorescencyjnym. Oba scenariusze można precyzyjnie rozróżnić tylko wtedy, gdy klony pochodzące z pojedynczych komórek są produkowane i indywidualnie analizowane. Jednak HSPC mają tylko ograniczoną zdolność proliferacyjną in vitro, a gdy są trzymane w hodowli przez dłuższy czas, HSPC zaczynają różnicować się w bardziej dojrzałe potomstwo i tracą zdolność do samoodnawiania się i wszczepiania. To sprawia, że selekcja i namnażanie klonów pojedynczych komórek, które zawierają pożądaną mutację heterozygotyczną, jest niewykonalne. Zastosowanie strategii podwójnej fluorescencji białek i wzbogacenie za pomocą cytometrii przepływowej dla komórek z mutacją heterozygotyczną pozwala na ominięcie problemów wywołanych rozszerzoną hodowlą in vitro .
W tym konkretnym przykładzie udało się wykazać, że HSPC mogą być skutecznie modyfikowane i sortowane w celu uzyskania czystych populacji HSPC z heterozygotyczną mutacją CALRDEL/WT.
Jednak system ten nie ogranicza się do inżynierii heterozygotycznych mutacji przesunięcia ramki odczytu, ale może być również łatwo zaadoptowany do tworzenia innych typów mutacji, w tym mutacji missense i nonsensownych. Stosując różne kombinacje AAV zawierających WT lub zmutowane sekwencje z różnymi fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, system ten może być również wykorzystany do wprowadzenia mutacji homozygotycznych (jednoczesna transdukcja z dwoma rAAV, z których oba zawierają zmutowane cDNA, ale różne reportery fluorescencyjne), a nawet korektę mutacji (jednoczesna transdukcja z dwoma AAV, z których oba zawierają cDNA WT, ale różne reportery fluorescencyjne). Dodatkowo należy wspomnieć, że strategia ta nie ogranicza się do wprowadzania onkogennych mutacji GOF. W rzeczywistości opisany protokół może być wykorzystany do wielu alternatywnych strategii, w tym do nokautu genów, wymiany genów36,37, ukierunkowanego knock-inu transgenów (tj. chimerycznych receptorów antygenowych)38, a nawet do korekcji mutacji powodujących chorobę11,39.
Wykazano również, że strategia łączenia CRISPR/Cas9 i AAV6 z wieloma reporterami fluorescencyjnymi ma zastosowanie w wielu innych typach komórek, w tym limfocytach T, plazmocytoidalnych komórkach dendrytycznych, indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych, neuronalnych komórkach macierzystych i komórkach macierzystych dróg oddechowych 24,38,40,41,42,43,44. Strategia ta może być stosowana do produkcji limfocytów T o doskonałym chimerycznym receptorze antygenowym (CAR). Na przykład niedawno opublikowano, że nokaut genu TGFBR2 za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach CAR T znacznie zwiększa ich funkcję w supresyjnym mikrośrodowisku guza bogatym w TGF-β45. Takie podejście może zapewnić jednoetapowy protokół zarówno do inżynierii limfocytów T w celu ekspresji CAR, jak i do wyeliminowania genu TGFBR2 poprzez specyficzne wprowadzenie CAR do obu alleli genu TGFBR2. Co więcej, podejście to może być również przydatne do generowania uniwersalnych limfocytów CAR T poprzez integrację CAR z genem stałej alfa receptora limfocytów T (TRAC)46,47.
Aby zwiększyć odtwarzalność i zagwarantować wydajną edycję komórek, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii. Główne punkty krytyczne dla zapewnienia pomyślnej edycji komórek znajdują się w (i) wyborze sgRNA, (ii) projekcie szablonu HDR oraz (iii) produkcji rAAV6.
Wybór dobrze działającego sgRNA jest kluczowy, ponieważ określi maksymalną liczbę alleli, w których można zintegrować matrycę HDR. Dzięki licznemu oprogramowaniu, które jest obecnie dostępne, wyszukiwanie potencjalnych sgRNA zostało uproszczone. Wybierając obszar zainteresowania, oprogramowanie może zaproponować serię sgRNA z wynikiem on-target i off-target, które wskazują szanse na edycję odpowiednio w pożądanym locus i niechcianych loci. Wyniki te są obliczane na podstawie wcześniej opublikowanych modeli punktacji48,49. Chociaż jest to dobry punkt wyjścia do wyboru dobrze działającego sgRNA, wydajność sgRNA musi zostać potwierdzona, ponieważ jego przewidywana wydajność in silico nie zawsze odpowiada skutecznemu sgRNA in vitro. Dlatego zdecydowanie zaleca się zaprojektowanie i przetestowanie co najmniej trzech sgRNA, aby zwiększyć szanse na znalezienie najlepszego sgRNA. Po zidentyfikowaniu naprawdę dobrze działającego sgRNA sugeruje się przystąpienie do projektowania szablonu HDR.
Podczas projektowania szablonu HDR należy wziąć pod uwagę środki ostrożności. Lewe i prawe ramię homologiczne (odpowiednio LHA i RHA) powinno obejmować odpowiednio 400 pz w górę i w dół od miejsca przecięcia sgRNA, ponieważ krótsze HA mogą skutkować zmniejszeniem częstotliwości HDR. Wielkość cDNA, która może zostać wprowadzona za pomocą HDR, zależy od możliwości pakowania AAV, które wynoszą około 4,7 kb. Ze względu na liczne elementy obowiązkowe w matrycy HDR (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor i fluorescencyjna sekwencja reporterowa), pozostała przestrzeń dla zmutowanego lub WT cDNA jest ograniczona. Nie jest to problematyczne, jeśli pożądana mutacja znajduje się w pobliżu końca 3' genu lub w genach z ogólnie krótkim CDS. Jednak w przypadkach, gdy mutacja znajduje się w pobliżu początkowej strony transkrypcji (TSS) genów z długim CDS (przekraczającym pozostałą przestrzeń pakowania AAV), to opisane podejście może być niewykonalne. Aby obejść ten problem, Bak i jego koledzy opracowali niedawno strategię, która opiera się na podziale szablonu HDR na dwa AAV. Strategia ta opiera się na dwóch oddzielnych integracjach za pośrednictwem HDR, aby uzyskać ostateczną bezproblemową integrację dużego genu50.
Jakość wirusa i jego miano są dodatkowymi czynnikami, które mogą zadecydować o sukcesie lub porażce inżynierii genomu komórek. Aby uzyskać optymalny plon, ważne jest, aby nie dopuścić do osiągnięcia pełnej zbieżności HEK293T podczas utrzymywania w kulturze. Idealnie, komórki HEK293T powinny zostać podzielone po osiągnięciu zbiegu 70%-80%. Ponadto HEK293T nie powinny być hodowane przez długi czas, ponieważ może to zmniejszyć ich zdolność do wytwarzania wirusa. Nowe HEK293T komórki należy rozmrozić po 20 przejściach. Uzyskanie wysokich mian wirusów jest ważne dla zwiększenia wydajności i odtwarzalności eksperymentów. Niskie miana wirusa przekładają się na duże ilości roztworu rAAV wymaganego do transdukcji HSPC. Zgodnie z ogólną zasadą, roztwór rAAV dodany do komórek nukleofektycznych nie powinien przekraczać 20% całkowitej objętości pożywki retencyjnej HSPC. Większe objętości roztworu AAV mogą prowadzić do zwiększonej śmierci komórek, mniejszej proliferacji i upośledzenia wydajności transdukcji. W przypadku niskich mian wirusa zaleca się zatem dalszą koncentrację wirusa.
Podsumowując, protokół ten oferuje powtarzalne podejście do precyzyjnego i wydajnego manipulowania ludzkimi HSPC poprzez jednoczesne wykorzystanie matryc dawców CRIPSR/Cas9 i rAAV6 z dodatkowymi podwójnymi reporterami fluorescencyjnymi. Podejście to okazało się doskonałym narzędziem w badaniu normalnej biologii krwiotwórczych komórek macierzystych i wkładu, jaki mutacje wnoszą w białaczkę.

Wraz z rozwojem technologii CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), do instrumentarium naukowców dołączyło nowe i niezwykle potężne narzędzie. Technologia ta umożliwia precyzyjną inżynierię genomu i okazała się niezwykle użyteczna nie tylko w celach badawczych (przegląd w Hsu et al.1), ale w ostatnim czasie została również z sukcesem przeniesiona do praktyki klinicznej2,3,4. Strategie edycji CRISPR/Cas9 opierają się na aktywności białka Cas9 oraz pojedynczego przewodniego RNA (sgRNA)5,6,7. W komórce gospodarza białko Cas9 jest kierowane do specyficznego miejsca w DNA, które jest komplementarne do sekwencji sgRNA, gdzie wprowadza dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB). Po powstaniu DSB mogą wystąpić dwa główne i konkurencyjne mechanizmy naprawy: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) oraz naprawa kierowana homologią (HDR). NHEJ jest podatnym na błędy i dominującym mechanizmem naprawy, prowadzącym do insercji i delecji (indels), podczas gdy HDR, wykorzystując siostrzaną chromatydę jako matrycę naprawczą, jest bardzo precyzyjny, lecz ograniczony do fazy S lub G2 cyklu komórkowego8. W inżynierii genomu HDR może być wykorzystywany do ukierunkowanej modyfikacji DNA poprzez dostarczenie matrycy donora, która jest flankowana ramionami homologii identycznymi z oboma końcami DNA w miejscu wywołanego przez Cas9 DSB (Rycina 1). Rodzaj matrycy donora użytej do HDR może mieć znaczący wpływ na wydajność edycji. W przypadku inżynierii genetycznej ludzkich HSPC, wirus adeno-zależny serotypu 6 (AAV6) został niedawno opisany jako doskonały nośnik do dostarczania jednoniciowych matryc DNA9,10.
Inżynieria genomu CRISPR/Cas9 może być stosowana terapeutycznie w celu korekcji szkodliwych mutacji11, ale może być również wykorzystywana do wprowadzania mutacji patogennych do DNA w celu modelowania rozwoju nowotworów12. Nowotwory krwi, takie jak białaczka, rozwijają się via sekwencyjną akwizycję mutacji somatycznych w zdrowych HSPCs13,14. Wczesne zdarzenia genetyczne prowadzą do klonalnej przewagi proliferacyjnej, skutkując klonalną hematopoezą o nieokreślonym potencjale (CHIP)15,16. Dalsza akwizycja mutacji ostatecznie prowadzi do transformacji białaczkowej i rozwoju choroby. Mutacje somatyczne można znaleźć w genach kontrolujących samoodnawianie, przeżycie, proliferację i różnicowanie17.
Wprowadzanie pojedynczych mutacji via inżynieria genomu do zdrowych HSPC umożliwia precyzyjne modelowanie tego stopniowego procesu leukemogennego. Ograniczona liczba nawracających mutacji stwierdzanych w nowotworach mieloidalnych, takich jak ostra białaczka szpikowa (AML)18,19, sprawia, że choroba ta jest szczególnie podatna na odtworzenie z wykorzystaniem narzędzi inżynierii genomu.
Mutacje somatyczne mogą pojawić się tylko w jednym allelu (mutacje monoalleliczne/heterozygotyczne) lub w obu allelach (mutacje bialleliczne/homozygotyczne) i mogą mieć głęboki wpływ na funkcję genu, co może prowadzić do utraty funkcji (LOF) lub nabycia funkcji (GOF). Mutacje LOF prowadzą do częściowej (jeśli dotyczy jednego allelu) lub całkowitej (jeśli dotyczy obu alleli) utraty funkcji genu, natomiast mutacje GOF prowadzą do zwiększonej aktywacji lub nabycia nowej funkcji genu. Mutacje GOF są zazwyczaj heterozygotyczne20.
Ważne jest, aby pamiętać, że zygotyczność (hetero- lub homozygoticzność) ma istotne znaczenie dla próby wiernego modelowania mutacji; w związku z tym, w celu wprowadzenia heterozygotycznych mutacji typu GOF w hotspotach niezbędna jest celowana manipulacja tylko jednym allelem genu. Podatne na błędy NHEJ prowadzi do powstania indeli o różnej długości21, co może skutkować zróżnicowanymi, nieprzewidywalnymi następstwami biologicznymi. Jednakże, ponieważ NHEJ jest dominującym programem naprawy wykorzystywanym przez komórki po wprowadzeniu DSB, większość obecnie stosowanych platform CRISPR/Cas9 do manipulacji HSPC nie pozwala na precyzyjne przewidzenie wyniku genetycznego22,23. W przeciwieństwie do tego, wprowadzenie pęknięcia dwuniciowego (DSBs) za pomocą CRISPR/Cas9, w połączeniu z zastosowaniem donorowych matryc DNA opartych na wektorach rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAV) do inżynierii genomu via HDR, umożliwia allelo-specyficzną insercję mutacji w ludzkich HSPC11,24. W celu wyselekcjonowania genotypu heterozygotycznego można przeprowadzić jednoczesną integrację sekwencji zmutowanej i typu dzikiego (WT) wraz z odrębnymi reporterami fluorescencyjnymi na poszczególnych allelach (Rycina 2). Strategia ta może zostać wykorzystana jako potężne narzędzie do precyzyjnej charakterystyki wpływu nawracających, leukemicznych, heterozygotycznych mutacji GOF w hotspotach na funkcję HSPC, inicjację oraz progresję choroby.
W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowy protokół efektywnego wprowadzania często występujących heterozygotycznych mutacji typu GOF do pierwotnych ludzkich komórek HSPC. Strategia ta łączy zastosowanie systemu CRISPR/Cas9 z podwójną transdukcją AAV6 w celu dostarczenia matryc donorowych DNA typu WT i mutant dla przyszłego wygenerowania heterozygotycznej mutacji GOF. Jako przykład zaprezentowano wprowadzanie często występujących mutacji typu 1 (delecja 52 bp) w genie kalretikuliny (CALR)25. Heterozygotyczna mutacja GOF w eksonie 9 genu CALR jest często stwierdzana w schorzeniach mieloproliferacyjnych, takich jak samoistna trombocytemia (ET) i pierwotna mielofibroza (PMF)26. CALR jest białkiem rezydującym w siateczce śródplazmatycznej, którego główną funkcją jest kontrola jakości w procesie fałdowania nowo syntetyzowanych białek. Jego strukturę można podzielić na trzy główne domeny: domenę aminową (N)-terminalną oraz bogatą w prolinę domenę P, które biorą udział w funkcji chaperonowej białka, oraz domenę C, zaangażowaną w magazynowanie i regulację poziomu wapnia27,28. Mutacje CALR powodują przesunięcie ramki odczytu o +1, co prowadzi do transkrypcji nowego, wydłużonego końca C-terminalnego oraz utraty sygnału retencji w siateczce śródplazmatycznej (ER) (KDEL). Wykazano, że zmutowana kalretikulina wiąże receptor trombopoetyny (TPO), co prowadzi do niezależnego od TPO przekazywania sygnałów i zwiększonej proliferacji29.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig01v2.jpg" /> 
Rysunek 1: Naprawa NHEJ i HDR. Uproszczony schemat mechanizmów naprawy NHEJ i HDR po wprowadzeniu pęknięcia dwuniciowego w DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Schematyczna analiza strategii biallelicznej edycji HDR. Przedstawienie schematyczne ukazujące integrację matryc donorowych do docelowych alleli, a następnie ich translację na funkcjonalne mRNA. Pomarańczowe przerywane ramki wskazują regiony odpowiadające lewemu ramieniu homologii (LHA) i prawemu ramieniu homologii (RHA). Idealna wielkość każdego z ramion HA wynosi 400 bp. Zielona przerywana ramka reprezentuje region odpowiadający sekwencji SA. Wielkość SA wynosi 150 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>175 cm2 Kolba do hodowli komórkowych, nasadka odpowietrzająca, Corning</td><td></td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>Szalki 150 mm x 25 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>293T</td><td>DSMZ</td><td>ACC 635</td><td>https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635</td></tr><tr><td>4D Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza-Do</td><td></td> <td>nukleofekcji ludzkich HSPC użyj programu DZ-100.</td></tr><tr><td>Jednostka 4D Nucleofector X</td><td>Lonza-500</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ml Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td> Zestaw do oczyszczania <td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>AAVpro</td><td>Takara</td><td>6666</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Avanti JXN-30</td><td>Beckman Narzędzie</td><td></td> do projektowania sgRNA Coulter-Benchling <td></td></tr><tr><td></td><td>Narzędzie online do projektowania sgRNA: http://www.benchling.com/crispr</td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich A7906-100G C1000 Touch Termocykler Bio-Rad-Chemicznie modyfikowany syntetyczny sgRNA Synthego <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Strona internetowa: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sekwencja dla sgRNA ukierunkowanego na intron 7 CALR: 5'-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3' &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Rusztowanie SpCas9 składające się z 80 nukleotydów dodaje się do sekwencji 20 nukleotydowych RNA w celu uzupełnienia sgRNA. Modyfikacje chemiczne 2'-O-metylu są dodawane do pierwszych i ostatnich 3 zasad, a wiązania 3' fosforotanianu są dodawane do pierwszych 3 i ostatnich 2 zasad. &nbsp; &nbsp; &nbsp; *Alternatywnie chemicznie modyfikowane syntetyczne sgRNA można pozyskać z</td> narzędzia</tr> <tr><td></td><td></td><td>do projektowania sgRNA</td> IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) i Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)CHOPCHOP <td>Narzędzie online do projektowania sgRNA: http://chopchop.cbu.uib.no</td></tr><tr><td>Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td> Narzędzie do projektowania sgRNA <td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>CRISPick</td><td></td><td></td><td>Narzędzie online do projektowania sgRNA: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public</td></tr><tr>Narzędzie <td></td><td></td> do<td>projektowania sgRNA CRISPOR</td><td>Narzędzie online do projektowania sgRNA: http://crispor.tefor.net</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki ddPCR</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)</td><td>Wkłady Bio-Rad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>DG8 do generatora kropel QX200/QX100&nbsp;</td><td>Uszczelki Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 do generatora kropel QX200/QX100&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Olejek do generowania kropelek do sond</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion</td><td>BD Biosciences-Falcon</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 ml Okrągłodenna</td> surowica <td>bydlęca Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>(FBS) Good Forte (inaktywowana termicznie), 500 ml</td><td>Pan Biotech</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.0</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>GenAgarose L.E.</td><td>Inno-train</td><td>GX04090</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus Drabinka DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0321</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs Inc. (NEB)</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ICE</td><td>Synthego</td><td></td><td>https://ice.synthego.com</td></tr><tr><td>Narzędzie do optymalizacji kodonów IDT</td><td></td><td></td> Narzędzie do projektowania sgRNA IDT <td></td> https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool</tr><tr><td>IDT</td><td>Narzędzie online do projektowania sgRNA: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM</td>LB Bulion (Lennox) EZMix w proszku pożywka do wzrostu mikrobiologicznego Sigma-Aldrich L7658-1KG LB Rosół z agarem (Lennox) EZMix w proszku <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pożywka mikrobiologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Midori Green Advance</td><td>Nippon Genetics</td><td>MG04</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miniprzygotowawczy do plazmidu Monarch NEB</td><td></td><td>T1010L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA Monarch</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Kompetentny E. coli (wysoka wydajność)</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz, 5X100 ml</td><td>Ambion</td><td>AM9939</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Zredukowane podłoże surowicy, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>P3 Pierwotna komórka 4D-Nucleofetor&nbsp; X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Roztwór Lonza Primary P3 jest dostarczany w postaci 2,25 ml roztworu nukleofektora pierwotnego P3 i 0,5 ml suplementu 1. Aby rozpuszczeć, dodać Suplement 1 do roztworu P3 Primary Cell Nucleofector i wymieszać.</td></tr><tr><td>pAAV-MCS2</td><td>Addgene</td><td>46954</td><td></td></tr><tr><td>Folia termozgrzewalna do PCR, przebijana</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>pDGM6</td><td>Addgene</td><td>110660</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P / S)</td> <td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Dodaj 50 ml PBS 4,5 pH (wykonanego z HCl) do 50 mg PEI w probówce. Rozpuścić, umieszczając probówkę w 70&deg; C łaźnia wodna i wirowanie co 10 minut, aż roztwór się rozpuści. Gdy roztwór osiągnie RT, przesterylizuj filtr przez 0,22 &mu; M filtr, marka 1120 &mu; L i przechowywać w temperaturze -80&deg;C.</td></tr><tr><td>Probówka z polistyrenu, z podkładami zatrzaskowymi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Eurofins-Primers zostały zamówione w Eurofins (eurofinsgenomics.eu) jako niemodyfikowane niestandardowe oligonukleotydy wolne od soli. Podkłady zostały zaprojektowane przy użyciu PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Podkład 1 Pd:&nbsp; &nbsp; &nbsp; AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Specyficzny dla podkładu 2 Rev CALR WT: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Specyficzny dla Primer 2 Rev CALR DEL: CCAACCCTGGAGACACGCTTC</td></tr><tr><td>Test startera PrimeTime qPCR</td><td></td> <td>IDT-PrimeTime</td> <td>qPCR Probe Test (1 sonda/2 startery)&nbsp; które można zamówić w IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Skala: Std - qPCR Test 500 reakcji; Podkład 1 do przodu (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Podkład 2 Odwrócony (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Sonda (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCCCTG; 5' Barwnik / 3' Gaszenie: FAM/ZEN/IBFQ; Stosunek startera do sondy: 3,6</td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Extract Roztwór do ekstrakcji DNA</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td></td></tr><tr><td>QX200&nbsp;</td>Czytnik kropelek <td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki ligand Flt3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Dotmatics</td><td></td><td>Oprogramowanie do klonowania molekularnego https://www.snapgene.com *Alternatywnie można również użyć Benchling (https://www.benchling.com) i Geneious (https://www.geneious.com).</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu Soc</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td></td></tr><tr><td>Stem Regenin 1 (SR1)</td><td>Biogems</td><td>1224999</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>TIDE</td><td></td><td></td><td>http://shinyapps.datacurators.nl/tide/</td></tr> <tr><td>Trypan blue 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (z czerwienią fenolową), 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>16605-028</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5: EDTA, pH 8,0, 100 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do optymalizacji kodonów Vector Builder</td><td></td><td></td><td>https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html</td></tr></tbody></table>

inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Przez całe swoje życie, hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) nabywają mutacji somatycznych. Niektóre z tych mutacji zmieniają właściwości funkcjonalne HSPC, takie jak proliferacja i różnicowanie, sprzyjając w ten sposób rozwojowi nowotworów hematologicznych. Skuteczna i precyzyjna manipulacja genetyczna HSPC jest niezbędna do modelowania, charakteryzowania i lepszego zrozumienia funkcjonalnych konsekwencji nawracających mutacji somatycznych. Mutacje mogą mieć szkodliwy wpływ na gen i powodować utratę funkcji (LOF) lub, w przeciwieństwie do tego, mogą wzmacniać funkcję, a nawet prowadzić do nowych cech określonego genu, określanych jako wzmocnienie funkcji (GOF). W przeciwieństwie do mutacji LOF, mutacje GOF występują prawie wyłącznie w sposób heterozygotyczny. Obecne protokoły edycji genomu nie pozwalają na selektywne celowanie w poszczególne allele, co utrudnia modelowanie heterozygotycznych mutacji GOF. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, w jaki sposób zaprojektować heterozygotyczne mutacje hotspot GOF w ludzkich HSPC poprzez połączenie naprawy ukierunkowanej na homologię za pośrednictwem CRISPR/Cas9 i technologii rekombinacji AAV6 w celu skutecznego transferu matrycy dawcy DNA. Co ważne, strategia ta wykorzystuje system podwójnej fluorescencji reporterowej, aby umożliwić śledzenie i oczyszczanie pomyślnie heterozygycznie edytowanych HSPC. Strategia ta może być wykorzystana do precyzyjnego zbadania, w jaki sposób mutacje GOF wpływają na funkcję HSPC i ich progresję w kierunku nowotworów hematologicznych.

Stosując opisany powyżej protokół, w HSPC pochodzących z krwi pępowinowej powtarzalnie wprowadzono heterozygotyczne mutacje CALR typu 1. Mutacja ta polega na delecji 52 bp w eksonie 9 (ostatnim eksonie CALR), co skutkuje przesunięciem ramki odczytu o +1, prowadząc do translacji nowej, dodatnio naładowanej domeny C-końcowej26,33. Aby wprowadzić mutację CALR w endogennym locus genu, zastosowano strategię celowania w intron powyżej eksonu 9, co pozwoliło uniknąć niepożądanych zmian w sekwencji kodującej w przypadkach, gdy DSB indukowane przez Cas9 nie zostało naprawione via mechanizm HDR. W tym konkretnym przypadku zaprojektowano sgRNA dla intronu 7 ze względu na dostępność sekwencji o wysokiej specyficzności (on-target) i niskiej aktywności poza celem (off-target) w połączeniu z korzystnymi ramionami homologii (brak powtórzeń sekwencji; Rycyna 5A).
Następnie zaprojektowano dwa matryce donorowe i zapakowano je do wektorów AAV6. Aby umożliwić prawidłowy splicing z endogennych eksonów do zintegrowanego cDNA, matryce donorowe zawierają (i) sekwencję SA obejmującą miejsce splicingu 3', punkt rozgałęzienia oraz trakt polipirymidynowy, (ii) zoptymalizowaną kodonowo sekwencję cDNA eksonów 8-9, zawierającą albo sekwencję WT (CALRWT), albo zmutowaną sekwencję (CALRDEL) wraz z kodonem stop, (iii) sygnał polyA wirusa simian 40 (SV40), (iv) sekwencję kodującą białko fluorescencyjne pod kontrolą oddzielnego promotora wewnętrznego, promotora wirusa SFFV (spleen focus-forming virus), a następnie (v) sygnał polyA hormonu wzrostu bydła (bGH). Matryca donorowa zawierająca cDNA CALRWT została zaprojektowana tak, aby zawierać kasetę GFP, natomiast matryca donorowa zawierająca sekwencję cDNA CALRDEL została zaprojektowana tak, aby zawierać kasetę BFP. Cała konstrukcja została otoczona lewym i prawym ramieniem homologii HA (Ryc. 5A).
Dwa dni po transfekcji kompleksem RNP i transdukcji wirusami rAAV6, komórki przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Wykryto cztery główne populacje: (i) komórki niewyrażające ani GFP, ani BFP, reprezentujące komórki bez edycji genomu opartej na HDR, (ii) komórki dodatnie tylko dla GFP, reprezentujące te, które zintegrowały wyłącznie konstrukt WT, (iii) komórki dodatnie tylko dla BFP, reprezentujące te, które zintegrowały wyłącznie konstrukt zmutowany oraz (iv) komórki podwójnie dodatnie dla GFP i BFP, reprezentujące komórki, które zintegrowały zarówno sekwencję WT, jak i zmutowaną (Rycina 5B). W celu uzyskania czystych populacji HSPC posiadających heterozygotyczną mutację CALR typu 1, komórki podwójnie dodatnie wyselekcjonowano za pomocą cytometrii przepływowej. Jako komórki kontrolne wykorzystano HSPC, w których wprowadzono dwie sekwencje WT (GFP+ mCherry+; Rycina 5B). Wiarygodną alternatywą do zastosowania jako komórki kontrolne byłyby HSPC z bialleliczną integracją białek fluorescencyjnych w locus safe harbor (tj. AAVS1; nie pokazano). Liczenie komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego przeprowadzone na wyselekcjonowanych HSPC wykazało, że ponad 90% komórek było żywych.
Bezszwową integrację konstruktów w miejscu docelowym potwierdzono, stosując strategię PCR in-out (Rycina 6A). W tym konkretnym przypadku przeprowadzono dwie oddzielne reakcje PCR in-out: jedną dla wprowadzonej sekwencji CALRWT (ścieżka 1 elektroforezy żelowej na Rycini 6A) oraz jedną dla wprowadzonej sekwencji CALRDEL (ścieżka 2 elektroforezy żelowej na Rycini 6A). Sekwencjonowanie metodą Sangera przeprowadzone na DNA wyizolowanym z prążków żelowych potwierdziło prawidłową insercję sekwencji WT i zmutowanej w HSPCs CALRDEL/WT&#160;(Rycina 6B).
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Generowanie komórek HSPC noszących heterozygotyczną mutację CALR. (A) Reprezentatywny schemat przedstawiający strategię edycji w celu wprowadzenia heterozygotycznej mutacji CALR. Kompleks RNP celuje w intron między eksonem 7 a eksonem 8 genu CALR. Dwa wektory AAV, jeden zawierający zmutowane eksony 8-9 oraz BFP, a drugi zawierający eksony 8-9 WT oraz GFP, służą jako matryce naprawy donora i promują integrację sekwencji zmutowanej w jednym allelu oraz integrację sekwencji WT w pozostałym allelu. (B) Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej przedstawiające ekspresję GFP i BFP lub GFP i mCherry 48 h po transfekcji i transdukcji komórek HSPC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig06.jpg" /> 
Rycina 6: Walidacja pomyślnej heterozygotycznej mutacji CALR w HSPCs. (A) Elektroforeza żelowa produktów PCR typu in-out przeprowadzonych na DNA genomicznym wyekstrahowanym z kontroli AAV, CALRWT/WT oraz CALRDEL/WT. Użyto drabinki DNA 100 bp. Skrót: NTC = kontrola bez matrycy. (B) Wyniki sekwencjonowania metodą Sangera uzyskane z PCR in-out przeprowadzonych na CALRDEL/WT , potwierdzające pomyślną integrację sekwencji WT i zmutowanej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Metoda ta pozwala na precyzyjne modelowanie nawracających białaczkowych mutacji związanych ze wzmocnieniem funkcji w pierwotnych ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych, a tym samym badanie roli w transformacji białaczkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że inżynieria mutacji oparta na CRISPR-Cas9 jest połączona z wprowadzeniem reportera fluorescencyjnego. Pozwala to w unikalny sposób na identyfikację, wzbogacanie i śledzenie czystych heterozygycznie zmutowanych populacji komórek.Procedurę zademonstruje Tommaso Sconocchia, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, zaprojektuj pojedynczy przewodnik RNA za pomocą internetowego narzędzia do projektowania Benchling, wybierając opcję tworzenia plusa. Następnie kliknij sekwencję DNA"a następnie importuj sekwencje DNA"i importuj z baz danych"opcja.Następnie wprowadź żądany gen i wybierz człowieka"jako gatunek. Kliknij na szukaj"opcję i wybierz odpowiedni import transkrypcji. Wybierz obszar zainteresowania, w którym ma zostać wprowadzone podwójne zerwanie żyły.Następnie wybierz CRISPR"opcję po prawej stronie ekranu, a następnie przewodniki projektowania i analizy. Następnie wybierz pojedynczą prowadnicę", zachowując długość prowadnicy na poziomie 20 par podstaw i sekwencję PAM do edycji za pomocą SP-Cas9. Wybierz przewodnik z wysokim wynikiem docelowym i wysokim wynikiem poza celem i zamów RNA z pojedynczym przewodnikiem jako chemicznie zmodyfikowany syntetyczny RNA z pojedynczego przewodnika od komercyjnego dostawcy.Aby zaprojektować szablon HDR, zaimportuj sekwencję genomową i sekwencję kodującą do oprogramowania do klonowania molekularnego. Z pliku sekwencji genomowej zaprojektuj lewe ramię homologii, wybierając, najlepiej, 400 par zasad na pięciu głównych końcach pęknięć podwójnej nici i wklej tę sekwencję do nowego pliku. Z pliku sekwencji genomowej zaprojektuj sekwencję akceptora splicingu, wybierając ostatnie 150 par zasad docelowego intronu i wklejając go po lewym ramieniu homologii.Z pliku sekwencji kodującej wybierz interesujące Cię cDNA. Kodon optymalizuje cDNA i wstawia go po sekwencji akceptora splicingu. Po interesującym nas cDNA wstaw trzy pierwsze sygnały poliadenylacji po sekwencji promotora białka fluorescencyjnego.Następnie wstaw sekwencję dla białka fluorescencyjnego i drugi, ale inny sygnał poliadenylacji. Z pliku sekwencji genomowej zaprojektuj prawe ramię homologii, wybierając idealnie 400 par zasad na trzech głównych końcach podwójnej nici pęknięć i wstaw sekwencję po drugiej poliadenylacji. Następnie utwórz kopię całego szablonu i zmodyfikuj interesujące Cię cDNA tak, aby zawierało sekwencję pożądanej mutacji.Zamień białko fluorescencyjne na inne białko fluorescencyjne. Skonstruuj i sklonuj szablony HDR do wektora wyrażenia AAV. Do przygotowania rekombinowanego AAV6 przygotuj 10 150-milimetrowych szalek, z których każda zawiera 11 milionów HECK293T w 20 mililitrach DMEM uzupełnionych 10% FBS, 1% penicyliny streptomycyny i 25 milimolowych HEPES.Następnie umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, na 24 godziny. Po ostrożnym wyrzuceniu starej pożywki zastąp ją 20 mililitrami wolnego od antybiotyków DMEM uzupełnionego 10% FBS, 25 milimolowym HEPES i jednym milimolowym maślanem sodu. Następnie przygotuj dwie 15-mililitrowe probówki oznaczone jako tuba pierwsza i druga.Do pierwszej probówki dodaj pięć mililitrów zredukowanej pożywki surowicy, 60 mikrogramów rekombinowanego plazmidu HDR z mutacją AAV6 i 220 mikrogramów plazmidu pomocniczego PDGM6. Do probówki drugiej dodaj pięć mililitrów zredukowanej pożywki surowicy i 1120 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu polietylenoaminy. Po dodaniu zawartości probówki drugiej do probówki pierwszej, wirować przez 30 sekund, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie dodaj kroplami 1,1 mililitra roztworu do każdego naczynia i rozprowadz, delikatnie mieszając. Umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, na 48 godzin. Następnie dodaj 250 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA do każdej potrawy i umieść je w inkubatorze na 10 minut.Zbierz komórki, zmywając je z naczynia i przenieś do 500-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować w temperaturze 2000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Poluzuj osad przez wirowanie i wyekstrahuj wirusa za pomocą zestawu do oczyszczania AAV.Po podaniu oczyszczonego wirusa należy go przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu CD34-dodatnich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych, przenieś komórki do 10 mililitrów wstępnie podgrzanego RPMI uzupełnionego 1% streptomycyną penicyliny. Wirować w temperaturze pokojowej 350 G przez 10 minut.Zawieś komórki w pożywce retencji hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do stężenia 250 000 komórek na mililitr i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Następnie zbierz komórki w 15-mililitrowej tubie. Policz i sprawdź żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.Aby przygotować kompleks rybokuloproteinowy, dodaj 15 mikrogramów Cas9 i osiem mikrogramów pojedynczego przewodnika RNA w probówce o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 minut w bloku grzewczym. Podczas inkubacji kompleksu rybonukleoproteinowego należy odwirować komórki w stężeniu 350 G przez pięć minut i odrzucić supernatant. Po zawieszeniu komórek w 100 mikrolitrach roztworu nukleofekcji wymieszaj komórki z kompleksem rybonukleoproteinowym i przenieś je do kuwety.Po delikatnym stuknięciu w kuwetę w celu usunięcia wszelkich resztek pęcherzyków powietrza, włóż kuwetę do uchwytu systemu transfekcji i elektropoturuj ogniwa. Bezpośrednio po elektroporacji dodać 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki retencyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych bez streptomycyny penicyliny i przenieść komórki za pomocą cienkiej pipety do przenoszenia na płytkę hodowlaną zawierającą wstępnie podgrzaną pożywkę retencyjną hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych bez streptomycyny penicyliny. Następnie przenieś płytkę do inkubatora.Rozmrozić fiolki zawierające zamrożone rekombinowane AAV na lodzie i przetoczyć komórki, pipetując optymalną ilość każdego rekombinowanego AAV6 do zawiesiny komórek. Po delikatnym wymieszaniu zawiesiny komórek z pipetą, inkubuj transdukowane komórki przez sześć do ośmiu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po sześciu do ośmiu godzinach zebrać komórki do probówki i odwirować je w temperaturze 350 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Odrzucić supernatant i zastąpić go świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką retencyjną hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych uzupełnioną penicyliną, streptomycyną, a następnie przenieść komórki na płytkę do hodowli komórkowej. Inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby posortować przepływowo zmodyfikowane komórki z heterozygotyczną mutacją wzmocnienia funkcji, należy zebrać komórki do 15-mililitrowej probówki i odwirować w temperaturze 350 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut, jak wykazano wcześniej.Usunąć supernatant i zawiesić komórki w jednym mililitrze DPBS zawierającym 0,1% PSA i ponownie odwirować w temperaturze 350 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu zawiesić komórki w odpowiedniej objętości DPBS plus 0,1% BSA, w zależności od liczby komórek, jak wykazano powyżej. Przenieść komórki do sterylnej rurki faksowej wyposażonej w nasadkę i dodać siedem AAD lub innego barwnika żywotności do zawiesiny komórek w celu wykluczenia komórek żywych/martwych.Sortuj żywe komórki, które są podwójnie dodatnie dla fluorescencyjnych białek reporterowych, do probówki zbiorczej zawierającej 200 mikrolitrów pożywki retencyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Po odwirowaniu posortowanych komórek w temperaturze 350 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut, jak wykazano wcześniej, do stężenia 250 000 komórek na mililitr w celu dalszej ekspansji w kulturze lub wykorzystania komórek bezpośrednio do testów funkcjonalnych. Dwa dni po transwekcji z kompleksem rybonukleoproteinowym i transdukcji z rekombinowanymi wirusami AAV6 komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej.Wykryto cztery główne populacje, w tym komórki bez edycji genomu opartej na HDR, które nie wyrażają ani komórek GFP, ani komórek BFP, dodatnich tylko dla GFP ze zintegrowanym tylko konstruktem typu dzikiego, komórek dodatnich tylko dla BFP ze zintegrowanym tylko zmutowanym konstruktem oraz komórek podwójnie dodatnich GFP i BFP ze zintegrowanymi sekwencjami typu dzikiego i zmutowanego. Aby potwierdzić udane knock-in heterozygotycznych mutacji kalretykuliny in/out, PCR przeprowadzono na genomowym DNA wyekstrahowanym z komórek inkubowanych tylko z AAV oraz z komórek inkubowanych z rybonukleoproteiną i AAV z wbitą kalretykuliną typu dzikiego i sekwencją delecji kalretykuliny. Komórki posortowano na podstawie jednoczesnej ekspresji obu reporterów fluorescencyjnych przed ekstrakcją DNA.Po elektroforezie żelowej poszczególne prążki zostały wycięte z żelu i wyekstrahowano DNA do późniejszego sekwencjonowania Sangera. Wyniki sekwencjonowania potwierdziły udaną bezproblemową integrację sekwencji typu dzikiego i zmutowanego w heterozygotycznych krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych z mutacją kalretykuliny. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest staranny wybór najlepiej działającego pojedynczego przewodnikowego RNA, ponieważ określi to ogólną wydajność HDR, a tym samym częstotliwość udanych mutacji heterozygotycznych.Po tej procedurze genetycznie zmodyfikowane komórki mogą być wykorzystane do funkcjonalnych eksperymentów in vitro i in vivo, takich jak testy jednostek tworzących kolonie, testy różnicowania i przeszczepy myszom z niedoborem odporności.

engineering-oncogenic-heterozygous-gain-function-mutations-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania konkurencyjnych eksperymentów z przeszczepem szpiku kostnego myszy w celu zbadania funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych bez wcześniejszego oczyszczania komórek macierzystych przez sortowanie komórek.

Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Tutaj przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli mysiego prekursora mieloidu linii komórkowej 32D/G-CSF-R, przeprowadzania infekcji wirusowych oraz przeprowadzania testów proliferacji i różnicowania. Ta linia komórkowa nadaje się do badania rozwoju komórek szpikowych oraz roli genów będących przedmiotem zainteresowania we wzroście komórek szpikowych i różnicowaniu neutrofilów.

Proliferacja i różnicowanie mysich komórek prekursorowych mieloidu 32D/G-CSF-R

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Rozwój modeli mysich z specyficznymi genami zmutowanymi u pacjentów z rakiem głowy i szyi jest niezbędny do zrozumienia nowotworów. W tym miejscu przedstawiamy protokół transformacji in vitro pierwotnych komórek języka myszy przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem do generowania mysich linii komórkowych HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi.

Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Zastrzyki doudowe pozwalają na wszczepienie niewielkiej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), poprzez umieszczenie komórek bezpośrednio w jamie szpiku kostnego. Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół wstrzykiwania do kości udowej ludzkich HSPC myszom z niedoborem odporności.

Wstrzyknięcie doudowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych myszom z obniżoną odpornością

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Poznaj metodę CRISPR/Cas9 i rAAV do modelowania heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich komórkach macierzystych krwi. Ta technika umożliwia precyzyjne badanie transformacji leukemicznej.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Przeglądaj więcej filmów