Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Obecnie optymalne zachowanie próbek biologicznych jest głównym wyzwaniem w uzyskiwaniu struktur krioelektromagnetycznych o wysokiej rozdzielczości. Podczas procesu przygotowania próbki próbki są wystawione na działanie hydrofobowego interfejsu powietrze-woda, który ma denaturujący wpływ na próbki i może spowodować, że stabilne próbki przyjmą preferencyjnej orientację w lodzie, co uniemożliwia określenie struktury w wysokiej rozdzielczości. Powlekanie siatek krio-EM cienką warstwą węgla, taką jak miękki tlenek grafenu, jest powszechnie stosowane do rozwiązywania problemów związanych z interakcjami z interfejsem powietrze-woda.

Jednak warstwy te często zwiększają szum tła na naszych obrazach, co pogarsza rozdzielczość naszej struktury. Pokrycie siatek monowarstwą grafenu zapewnia podobną ochronę bez wprowadzania znacznego szumu tła. Stosowanie siatek krio-EM pokrytych grafenem może pomóc w przezwyciężeniu problemów związanych z interakcjami z interfejsem powietrze-woda.

Jednak komercyjne siatki grafenowe są drogie, a wiele laboratoriów uważa, że siatki grafenowe są zbyt skomplikowane do przygotowania we własnym zakresie. Naukowcy zajmujący się kriogenicznym em mogą teraz korzystać z tego protokołu krok po kroku, aby odtworzyć dziesiątki wysokiej jakości grafenów w ciągu jednego dnia. Na początek umieść w dygestorium szkiełko nakrywkowe z przyklejonym arkuszem grafenu na domowej powlekarce wirowej.

Zakładając okulary ochronne, za pomocą szklanej pipety dodaj dwie krople metakrylanu metylu lub MMA na arkusz grafenu i natychmiast zacznij wirować z maksymalną prędkością. Podczas wirowania dodaj jeszcze dwie krople na środku i wiruj przez minutę. Po oczyszczeniu i wysuszeniu trzech naczyń krystalizujących wlej do każdego naczynia 200 mililitrów chloroformu, acetonu i alkoholu izopropylowego.

Umieść podstawę zacisku bloku uchwytu siatki TEM na dnie pierwszego naczynia zawierającego 200 mililitrów chloroformu. Upewniając się, że strona z folii okiennej jest skierowana do góry, przenieś każdą siatkę indywidualnie ze skrzynki kratowej do studzienki w bloku uchwytu siatki. Przykryj naczynie folią aluminiową i umieść je na wytrząsarce orbitalnej, aby delikatnie wstrząsnąć przez 30 minut.

Następnie umieść metalową pokrywę na bloku uchwytu siatki, aby zabezpieczyć kratki do przeniesienia do następnego naczynia krystalizującego. Za pomocą wygiętego widelca i długiej pęsety ostrożnie wyjmij blok uchwytu rusztu z naczynia i umieść go na dnie drugiego naczynia zawierającego 200 mililitrów acetonu. Zdejmij pokrywkę z bloku uchwytu siatki i delikatnie potrząśnij nią na wytrząsarce orbitalnej.

Po 30 minutach umieść pokrywkę na bloku uchwytu siatki i przenieś ją do naczynia zawierającego 200 mililitrów alkoholu izopropylowego, aby usunąć pozostałości acetonu. Zdejmij pokrywkę z bloku uchwytu siatki i delikatnie potrząsaj nią przez 20 minut. Indywidualnie przenieś kratki folią z okienkami do góry z bloku uchwytu siatki na szklaną szalkę Petriego pokrytą bibułą.

Oczyszczone kratki przenieść stroną z folii okiennej skierowaną do góry na mokrą bibułę. Zanurz siatki hydrofobowe pionowo w wodzie, aby zapobiec zginaniu się pod wpływem ciśnienia wody. Ułóż zanurzone siatki w kwadratowym szyku, trzymając je blisko siebie, ale nie zachodząc na siebie.

Napełnij koryto powłoki kratki większą ilością wody dejonizowanej, upewniając się, że powierzchnia wody znajduje się co najmniej pięć milimetrów nad kratkami. Aby wyjąć folię grafenową MMA z naczynia, powoli opuść szkiełko pokrywy do naczynia pod kątem w pewnej odległości od filmu grafenowego. Umieść szkiełko nakrywkowe pod arkuszem grafenu MMA i wyrównaj jego krawędzie równolegle do arkusza.

Następnie podnieś szkiełko nakrywkowe pionowo z wody, zabierając ze sobą folię grafenową MMA. Przenieś folię grafenową MMA do koryta, opuszczając szkiełko nakrywkowe do wody pod kątem 45 stopni, tak aby folia oderwała się od szkiełka nakrywkowego i unosiła się na powierzchni wody. Umieść folię grafenową MMA nad kratkami, zanim poziom wody się obniży.

Używając pipety Pasteura, której końcówka została stopiona w sposób zamknięty, ostrożnie manipuluj położeniem filmu grafenowego MMA. Za pomocą strzykawki powoli obniżaj poziom wody tak, aby folia grafenowa MMA idealnie wylądowała na kratkach i całkowicie pokryła ich powierzchnie. Za pomocą pęsety podnieś bibułę przytrzymującą kratki na czystą, wolną od kurzu szalkę Petriego.

Umieść podstawę zacisku bloku uchwytu siatki TEM na dnie pierwszego naczynia krystalizującego zawierającego 200 mililitrów świeżego acetonu. Indywidualnie przenieś każdą siatkę stroną MMA skierowaną do góry z bibuły do dołka w bloku uchwytu siatki. Przykryj naczynie folią i delikatnie potrząsaj na wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut.

Zabezpiecz kratki, umieszczając metalową pokrywę na bloku uchwytu siatki. Następnie za pomocą wygiętego widelca lub długiej pęsety ostrożnie wyjmij blok z naczynia i umieść go na dnie drugiego naczynia zawierającego 200 mililitrów świeżego acetonu. Po zdjęciu pokrywki z bloku delikatnie potrząsaj nią na wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut.

Umieść pokrywkę z powrotem na bloku uchwytu siatki i przenieś ją do naczynia zawierającego 200 mililitrów alkoholu izopropylowego. Zdejmij pokrywkę, a następnie delikatnie potrząsaj przez 20 minut. Przenieś kratki na małą szklaną szalkę Petriego pokrytą bibułą i susz kratki na powietrzu przez 10 minut.

W trybach dyfrakcji TEM siatki EM pokryte monowarstwą grafenu wykazują piki Bragga odpowiadające sześciokątnej sieci grafenu. Siatki grafenowe mają efekt koncentracji na próbce, co zaobserwowano podczas porównywania apoferrytyny zastosowanej do całkowicie złotych siatek z nośnikiem grafenu i bez niego. Szybka transformacja Fouriera krio-elektromagnetycznej mikrofotografii apoferrytyny na złotych siatkach pokrytych grafenem również wykazała piki Bragga odpowiadające heksagonalnej sieci grafenowej.