Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Artios opracowuje nowatorskie leki przeciwnowotworowe ukierunkowane na odpowiedź na uszkodzenie DNA. Aby to umożliwić, opracowaliśmy szereg nowatorskich testów do pomiaru aktywności naprawy DNA komórkowego. Testy te miały duży wpływ na nasze programy, prowadząc do testowania zasobów w fazie klinicznej u pacjentów z wysokimi niezaspokojonymi potrzebami medycznymi.

Dokładny pomiar aktywności komórkowej w miejscu docelowym ma zasadnicze znaczenie dla rozwoju nowych terapii celowanych. Generowanie testów dla czynników naprawy DNA o właściwościach wymaganych do napędzania skutecznej kampanii odkrywania leków było wyzwaniem, niezależnie od tego, czy chodzi o potrzebę wysokiej przepustowości, solidnego sygnału do szumu, szybkiej realizacji, a najlepiej możliwości przenoszenia do różnych systemów biologicznych. Opracowaliśmy zestaw solidnych ilościowych i miareczkowych testów reporterowych opartych na luminescencji, aby zmierzyć biegłość czterech głównych ścieżek naprawy pęknięć dwuniciowych, rekombinacji homologicznej, niehomologicznego łączenia końców, łączenia końcówek za pośrednictwem mikrohomologii i wyżarzania jednoniciowego.

Te testy reporterowe są walidowane jako odczytujące naprawę zależną od szlaku, są wrażliwe na modulację farmakologiczną i mają szybki czas realizacji. Opracowane przez nas substraty naprawcze są pozachromosomalne, dzięki czemu można je przejściowo transfekować do interesujących ich modeli i łatwo skalować do formatu o wysokiej przepustowości. Wierzymy, że nasze systemy testowe odgrywają ważną rolę w odkrywaniu leków DDR, ale także w pogłębianiu naszego zrozumienia biologii DDR.

W związku z tym mamy nadzieję, że metody te pomogą przyspieszyć identyfikację i ściganie nowych celów leków, co doprowadzi do powstania leków na choroby, takie jak rak, w przypadku których istnieje wiele niezaspokojonych potrzeb medycznych. Na początek wygeneruj każdy substrat reporterowy i sprawdź jego stężenie za pomocą spektrofotometru. Uzyskać 200 nanogramów substratu reporterowego.

Elektroforezę każdego substratu reporterowego wraz z drabinką DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w 0,7% żelu TAE z agarozy zawierającym fluorescencyjne dwuniciowe barwienie DNA. Sprawdź, czy dla każdego podłoża reporterowego są obserwowane zdefiniowane pasma o odpowiednim rozmiarze. W przypadku oceny wpływu związków na test reporterowy, należy dozować związki rozpuszczone w nośniku do studzienek 96-dołkowej płytki.

Aby przygotować mieszankę transfekcyjną na 96-dołkową płytkę, rozcieńczyć plazmid kontrolny Firefly i dwuniciowy substrat reporterowy do naprawy pęknięć NanoLuc w 500 mikrolitrach buforu transfekcyjnego w 1,5-mililitrowej probówce. Po dodaniu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów, mieszaninę DNA należy krótko zwirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby pobrać komórki, poddaj je trypsynizacji i ponownie zawieś w świeżej pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS.

Następnie określ liczbę komórek i ponownie zawieś trzy razy 10 do mocy sześciu komórek w 8,5 mililitra podłoża z FBS w świeżej 15-mililitrowej probówce. Dodaj mieszankę transfekcji DNA do zawiesiny komórkowej i kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać. Umieść 80 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na studzience i inkubuj 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.

Przygotować kontrolną lucyferazy i odczynnik reporterowy lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać substrat do odpowiedniej objętości buforu do oznaczania w stosunku 1:100 i wymieszać. Gdy płytka i odczynniki osiągną temperaturę pokojową, dodaj 80 mikrolitrów kontrolnego odczynnika lucyferazy świetlików na studzienkę.

Potrząsaj płytką przez trzy minuty na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obrotów na minutę. Umieść płytkę w czytniku płytek luminescencyjnych i zmierz kontrolny sygnał luminescencji lucyferazy. Aby zmierzyć sygnał lucyferazy reporterowej, dodaj 80 mikrolitrów odczynnika reporterowego lucyferazy NanoLuc na studzienkę.

Po trzyminutowej inkubacji w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obrotów na minutę, pozostaw płytkę do odpoczynku w temperaturze pokojowej na siedem minut. Na koniec zmierz sygnał luminescencji lucyferazy reporterowej w czytniku płytek luminescencyjnych. Ocena sygnału luminescencji komponentu NanoLuc i Firefly wykazała, że zaobserwowana wada naprawcza była spowodowana redukcją sygnału NanoLuc, podczas gdy sygnał sterujący Firefly był niezakłócony.