Name: Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj protokół nakładania jednowarstwowego grafenu na siatki EM do mikroskopii krioelektronowej. Ta metoda zmniejsza szum tła i poprawia zachowanie próbek biologicznych podczas obrazowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Xiao Fan za pomocne dyskusje podczas tworzenia tych metod w Scripps Research. B.B. był wspierany przez staż podoktorski od Hewitt Foundation for Medical Research. W.C. jest wspierany przez stypendium przeddoktoranckie National Science Foundation. D.E.P jest wspierany przez grant National Institutes of Health (NIH) NS095892 dla GCL. Projekt ten był również wspierany przez granty NIH GM142196, GM143805 i S10OD032467 dla GCL.

Coating TEM Grids with a Graphene Monolayer

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zachowanie próbek biologicznych w cienkiej warstwie szklistego lodu jest niezwykle ważnym krokiem w określaniu struktury krioelektromagnetycznej w wysokiej rozdzielczości. Jednak badacze często napotykają problemy wynikające z interakcji z AWI, który wprowadza preferowaną orientację, złożony demontaż, denaturację i agregację. Co więcej, próbki nie zawsze mogą być wystarczająco zagęszczone, aby wypełnić cienki lód zawieszony w poprzek otworów folii z fenestracją. Kilka grup badawczych opracowało metody powlekania siatek EM monowarstwą grafenu, aby pomóc przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń 24,25,26,27,28,29,30, a siatki grafenowe były stosowane z dużym powodzeniem. W tym miejscu przedstawiamy instrukcje krok po kroku, jak skutecznie przygotować partie siatek grafenowych we własnym zakresie i zbadać jakość siatek grafenowych przez TEM. Podkreślamy, że należy zachować szczególną ostrożność podczas niektórych krytycznych kroków, które opisujemy poniżej.
Grafen ma silną tendencję do przyciągania zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu. Dlatego podczas procesu produkcji siatki grafenowej ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie narzędzia, które mają kontakt z arkuszem grafenu/Cu lub kratkami, są czyste i wolne od kurzu. Szkiełka nakrywkowe używane do przenoszenia grafenu można czyścić przez spłukiwanie etanolem i wodą demineralizowaną lub za pomocą miotełki do kurzu. Zaleca się również pracę pod wyciągiem i utrzymywanie arkuszy i siatek grafenowych przykrytych folią lub czystą płytą szklaną przez cały czas. Kurz lub zanieczyszczenia na kratkach mogą uniemożliwić dokładne przyleganie grafenu do siatek EM. Podczas obchodzenia się z grafenem lub siatkami pokrytymi grafenem ważne jest, aby były uziemione elektrycznie, aby zapobiec uszkodzeniu folii grafenowej w wyniku wyładowań elektrostatycznych. Wyładowań elektrostatycznych można uniknąć, używając paska uziemiającego na nadgarstek, dotykając uziemionego metalowego przedmiotu za każdym razem, gdy dotyka się grafenu lub siatek grafenowych i/lub nie nosząc rękawicy na dłoni trzymającej pęsetę24.
Ponieważ monowarstwa grafenu jest bardzo cienka (szerokość atomu węgla), ważne jest, aby podczas przenoszenia grafenu do siatek wspierać grafen warstwą organiczną, taką jak MMA lub poli-MMA (PMMA). PMMA jest najczęściej stosowanym materiałem do transferu grafenu. Jednak PMMA ma silne powinowactwo do grafenu i często może powodować zanieczyszczenie folii grafenowej polimerem. W tym protokole stosuje się MMA, ponieważ pozostawia mniej zanieczyszczeń resztkowych25. Jednak zarówno PMMA, jak i MMA mają tę wadę, że tworzą zmarszczki i pęknięcia, które można zaobserwować w niektórych obszarach filmu grafenowego (ryc. 3B). Uniknięcie tych zmarszczek może być trudne, ponieważ często występują one podczas wzrostu grafenu metodą CVD31. Niedawno opracowano metodę hodowli ultrapłaskiego grafenu bez zmarszczek, w której folia miedziana jest zastępowana przez wafel Cu(111)/szafir jako podłoże wzrostu32.
Z naszego doświadczenia wynika, że lepiej jest zakupić arkusze grafenu/Cu i wspierać grafen MMA we własnym zakresie, niż kupować płyty Cu-grafenu pokryte polimerem od producentów, które po wytrawianiu miedzi stają się kruche i są trudne w obsłudze w kolejnych krokach. Powlekarka spinowa, której używaliśmy do powlekania MMA, może być tanio zbudowana przy użyciu części z lokalnego sklepu komputerowego/sprzętowego, jak opisano wcześniej25.
Na etapie powlekania MMA ważne jest, aby pokryć MMA całą powierzchnię grafenu na arkuszu Cu-grafen. Po wytrawieniu Cu grafen MMA stanie się półprzezroczysty, a obszary pozbawione pokrycia MMA będą wyglądać jak puste. Aby zapobiec powstawaniu powłoki MMA po stronie miedzianej, ważne jest, aby podczas powlekania umieścić pod nią mały kawałek bibuły, tak aby wchłonął nadmiar MMA, który wydostaje się z folii CVD.
Po wytrawieniu i wypłukaniu arkusz MMA/grafenu jest gotowy do przeniesienia na siatki EM za pomocą komercyjnego lub domowego systemu korytowego ze strzykawką lub pompą perystaltyczną do kontrolowania poziomu wody. Przed etapem przenoszenia ważne jest, aby dokładnie przepłukać kratki w kolejnych kąpielach chloroformu, acetonu i IPA. Pieczenie rusztów pokrytych grafenem w temperaturze 65 °C pomaga zachować integralność grafenu i wspomaga adsorpcję grafenu na siatkach. Wreszcie, aby zapobiec zanieczyszczeniu MMA na siatkach, ważne jest, aby dokładnie usunąć MMA w kąpieli acetonowej i oczyścić kratki w IPA. Wszelkie nieumyte pozostałości MMA będą obserwowane na siatkach EM i zmniejszą stosunek sygnału do szumu obrazów (rysunek 3C). Proces mycia acetonem-IPA można powtórzyć w celu dalszego oczyszczenia powierzchni grafenowych.
Aby uczynić siatki grafenowe hydrofilowymi, wystawiliśmy je na działanie promieniowania UV/ozonu. Różne modele środków czyszczących UV/ozonem mogą wymagać optymalizacji, aby wystarczająco natlenić warstwę grafenu do przygotowania próbki krioEM bez uszkadzania grafenu. Niezależnie od systemu, bardzo ważne jest, aby używać tych siatek do aplikacji próbek krioEM natychmiast po obróbce UV/Ozonem. Alternatywne metody utylizacji siatek grafenowych jako hydrofilowych opisano w innych badaniach 33,34.

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa jednocząsteczkowa (cryoEM) jest coraz częściej stosowaną technologią wykorzystywaną do badania struktur 3D biomakromolekuł. Postęp technologiczny w optyce mikroskopu elektronowego, bezpośredniej detekcji elektronów1, oraz algorytmy komputerowe2,3,4 w ciągu ostatniej dekady umożliwiły użytkownikom cryoEM określenie struktur biochemicznie stabilnych kompleksów makromolekularnych z rozdzielczością bliską atomowi5,6,7,8. Pomimo tych postępów nadal istnieją znaczące bariery w przechowywaniu próbek do obrazowania krioelektromagnetycznego, które uniemożliwiają rozdzielczość większości próbek biologicznych do tak wysokiej rozdzielczości.
Przygotowanie próbki do analizy krioelektromagnetycznej o wysokiej rozdzielczości polega na uwięzieniu makrocząsteczek, które są równomiernie rozmieszczone w szerokim zakresie orientacji w cienkiej warstwie zeszklonego lodu. Metody zamrażania typu "blot and plunge" są najczęściej stosowanymi metodami stosowanymi do generowania cienkich warstw próbek biologicznych na siatkach do badań krioelektromagnetycznych9,10. Metody te polegają na nałożeniu kilku mikrolitrów roztworu próbki na siatkę EM zawierającą folię z okienkiem, która stała się hydrofilowa, a następnie wytarcie większości próbki bibułą filtracyjną przed szybkim zanurzeniem siatki w kriogenie ciekłego etanu lub mieszaniny etanu i propanu9.
Chociaż ta metoda została z powodzeniem wykorzystana do określenia struktur szerokiej gamy próbek biologicznych, wszystkie powszechnie stosowane metody przygotowania próbek krioEM wystawiają próbki na działanie hydrofobowego interfejsu powietrze-woda (AWI), co często wprowadza problemy ograniczające określanie struktury w wysokiej rozdzielczości. Ustalono, że próbki biologiczne mają wysoką skłonność do denaturacji po wystawieniu na działanie AWI, co może prowadzić do złożonej agregacji i demontażu11,12,13,14. Co więcej, hydrofobowe plamy na powierzchniach próbek biologicznych powodują, że cząstki przyjmują preferowaną orientację w ice12. W wielu scenariuszach pojedynczy hydrofobowy obszar próbki zmusza wszystkie cząstki do przyjęcia określonej orientacji w lodzie, eliminując w ten sposób zdolność do generowania wiarygodnej rekonstrukcji. Oprócz problemów z AWI, próbki mogą wykazywać powinowactwo do powierzchni warstwy folii z okienkami, ograniczając liczbę cząstek zawieszonych w lodzie w otworach15.
Kilka metodologicznych i technologicznych rozwiązań zostało opracowanych w celu zmniejszenia tych problemów wynikających z interakcji z AWI lub filmami16,17. Jednym z popularnych podejść jest pokrycie folii z fenestracją siatek EM cienką (dziesiątki nanometrów) warstwą amorficznego węgla. Powłoka ta zapewnia ciągłą powierzchnię w poprzek otworów, do których cząsteczki mogą się adsorbować, z korzyścią częściowej ochrony próbki przed interakcjami z AWI15,18,19,20. Jednak dodatkowa warstwa węgla zwiększa ilość sygnału tła w obrazowanych obszarach, wprowadzając szumy, które mogą zagrozić osiągalnej rozdzielczości, szczególnie w przypadku małych (<150 kDa) próbek. W ostatnich latach wykazano, że stosowanie płatków tlenku grafenu (GO) do produkcji folii nośnych na siatkach krioEM ma przewagę nad tradycyjnym węglem amorficznym. Płatki GO są wytwarzane w wyniku utleniania warstw grafitu, w wyniku czego powstają pseudokrystaliczne arkusze grafitu jednowarstwowego, które są hydrofilowe ze względu na znaczną zawartość tlenu w postaci grup karboksylowych, hydroksylowych i epoksydowych na powierzchniach i krawędziach. Komercyjne płatki GO w zawiesinach wodnych są niedrogie i istnieje wiele opublikowanych metod nakładania płatków GO na siatki EM18,21. Jednak te metody często skutkują siatkami, które są tylko częściowo pokryte płatkami Go, a także regionami, które zawierają wiele warstw płatków Go. Co więcej, płatki GO wnoszą zauważalny sygnał tła do obrazów krioEM, który jest zbliżony do obserwowanego w przypadku cienkiego amorficznego węgla22,23.
Nieskazitelny jednowarstwowy grafen, który składa się z pojedynczego 2D krystalicznego układu atomów węgla, różni się od GO tym, że nie wytwarza kontrastu fazowego w mikroskopie elektronowym. Jednowarstwowy grafen może być zatem wykorzystany do wygenerowania niewidocznej warstwy nośnej do obrazowania próbek biologicznych. Grafen jednowarstwowy jest również mocniejszy niż GO i może być stosowany jako pojedyncza monowarstwa na siatce EM, a ostatnie postępy w produkcji siatek EM pokrytych grafenem umożliwiły przygotowanie monowarstwowych siatek grafenowych o wysokim pokryciu we własnym zakresie24,25,26,27,28,29,30. Jednak pomimo korzyści płynących z używania siatek pokrytych grafenem do określania struktury krioEM, nie są one powszechnie stosowane ze względu na zbyt wysokie koszty opcji komercyjnych i złożoność produkcji wewnętrznej. Poniżej opisujemy przewodnik krok po kroku, jak efektywnie wytwarzać siatki EM pokryte monowarstwą grafenu do oznaczania struktury krioEM próbek biologicznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)". Postępując zgodnie z tym szczegółowym protokołem, badacze cryoEM mogą w powtarzalny sposób przygotować dziesiątki wysokiej jakości grafenowych siatek nośnych w ciągu jednego dnia. Jakość siatek pokrytych grafenem można łatwo sprawdzić za pomocą niskiej klasy transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) wyposażonego w żarnik LaB6.

<table><tbody><tr><td>70% EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td><td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>Niebezpieczne; Zachowaj szczególną ostrożność</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk Blok uchwytu siatki TEM do 45 siatek</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>Wentylator komputerowy</td><td>Amazon (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Bellco Glass</td><td>1203J71</td><td>Standardowe szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>Naczynie krystalizujące</td><td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>Odkurzacz elektroniczny</td><td>Falcon Safety Products</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>Zszywki</td><td>Falcon Dust-off Air Duster</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bibuły filtracyjne</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta z cienką końcówką</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Kolba</td><td>Pyrex</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Widelec Supermarket</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta pasteura</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Grafen/Cu</td><td>Graphenea</td><td>N/A</td><td>CVD Monowarstwowa</td></tr><tr><td>wełna cu Siatka</td> <td>do powlekaniaLadd Research Industries</td><td>10840</td><td>Delikatny</td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Taśma kaptonowa</td><td>Amazon (MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>Taśma poliamidowa</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Długa koszulka</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>Metalowy uchwyt na siatkę</td><td>Ted Pella</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU Zaawansowane materiały</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>piekarnik laboratoryjny Model 10</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td></td><td></td>FO19013</tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Pyrex</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>Odkurzacz plazmowy (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa analogowa wytrząsarka orbitalna</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Złote siatki Holey</td></tr><tr><td>Systemy czyszczenia ozonem ultrafioletowym</td><td>UVOCS</td><td>model T10X10/OES</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryoEM) stała się potężną techniką badania struktury atomowej kompleksów makromolekularnych. Przygotowanie próbki do krioEM wymaga konserwacji próbek w cienkiej warstwie szklistego lodu, zwykle zawieszonego w otworach folii nośnej z fenestracją. Jednak wszystkie powszechnie stosowane podejścia do przygotowania próbek do badań krioEM wystawiają próbkę na działanie granicy faz powietrze-woda, wprowadzając silny efekt hydrofobowy na próbkę, który często prowadzi do denaturacji, agregacji i złożonej dysocjacji. Co więcej, preferowane oddziaływania hydrofobowe między regionami próbki a granicą faz powietrze-woda wpływają na orientacje przyjmowane przez makrocząsteczki, co skutkuje rekonstrukcjami 3D z anizotropową rozdzielczością kierunkową. 
Wykazano, że adsorpcja próbek krioEM do monowarstwy grafenu pomaga złagodzić interakcje z interfejsem powietrze-woda, jednocześnie minimalizując wprowadzanie szumu tła. Nośniki grafenu oferują również korzyść w postaci znacznego obniżenia wymaganego stężenia białek wymaganych do obrazowania krioEM. Pomimo zalet tych podpór, siatki pokryte grafenem nie są szeroko stosowane przez społeczność krioEM ze względu na zaporowe koszty opcji komercyjnych i wyzwania związane z produkcją na dużą skalę. W artykule opisano efektywną metodę przygotowania partii siatek krioEM, które mają prawie pełne pokrycie monowarstwowym grafenem.

Prawidłowe wykonanie opisanego tutaj protokołu wytwarzania siatek grafenowych pozwoli na uzyskanie siatek EM w pełni pokrytych pojedynczą warstwą grafenu. Pokrycie siatek grafenem można sprawdzić za pomocą dowolnego TEM. Ponieważ pojedyncza warstwa czystego grafenu jest prawie niewidoczna w TEM, należy badać ją w trybie dyfrakcyjnym mikroskopu i obserwować plamki Bragga odpowiadające heksagonalnej organizacji atomów węgla tworzących grafen (Rycina 3A). Normalne jest sporadyczne obserwowanie zmarszczek pojedynczej warstwy grafenu, które powstają podczas powlekania MMA (Rycina 3B). Można również sprawdzić poziom zanieczyszczeń obecnych na grafenie, wykonując obraz o dużym powiększeniu w centrum jednego z otworów pokrytych grafenem (Rycina 3C). Jeśli obraz zostanie wykonany przy użyciu detektora o wysokiej rozdzielczości, transformata Fouriera tego obrazu powinna zawierać plamki Bragga odpowiadające odstępom węgiel-węgiel wynoszącym 2.14 Å (Rycina 4C). Pojedyncza warstwa atomów węgla nie powoduje wystarczającego rozpraszania elektronów, aby wytworzyć kontrast fazowy, zatem obraz czystego grafenu nie będzie wykazywał pierścieni Thona związanych z funkcją przenoszenia kontrastu w transformacie Fouriera obrazu. Jednakże bardzo trudno jest zapobiec zanieczyszczeniu siatek grafenowych po ich wytworzeniu, a niewystarczające płukanie siatek EM lub niecałkowite usunięcie MMA po powleczeniu grafenem spowoduje obecność wyraźnych zanieczyszczeń na siatkach, widocznych na obrazach w przestrzeni rzeczywistej (Rycina 3C). Jak pokazano na Rycynie 4, siatki grafenowe wywierają efekt koncentrujący na próbce, co zaobserwowano przy porównaniu aplikacji 0.5 mg/mL apoferrytyny na dziurawane siatki złote z (Rycina 4A) i bez (Rycina 4B) podłoża grafenowego. Podobne protokoły wytwarzania grafenu były wcześniej opisywane w celu rozwiązywania struktur cryoEM białek takich jak apoferrytyna w wysokiej rozdzielczości25,27.
<img alt="Schemat procesu przenoszenia grafenu; szczegółowe etapy trawienia miedzi, powlekania MMA i czyszczenia rozpuszczalnikiem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przygotowania siatek do cryoEM powlekanych grafenem. Przedstawiono kluczowe etapy procesu wytwarzania siatek grafenowych. Skróty: cryoEM = kriomikroskopia elektronowa; MMA = metakrylan metylu; APS = wodorosiarczan amonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przygotowanie próbek do Cryo-EM: wirówka do powlekania, narzędzia do roztworu APS, arkusz miedziowo-grafenowy, proces powlekania siatek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Materiały niezbędne do wykonania siatek grafenowych. (A) Odpowiednio oznakowane materiały niezbędne do powlekania siatek do cryo-EM. (B) Zbliżenie na urządzenie do powlekania z arkuszem grafenowym/miedzianym przyklejonym taśmą do papieru filtracyjnego na szklanym podstawce. Urządzenie do powlekania (spin coater) można złożyć, kupując części w lokalnym sklepie komputerowym lub sprzętowym. (C) Zbliżenie na korytko do powlekania siatek podłączone do strzykawki, która może służyć do kontrolowania poziomu wody. Siatki umieszczone są na papierze filtracyjnym na stalowej siatce. Papier filtracyjny ułatwia manewrowanie położeniem siatek, aby można było dopasować do nich arkusz grafenowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Dyfrakcja elektronowa i mikroskopia; struktura krystaliczna, analiza w nanoskali, schemat odstępów 2,14 Å." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywny obraz wzoru dyfrakcyjnego oraz obrazy w jasnym polu siatki grafenowej wykazujące zmarszczki lub zanieczyszczenia MMA. (A) Siatki EM pokryte monowarstwą grafenu wykazują piki Bragga odpowiadające heksagonalnej sieci grafenu podczas obrazowania w TEM w trybie dyfrakcji. Pik Bragga odpowiadający odstępom węgiel-węgiel 2,14 Å został obwiedziony okręgiem i oznaczony strzałką. (B) Obraz w jasnym polu siatki z monowarstwą grafenu z widocznymi zmarszczkami (oznaczonymi strzałką) w monowarstwie grafenu. (C) Obraz w jasnym polu monowarstwy grafenu z zanieczyszczeniem MMA (oznaczonym strzałką). Paski skali = 100 nm (B,C). Skróty: EM = mikroskopia elektronowa; MMA = metakrylan metylu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy Cryo-EM i wzór dyfrakcyjny; wizualizacja nanocząsteczek; analiza strukturalna; skala 100 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Apoferrytyna na pozłacanych siatkach pokrytych grafenem: (A) Mikrograf cryoEM apoferrytyny o stężeniu 0,5 mg/mL na pozłacanych siatkach pokrytych grafenem. (B) Apoferrytyna obrazowana przy tym samym stężeniu jest widoczna przy znacznie niższym stężeniu, gdy przygotowano ją przy użyciu dziurawych siatek złotych bez grafenu. (C) FFT mikrografu cryoEM apoferrytyny o stężeniu 0,5 mg/mL na pozłacanych siatkach pokrytych grafenem, z zaznaczonymi pikami Bragga odpowiadającymi heksagonalnej sieci grafenu. Paski skali = 100 nm (A,B). Skróty: cryoEM = kriomikroskopia elektronowa; FFT = szybka transformata Fouriera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy protokół stosowania pojedynczej monowarstwy grafenu na siatkach mikroskopii elektronowej i jak przygotować je do użycia w określaniu struktury krioEM.

Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

Obecnie optymalne zachowanie próbek biologicznych jest głównym wyzwaniem w uzyskiwaniu struktur krioelektromagnetycznych o wysokiej rozdzielczości. Podczas procesu przygotowania próbki próbki są wystawione na działanie hydrofobowego interfejsu powietrze-woda, który ma denaturujący wpływ na próbki i może spowodować, że stabilne próbki przyjmą preferencyjnej orientację w lodzie, co uniemożliwia określenie struktury w wysokiej rozdzielczości. Powlekanie siatek krio-EM cienką warstwą węgla, taką jak miękki tlenek grafenu, jest powszechnie stosowane do rozwiązywania problemów związanych z interakcjami z interfejsem powietrze-woda.Jednak warstwy te często zwiększają szum tła na naszych obrazach, co pogarsza rozdzielczość naszej struktury. Pokrycie siatek monowarstwą grafenu zapewnia podobną ochronę bez wprowadzania znacznego szumu tła. Stosowanie siatek krio-EM pokrytych grafenem może pomóc w przezwyciężeniu problemów związanych z interakcjami z interfejsem powietrze-woda.Jednak komercyjne siatki grafenowe są drogie, a wiele laboratoriów uważa, że siatki grafenowe są zbyt skomplikowane do przygotowania we własnym zakresie. Naukowcy zajmujący się kriogenicznym em mogą teraz korzystać z tego protokołu krok po kroku, aby odtworzyć dziesiątki wysokiej jakości grafenów w ciągu jednego dnia. Na początek umieść w dygestorium szkiełko nakrywkowe z przyklejonym arkuszem grafenu na domowej powlekarce wirowej.Zakładając okulary ochronne, za pomocą szklanej pipety dodaj dwie krople metakrylanu metylu lub MMA na arkusz grafenu i natychmiast zacznij wirować z maksymalną prędkością. Podczas wirowania dodaj jeszcze dwie krople na środku i wiruj przez minutę. Po oczyszczeniu i wysuszeniu trzech naczyń krystalizujących wlej do każdego naczynia 200 mililitrów chloroformu, acetonu i alkoholu izopropylowego.Umieść podstawę zacisku bloku uchwytu siatki TEM na dnie pierwszego naczynia zawierającego 200 mililitrów chloroformu. Upewniając się, że strona z folii okiennej jest skierowana do góry, przenieś każdą siatkę indywidualnie ze skrzynki kratowej do studzienki w bloku uchwytu siatki. Przykryj naczynie folią aluminiową i umieść je na wytrząsarce orbitalnej, aby delikatnie wstrząsnąć przez 30 minut.Następnie umieść metalową pokrywę na bloku uchwytu siatki, aby zabezpieczyć kratki do przeniesienia do następnego naczynia krystalizującego. Za pomocą wygiętego widelca i długiej pęsety ostrożnie wyjmij blok uchwytu rusztu z naczynia i umieść go na dnie drugiego naczynia zawierającego 200 mililitrów acetonu. Zdejmij pokrywkę z bloku uchwytu siatki i delikatnie potrząśnij nią na wytrząsarce orbitalnej.Po 30 minutach umieść pokrywkę na bloku uchwytu siatki i przenieś ją do naczynia zawierającego 200 mililitrów alkoholu izopropylowego, aby usunąć pozostałości acetonu. Zdejmij pokrywkę z bloku uchwytu siatki i delikatnie potrząsaj nią przez 20 minut. Indywidualnie przenieś kratki folią z okienkami do góry z bloku uchwytu siatki na szklaną szalkę Petriego pokrytą bibułą.Oczyszczone kratki przenieść stroną z folii okiennej skierowaną do góry na mokrą bibułę. Zanurz siatki hydrofobowe pionowo w wodzie, aby zapobiec zginaniu się pod wpływem ciśnienia wody. Ułóż zanurzone siatki w kwadratowym szyku, trzymając je blisko siebie, ale nie zachodząc na siebie.Napełnij koryto powłoki kratki większą ilością wody dejonizowanej, upewniając się, że powierzchnia wody znajduje się co najmniej pięć milimetrów nad kratkami. Aby wyjąć folię grafenową MMA z naczynia, powoli opuść szkiełko pokrywy do naczynia pod kątem w pewnej odległości od filmu grafenowego. Umieść szkiełko nakrywkowe pod arkuszem grafenu MMA i wyrównaj jego krawędzie równolegle do arkusza.Następnie podnieś szkiełko nakrywkowe pionowo z wody, zabierając ze sobą folię grafenową MMA. Przenieś folię grafenową MMA do koryta, opuszczając szkiełko nakrywkowe do wody pod kątem 45 stopni, tak aby folia oderwała się od szkiełka nakrywkowego i unosiła się na powierzchni wody. Umieść folię grafenową MMA nad kratkami, zanim poziom wody się obniży.Używając pipety Pasteura, której końcówka została stopiona w sposób zamknięty, ostrożnie manipuluj położeniem filmu grafenowego MMA. Za pomocą strzykawki powoli obniżaj poziom wody tak, aby folia grafenowa MMA idealnie wylądowała na kratkach i całkowicie pokryła ich powierzchnie. Za pomocą pęsety podnieś bibułę przytrzymującą kratki na czystą, wolną od kurzu szalkę Petriego.Umieść podstawę zacisku bloku uchwytu siatki TEM na dnie pierwszego naczynia krystalizującego zawierającego 200 mililitrów świeżego acetonu. Indywidualnie przenieś każdą siatkę stroną MMA skierowaną do góry z bibuły do dołka w bloku uchwytu siatki. Przykryj naczynie folią i delikatnie potrząsaj na wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut.Zabezpiecz kratki, umieszczając metalową pokrywę na bloku uchwytu siatki. Następnie za pomocą wygiętego widelca lub długiej pęsety ostrożnie wyjmij blok z naczynia i umieść go na dnie drugiego naczynia zawierającego 200 mililitrów świeżego acetonu. Po zdjęciu pokrywki z bloku delikatnie potrząsaj nią na wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut.Umieść pokrywkę z powrotem na bloku uchwytu siatki i przenieś ją do naczynia zawierającego 200 mililitrów alkoholu izopropylowego. Zdejmij pokrywkę, a następnie delikatnie potrząsaj przez 20 minut. Przenieś kratki na małą szklaną szalkę Petriego pokrytą bibułą i susz kratki na powietrzu przez 10 minut.W trybach dyfrakcji TEM siatki EM pokryte monowarstwą grafenu wykazują piki Bragga odpowiadające sześciokątnej sieci grafenu. Siatki grafenowe mają efekt koncentracji na próbce, co zaobserwowano podczas porównywania apoferrytyny zastosowanej do całkowicie złotych siatek z nośnikiem grafenu i bez niego. Szybka transformacja Fouriera krio-elektromagnetycznej mikrofotografii apoferrytyny na złotych siatkach pokrytych grafenem również wykazała piki Bragga odpowiadające heksagonalnej sieci grafenowej.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.

Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

W tym filmie demonstrujemy, jak używać mikrofluidycznego urządzenia do neuronów bez konieczności wiązania plazmowego.

Łączenie PDMS bez użycia plazmy w celu taniego wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania elektrod z włókna węglowego. Elektrody te są następnie wykorzystywane do detekcji uwalniania katecholamin z pęcherzyków za pomocą amperometrii włóknem węglowym.

Wytwarzanie elektrod amperometrycznych

Koncepcja, wykonanie i walidacja platformy dodatkowej, która zapewnia zwiększoną kontrolę nad przestrzennym i czasowym natlenieniem w płytce 6-dołkowej. Urządzenie jest dostosowane do wielu systemów hodowli i może być wykorzystywane do badania wpływu tlenu na gojenie ran.

Wytwarzanie i obsługa wkładki tlenowej do adherentnych kultur komórkowych

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Poznaj protokół nakładania jednowarstwowego grafenu na siatki EM do mikroskopii krioelektronowej. Ta metoda zmniejsza szum tła i poprawia zachowanie próbek biologicznych podczas obrazowania.

Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Przeglądaj więcej filmów