Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji
14 czerwca 2024
Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.
Artios opracowuje nowatorskie leki przeciwnowotworowe ukierunkowane na odpowiedź na uszkodzenie DNA. Aby to umożliwić, opracowaliśmy szereg nowatorskich testów do pomiaru aktywności naprawy DNA komórkowego. Testy te miały duży wpływ na nasze programy, prowadząc do testowania zasobów w fazie klinicznej u pacjentów z wysokimi niezaspokojonymi potrzebami medycznymi.
Dokładny pomiar aktywności komórkowej w miejscu docelowym ma zasadnicze znaczenie dla rozwoju nowych terapii celowanych. Generowanie testów dla czynników naprawy DNA o właściwościach wymaganych do napędzania skutecznej kampanii odkrywania leków było wyzwaniem, niezależnie od tego, czy chodzi o potrzebę wysokiej przepustowości, solidnego sygnału do szumu, szybkiej realizacji, a najlepiej możliwości przenoszenia do różnych systemów biologicznych. Opracowaliśmy zestaw solidnych ilościowych i miareczkowych testów reporterowych opartych na luminescencji, aby zmierzyć biegłość czterech głównych ścieżek naprawy pęknięć dwuniciowych, rekombinacji homologicznej, niehomologicznego łączenia końców, łączenia końcówek za pośrednictwem mikrohomologii i wyżarzania jednoniciowego.
Te testy reporterowe są walidowane jako odczytujące naprawę zależną od szlaku, są wrażliwe na modulację farmakologiczną i mają szybki czas realizacji. Opracowane przez nas substraty naprawcze są pozachromosomalne, dzięki czemu można je przejściowo transfekować do interesujących ich modeli i łatwo skalować do formatu o wysokiej przepustowości. Wierzymy, że nasze systemy testowe odgrywają ważną rolę w odkrywaniu leków DDR, ale także w pogłębianiu naszego zrozumienia biologii DDR.
W związku z tym mamy nadzieję, że metody te pomogą przyspieszyć identyfikację i ściganie nowych celów leków, co doprowadzi do powstania leków na choroby, takie jak rak, w przypadku których istnieje wiele niezaspokojonych potrzeb medycznych. Na początek wygeneruj każdy substrat reporterowy i sprawdź jego stężenie za pomocą spektrofotometru. Uzyskać 200 nanogramów substratu reporterowego.
Elektroforezę każdego substratu reporterowego wraz z drabinką DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w 0,7% żelu TAE z agarozy zawierającym fluorescencyjne dwuniciowe barwienie DNA. Sprawdź, czy dla każdego podłoża reporterowego są obserwowane zdefiniowane pasma o odpowiednim rozmiarze. W przypadku oceny wpływu związków na test reporterowy, należy dozować związki rozpuszczone w nośniku do studzienek 96-dołkowej płytki.
Aby przygotować mieszankę transfekcyjną na 96-dołkową płytkę, rozcieńczyć plazmid kontrolny Firefly i dwuniciowy substrat reporterowy do naprawy pęknięć NanoLuc w 500 mikrolitrach buforu transfekcyjnego w 1,5-mililitrowej probówce. Po dodaniu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów, mieszaninę DNA należy krótko zwirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby pobrać komórki, poddaj je trypsynizacji i ponownie zawieś w świeżej pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS.
Następnie określ liczbę komórek i ponownie zawieś trzy razy 10 do mocy sześciu komórek w 8,5 mililitra podłoża z FBS w świeżej 15-mililitrowej probówce. Dodaj mieszankę transfekcji DNA do zawiesiny komórkowej i kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać. Umieść 80 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na studzience i inkubuj 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.
Przygotować kontrolną lucyferazy i odczynnik reporterowy lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać substrat do odpowiedniej objętości buforu do oznaczania w stosunku 1:100 i wymieszać. Gdy płytka i odczynniki osiągną temperaturę pokojową, dodaj 80 mikrolitrów kontrolnego odczynnika lucyferazy świetlików na studzienkę.
Potrząsaj płytką przez trzy minuty na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obrotów na minutę. Umieść płytkę w czytniku płytek luminescencyjnych i zmierz kontrolny sygnał luminescencji lucyferazy. Aby zmierzyć sygnał lucyferazy reporterowej, dodaj 80 mikrolitrów odczynnika reporterowego lucyferazy NanoLuc na studzienkę.
Po trzyminutowej inkubacji w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obrotów na minutę, pozostaw płytkę do odpoczynku w temperaturze pokojowej na siedem minut. Na koniec zmierz sygnał luminescencji lucyferazy reporterowej w czytniku płytek luminescencyjnych. Ocena sygnału luminescencji komponentu NanoLuc i Firefly wykazała, że zaobserwowana wada naprawcza była spowodowana redukcją sygnału NanoLuc, podczas gdy sygnał sterujący Firefly był niezakłócony.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokoły oceny sprawności szlaków naprawy podwójnych rozerwań DNA w komórkach przy użyciu świetlnych substratów raportujących pozachromosomalnych. Opracowane testy są kluczowe dla zrozumienia odpowiedzi na uszkodzenie DNA i ułatwiają odkrywanie leków w onkologii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Odpowiedź na uszkodzenie DNA
- Mechanizmy naprawy komórkowej
- Odkrywanie leków onkologicznych
Tło
- Podwójne rozerwania DNA są krytycznymi uszkodzeniami, które wymagają efektywnej naprawy.
- Zrozumienie szlaków naprawy jest niezbędne dla opracowywania ukierunkowanych terapii przeciwnowotworowych.
- Istniejące testy do pomiaru aktywności naprawy DNA mają ograniczenia w przepustowości i czułości.
- Nowe testy mogą ulepszyć wysiłki w zakresie odkrywania leków poprzez dokładne pomiary aktywności komórkowej.
Cel badania
- Opracowanie solidnych testów do pomiaru sprawności głównych szlaków naprawy podwójnych rozerwań DNA.
- Ułatwienie identyfikacji nowych celów terapeutycznych w leczeniu raka.
- Poprawa zrozumienia biologii odpowiedzi na uszkodzenie DNA.
Stosowane metody
- Opracowanie testów raportujących opartych na luminescencji dla czterech szlaków naprawy.
- Tymczasowa transfekcja pozachromosomalnych substratów do modeli komórkowych.
- Pomiar sygnałów luminescencji w celu oceny sprawności naprawy.
- Walidacja testów pod kątem wrażliwości na modulacje farmakologiczne.
Główne wyniki
- Testy wykazały zależną od szlaku aktywność naprawy.
- Pomiar ilościowy wykazał wrażliwość na modulacje lekami.
- Osiągnięto krótkie czasy realizacji wyników testów.
- Testy są skalowalne dla wysoko-przepustowości ekranowania.
Wnioski
- Opracowany testy są cennym narzędziem do odkrywania leków w walce z rakiem.
- Poprawiają zrozumienie mechanizmów naprawy DNA.
- Te metody mogą przyspieszyć identyfikację nowych celów terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative luminescence-based reporter assays for DNA double strand break repair enable high-throughput, pathway-specific measurement of cellular DNA repair activity, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. These assays provide rapid, reproducible, and scalable outputs essential for advancing DNA damage response (DDR) therapeutics. Their integration into discovery pipelines enhances predictive confidence and portfolio triage for DDR-targeted assets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DDR pathway activity for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing pathway-specific repair proficiency.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and biological relevance.
- Accelerates identification and prioritization of novel DDR drug targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts for robust assay standardization.
- Delivers high-throughput, scalable formats suitable for compound screening.
- Ensures reproducibility and titratability across diverse biological systems.
- Enables reliable evaluation of pharmacological modulation of DNA repair pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns pathway-specific repair measurements with disease-relevant DDR biology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of DDR targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for DDR-focused portfolios.
- Provides mechanistic insights to guide translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
These assays position within the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical evaluation of DDR-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for DDR mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides sensitive luminescence measurements to compare repair activity across conditions.
- Translational Research: Enables alignment of cellular repair proficiency with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable platform adaptable to multiple cell systems and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates assay workflows with high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biological readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DDR-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and luminescence assay design.
- Needs access to luminescence plate readers and standard cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various cell models via transient transfection of extrachromosomal substrates.
- Dependent on validated controls to distinguish pathway-specific repair activity.
