Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych
March 10th, 2023
Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.
Metoda ta pozwala na precyzyjne modelowanie nawracających białaczkowych mutacji związanych ze wzmocnieniem funkcji w pierwotnych ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych, a tym samym badanie roli w transformacji białaczkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że inżynieria mutacji oparta na CRISPR-Cas9 jest połączona z wprowadzeniem reportera fluorescencyjnego. Pozwala to w unikalny sposób na identyfikację, wzbogacanie i śledzenie czystych heterozygycznie zmutowanych populacji komórek.
Procedurę zademonstruje Tommaso Sconocchia, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, zaprojektuj pojedynczy przewodnik RNA za pomocą internetowego narzędzia do projektowania Benchling, wybierając opcję tworzenia plusa. Następnie kliknij sekwencję DNA"a następnie importuj sekwencje DNA"i importuj z baz danych"opcja.
Następnie wprowadź żądany gen i wybierz człowieka"jako gatunek. Kliknij na szukaj"opcję i wybierz odpowiedni import transkrypcji. Wybierz obszar zainteresowania, w którym ma zostać wprowadzone podwójne zerwanie żyły.
Następnie wybierz CRISPR"opcję po prawej stronie ekranu, a następnie przewodniki projektowania i analizy. Następnie wybierz pojedynczą prowadnicę", zachowując długość prowadnicy na poziomie 20 par podstaw i sekwencję PAM do edycji za pomocą SP-Cas9. Wybierz przewodnik z wysokim wynikiem docelowym i wysokim wynikiem poza celem i zamów RNA z pojedynczym przewodnikiem jako chemicznie zmodyfikowany syntetyczny RNA z pojedynczego przewodnika od komercyjnego dostawcy.
Aby zaprojektować szablon HDR, zaimportuj sekwencję genomową i sekwencję kodującą do oprogramowania do klonowania molekularnego. Z pliku sekwencji genomowej zaprojektuj lewe ramię homologii, wybierając, najlepiej, 400 par zasad na pięciu głównych końcach pęknięć podwójnej nici i wklej tę sekwencję do nowego pliku. Z pliku sekwencji genomowej zaprojektuj sekwencję akceptora splicingu, wybierając ostatnie 150 par zasad docelowego intronu i wklejając go po lewym ramieniu homologii.
Z pliku sekwencji kodującej wybierz interesujące Cię cDNA. Kodon optymalizuje cDNA i wstawia go po sekwencji akceptora splicingu. Po interesującym nas cDNA wstaw trzy pierwsze sygnały poliadenylacji po sekwencji promotora białka fluorescencyjnego.
Następnie wstaw sekwencję dla białka fluorescencyjnego i drugi, ale inny sygnał poliadenylacji. Z pliku sekwencji genomowej zaprojektuj prawe ramię homologii, wybierając idealnie 400 par zasad na trzech głównych końcach podwójnej nici pęknięć i wstaw sekwencję po drugiej poliadenylacji. Następnie utwórz kopię całego szablonu i zmodyfikuj interesujące Cię cDNA tak, aby zawierało sekwencję pożądanej mutacji.
Zamień białko fluorescencyjne na inne białko fluorescencyjne. Skonstruuj i sklonuj szablony HDR do wektora wyrażenia AAV. Do przygotowania rekombinowanego AAV6 przygotuj 10 150-milimetrowych szalek, z których każda zawiera 11 milionów HECK293T w 20 mililitrach DMEM uzupełnionych 10% FBS, 1% penicyliny streptomycyny i 25 milimolowych HEPES.
Następnie umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, na 24 godziny. Po ostrożnym wyrzuceniu starej pożywki zastąp ją 20 mililitrami wolnego od antybiotyków DMEM uzupełnionego 10% FBS, 25 milimolowym HEPES i jednym milimolowym maślanem sodu. Następnie przygotuj dwie 15-mililitrowe probówki oznaczone jako tuba pierwsza i druga.
Do pierwszej probówki dodaj pięć mililitrów zredukowanej pożywki surowicy, 60 mikrogramów rekombinowanego plazmidu HDR z mutacją AAV6 i 220 mikrogramów plazmidu pomocniczego PDGM6. Do probówki drugiej dodaj pięć mililitrów zredukowanej pożywki surowicy i 1120 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu polietylenoaminy. Po dodaniu zawartości probówki drugiej do probówki pierwszej, wirować przez 30 sekund, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Ostrożnie dodaj kroplami 1,1 mililitra roztworu do każdego naczynia i rozprowadz, delikatnie mieszając. Umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, na 48 godzin. Następnie dodaj 250 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA do każdej potrawy i umieść je w inkubatorze na 10 minut.
Zbierz komórki, zmywając je z naczynia i przenieś do 500-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować w temperaturze 2000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Poluzuj osad przez wirowanie i wyekstrahuj wirusa za pomocą zestawu do oczyszczania AAV.
Po podaniu oczyszczonego wirusa należy go przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu CD34-dodatnich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych, przenieś komórki do 10 mililitrów wstępnie podgrzanego RPMI uzupełnionego 1% streptomycyną penicyliny. Wirować w temperaturze pokojowej 350 G przez 10 minut.
Zawieś komórki w pożywce retencji hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do stężenia 250 000 komórek na mililitr i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Następnie zbierz komórki w 15-mililitrowej tubie. Policz i sprawdź żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.
Aby przygotować kompleks rybokuloproteinowy, dodaj 15 mikrogramów Cas9 i osiem mikrogramów pojedynczego przewodnika RNA w probówce o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 minut w bloku grzewczym. Podczas inkubacji kompleksu rybonukleoproteinowego należy odwirować komórki w stężeniu 350 G przez pięć minut i odrzucić supernatant. Po zawieszeniu komórek w 100 mikrolitrach roztworu nukleofekcji wymieszaj komórki z kompleksem rybonukleoproteinowym i przenieś je do kuwety.
Po delikatnym stuknięciu w kuwetę w celu usunięcia wszelkich resztek pęcherzyków powietrza, włóż kuwetę do uchwytu systemu transfekcji i elektropoturuj ogniwa. Bezpośrednio po elektroporacji dodać 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki retencyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych bez streptomycyny penicyliny i przenieść komórki za pomocą cienkiej pipety do przenoszenia na płytkę hodowlaną zawierającą wstępnie podgrzaną pożywkę retencyjną hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych bez streptomycyny penicyliny. Następnie przenieś płytkę do inkubatora.
Rozmrozić fiolki zawierające zamrożone rekombinowane AAV na lodzie i przetoczyć komórki, pipetując optymalną ilość każdego rekombinowanego AAV6 do zawiesiny komórek. Po delikatnym wymieszaniu zawiesiny komórek z pipetą, inkubuj transdukowane komórki przez sześć do ośmiu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po sześciu do ośmiu godzinach zebrać komórki do probówki i odwirować je w temperaturze 350 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Odrzucić supernatant i zastąpić go świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką retencyjną hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych uzupełnioną penicyliną, streptomycyną, a następnie przenieść komórki na płytkę do hodowli komórkowej. Inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby posortować przepływowo zmodyfikowane komórki z heterozygotyczną mutacją wzmocnienia funkcji, należy zebrać komórki do 15-mililitrowej probówki i odwirować w temperaturze 350 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut, jak wykazano wcześniej.
Usunąć supernatant i zawiesić komórki w jednym mililitrze DPBS zawierającym 0,1% PSA i ponownie odwirować w temperaturze 350 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu zawiesić komórki w odpowiedniej objętości DPBS plus 0,1% BSA, w zależności od liczby komórek, jak wykazano powyżej. Przenieść komórki do sterylnej rurki faksowej wyposażonej w nasadkę i dodać siedem AAD lub innego barwnika żywotności do zawiesiny komórek w celu wykluczenia komórek żywych/martwych.
Sortuj żywe komórki, które są podwójnie dodatnie dla fluorescencyjnych białek reporterowych, do probówki zbiorczej zawierającej 200 mikrolitrów pożywki retencyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Po odwirowaniu posortowanych komórek w temperaturze 350 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut, jak wykazano wcześniej, do stężenia 250 000 komórek na mililitr w celu dalszej ekspansji w kulturze lub wykorzystania komórek bezpośrednio do testów funkcjonalnych. Dwa dni po transwekcji z kompleksem rybonukleoproteinowym i transdukcji z rekombinowanymi wirusami AAV6 komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej.
Wykryto cztery główne populacje, w tym komórki bez edycji genomu opartej na HDR, które nie wyrażają ani komórek GFP, ani komórek BFP, dodatnich tylko dla GFP ze zintegrowanym tylko konstruktem typu dzikiego, komórek dodatnich tylko dla BFP ze zintegrowanym tylko zmutowanym konstruktem oraz komórek podwójnie dodatnich GFP i BFP ze zintegrowanymi sekwencjami typu dzikiego i zmutowanego. Aby potwierdzić udane knock-in heterozygotycznych mutacji kalretykuliny in/out, PCR przeprowadzono na genomowym DNA wyekstrahowanym z komórek inkubowanych tylko z AAV oraz z komórek inkubowanych z rybonukleoproteiną i AAV z wbitą kalretykuliną typu dzikiego i sekwencją delecji kalretykuliny. Komórki posortowano na podstawie jednoczesnej ekspresji obu reporterów fluorescencyjnych przed ekstrakcją DNA.
Po elektroforezie żelowej poszczególne prążki zostały wycięte z żelu i wyekstrahowano DNA do późniejszego sekwencjonowania Sangera. Wyniki sekwencjonowania potwierdziły udaną bezproblemową integrację sekwencji typu dzikiego i zmutowanego w heterozygotycznych krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych z mutacją kalretykuliny. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest staranny wybór najlepiej działającego pojedynczego przewodnikowego RNA, ponieważ określi to ogólną wydajność HDR, a tym samym częstotliwość udanych mutacji heterozygotycznych.
Po tej procedurze genetycznie zmodyfikowane komórki mogą być wykorzystane do funkcjonalnych eksperymentów in vitro i in vivo, takich jak testy jednostek tworzących kolonie, testy różnicowania i przeszczepy myszom z niedoborem odporności.
Przegląd
W tym artykule przedstawiono protokół modelowania heterozygotycznych mutacji zyskowych funkcji w komórkach macierzystych i progenitorowych hematopoetycznych (HSPCs) z wykorzystaniem CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji donoru rAAV. Ta metoda umożliwia precyzyjne badanie mutacji leukogennych i ich roli w transformacji leukemicznej.
Kluczowe Komponenty Badań
Obszar Nauki
- Biologia komórek macierzystych hematopoetycznych
- Nowotwory hematologiczne
- Techniki edycji genów
Tło
- Zrozumienie somatycznych mutacji w HSPCs jest kluczowe dla badania nowotworów krwi.
- Obecne metody brakuje precyzji w modelowaniu tych mutacji.
- Technologia CRISPR/Cas9 oferuje potężne narzędzie do inżynierii genetycznej.
- Reportery fluorescencyjne ułatwiają śledzenie zmodyfikowanych komórek.
Cel Badań
- Opracowanie wiarygodnej metody modelowania specyficznych mutacji w HSPCs.
- Zbadanie wpływu tych mutacji na transformację leukemiczną.
- Wzmocnienie zrozumienia nowotworów hematologicznych.
Wykorzystane Metody
- Projektowanie pojedynczej RNA prowadzącej (single guide RNA) przy użyciu Benchling.
- Tworzenie matryc HDR do edycji genów.
- Transdukowanie HSPCs rekombinowanymi AAV.
- Elektroporacja komórek w celu wprowadzenia komponentów CRISPR.
Główne Wyniki
- Pomyślne modelowanie mutacji zyskowych funkcji w HSPCs.
- Identyfikacja i wzbogacanie populacji komórek heterozygotycznie zmutowanych.
- Wykorzystano potencjał do badania transformacji leukemicznej.
- Ustanowiono protokół, który można odtworzyć w innych laboratoriach.
Wnioski
- Połączenie CRISPR/Cas9 i rAAV jest skuteczne do edycji genów w HSPCs.
- Ta metoda dostarcza wgląd w mechanizmy nowotworów hematologicznych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten protokół do badania innych mutacji.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Modeling heterozygous gain-of-function mutations in human hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) addresses a critical gap in understanding leukemogenic mechanisms and target validation for hematologic malignancies. This dual-reporter CRISPR/AAV6 workflow enables precise interrogation of oncogenic mutations, supporting predictive confidence at the discovery and preclinical inflection points. The approach enhances portfolio decision-making by enabling functional de-risking of candidate targets implicated in blood cancers.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional modeling of recurrent oncogenic mutations in primary human HSPCs.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the effects of heterozygous gain-of-function alleles.
- Facilitates target validation through direct assessment of mutation-driven phenotypes.
- Improves predictive confidence for prioritizing targets in hematologic malignancy pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated, genetically defined HSPC populations for downstream functional assays.
- Dual fluorescent reporters allow for robust tracking and enrichment of edited cell populations.
- Enables reproducible generation of disease-relevant cell models for compound screening.
- Standardizes assay inputs by ensuring precise genetic backgrounds in test systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered HSPC models with disease-relevant mechanisms for translational studies.
- Supports continuity from in vitro functional assays to in vivo transplantation models.
- Facilitates risk-adjusted advancement of targets based on mechanistic and phenotypic data.
- Enables exploration of mutation-driven progression toward hematological malignancies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development for hematologic malignancy research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of oncogenic mutations and clarifies their mechanistic impact in primary HSPCs.
- Screening: Provides genetically defined, reproducible cell populations for quantitative functional assays.
- Analytics: Dual reporter system and downstream sequencing enable precise measurement and comparison of edited versus wild-type cells.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by enabling in vitro and in vivo functional studies of engineered HSPCs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for modeling diverse mutations across hematopoietic targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes genetic engineering and cell sorting workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in hematologic portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional and mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 design, AAV6 vector production, and HSPC culture.
- Demands access to flow cytometry and molecular cloning infrastructure for reporter-based sorting and validation.
- Necessitates rigorous guide RNA selection to maximize HDR efficiency and editing fidelity.
- Adaptation to other gene targets or cell types may require optimization of homology arms and reporter constructs.
- Efficiency and scalability are influenced by cell viability, transduction conditions, and sorting accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:54
sgRNA Design
1:57
Homology-Directed Repair Vector Construction
5:42
Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
9:48
Results: Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining the Use of CRISPR/Cas9 and Dual rAAV Donor Transduction
11:19
Conclusion
