Name: Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Poznaj metody oceny aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych testów reporterowych opartych na luminescencji. Te narzędzia wspierają odkrywanie leków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie prace zostały sfinansowane przez Artios Pharma Ltd. Rysunek 1 i Rysunek 3 zostały stworzone przy użyciu Biorender.com.

Quantifying DNA Double Strand Break Repair with Nanoluciferase Reporter Assays

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism%2C+cellular+functions+and+cancer+roles+of+polymerase-theta-mediated+DNA+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).</li>
<li>Ceccaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous-recombination-deficient+tumours+are+dependent+on+Pol%CE%B8-mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair.</a> Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).</li>
<li>van de Kooij, B., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+reporter+constructs+to+monitor+pathway-specific+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks.</a> Front Genet. 12, 809832(2021).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).</li>
<li>Rajendra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((titratable+and+high-throughput+reporter+assays+to+measure+DNA+double+strand+break+repair+activity+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells.</a> Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Wyatt, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+polymerase+%CE%B8-mediated+end+joining+in+the+repair+of+chromosome+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks.</a> Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).</li>
<li>Wood, R. D., Doublié, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+protection+by+DNA+polymerase+%CE%B8%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome protection by DNA polymerase θ.</a> Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>Zatreanu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol%CE%B8+inhibitors+elicit+BRCA-gene+synthetic+lethality+and+target+PARP+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance.</a> Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).</li>
<li>Stockley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-based+optimization+of+small-molecule+in+vitro+and+in+vivo+probes+for+human+DNA+polymerase+theta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta.</a> J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+the+BRCA2-RAD51+interaction+modulates+RAD51+assembly+and+potentiates+DNA+damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death.</a> Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).</li>
</ol>

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S. i H.M.R.R. są pracownikami i akcjonariuszami Artios Pharma Ltd. G.C.M.S. jest akcjonariuszem AstraZeneca PLC. S.J.B. jest założycielem, naukowcem i udziałowcem Artios Pharma Ltd. Złożono wniosek patentowy na niektóre z reporterów przedstawionych w tym badaniu (WO 2021/001647). Promega jest źródłem technologii NanoLuc® i zmodyfikowanych polinukleotydów NanoLuc®. Firma Artios Pharma uzyskała autoryzację firmy Promega do wytwarzania zmodyfikowanych polinukleotydów NanoLuc®.

W tym miejscu opisaliśmy protokoły generowania i wdrażania zestawu reporterów opartych na luminescencji pozachromosomalnej do pomiaru biegłości komórkowej czterech głównych szlaków DSBR (HR, NHEJ, MMEJ i SSA)7. Substraty reporterowe mogą być wprowadzane do komórek przez transfekcję przejściową i wykorzystywane do oceny aktywności DSBR przy użyciu czułego i solidnego odczytu luminescencji NanoLuc na płytce, która jest odtwarzana po zaangażowaniu w pokrewne szlaki komórkowe DSBR.
Kilka etapów generowania substratu reporterowego, transfekcji substratów do komórek i interpretacji danych ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego przeprowadzenia tych testów. Chociaż do generowania substratów reporterowych stosuje się standardowe techniki biologii molekularnej, wizualizacja procesu za pomocą elektroforezy żelowej zapewnia najwyższą jakość i czystość substratów przed transfekcją. Ponieważ testy te opierają się na transfekcji przejściowej, zastosowanie mają wspólne względy dotyczące tych metod. Obejmują one optymalizację gęstości wysiewu, warunków transfekcji (w tym odczynników i ilości DNA) oraz ocenę przydatności w formatach transfekcji do przodu i do tyłu. Te testy reporterowe zostały z powodzeniem przeprowadzone przy użyciu szeregu protokołów elektroporacji i lipofekcji, a opcje powinny być w pełni zbadane przed wykonaniem tych testów. Należy również zwrócić uwagę na kontrolę składowych sygnałów NanoLuc i Firefly, a nie tylko kompozytowego sygnału naprawy uzyskanego przez normalizację sygnału NanoLuc (substrat reporterowy) do sygnału Firefly (kontrola). Artefakty mogą wynikać ze współczynnika napędzanego przez zmiany w sygnale Firefly. Na przykład, ocena inhibicji w trybie dawka-odpowiedź przy użyciu wysoce specyficznego związku powinna tłumić sygnał NanoLuc w sposób miareczkowany bez zakłócania sygnału Firefly, który powinien pozostać stabilny (Figura 4G,H). Jednak w przypadkach, gdy sygnały Firefly są zakłócone, użyteczny wpływ na naprawę można nadal określić, identyfikując okno dawki, w którym sygnał Firefly nie jest zakłócony (ryc. 5).
W porównaniu z najczęściej stosowanymi testami reporterowymi DSBR, te pozachromosomalne testy reporterowe oparte na luminescencji mają pewne wyraźne zalety. Ponieważ szlaki DSBR są wysoce konserwatywne, nawet jeśli maszyneria komórkowa różni się w zależności od modelu komórkowego, testy mogą nadal informować o biegłości DSBR i wyborze ścieżki. Otwiera to ocenę DSBR na dowolny model, który może być interesujący dla użytkownika, o ile z góry zostaną ustalone optymalne warunki transfekcji przejściowej.
Zastosowanie nanolucyferazy jako genu reporterowego ma również przewagę nad opcjami fluorescencyjnymi, które były tradycyjnie stosowane w testach reporterowych DSBR. NanoLuc szybko dojrzewa, a luminescencja jest wykrywana z dużą czułością za pomocą czytnika płytek8. W połączeniu z szybkością naprawy substratu (ponieważ substraty reporterowe są transfekowane do komórek z gotowymi do naprawy końcami DSB), ten format testu reporterowego DSBR jest idealny do szybkiej realizacji i odporności ilościowej wymaganej do badań przesiewowych małych cząsteczek w ramach kaskady odkrywania leków przemysłowych. Rzeczywiście, niedawno opisaliśmy implementację niezależnego od resekcji testu reporterowego MMEJ w kaskadzie odkryć wykorzystywanej do identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów domeny polimerazy Polθ13.
Istnieje również elastyczność w realizacji testów reporterowych w celu odpowiedzi na konkretne pytania dotyczące genetycznych i farmakologicznych zaburzeń DSBR (ryc. 3). Na przykład, przed transfekcją substratów reporterowych, komórki mogą być transfekowane siRNA przeciwko genowi będącemu przedmiotem zainteresowania przez 48-72 godziny. Alternatywnie, wpływ nadekspresji genów na szlaki DSBR można przetestować, wykonując transfekcję plazmidu 24-48 godzin przed transfekcją substratów reporterowych. W przypadku badań farmakologicznych niniejszy protokół opisuje już, w jaki sposób wykorzystanie małych cząsteczek może zostać włączone do standardowego przepływu pracy, ale alternatywne formaty mogą obejmować zmiany w schematach leczenia związkami, takie jak wstępna inkubacja lub wymłukiwanie.
Skalowalność transfekcji w stanach nieustalonych może również wspierać podejścia przesiewowe na dużą skalę, w których transfekcja partiowa substratów reporterowych jest przeprowadzana przed badaniem przesiewowym. Co więcej, czas trwania testu od transfekcji do odczytu może być również różny. Chociaż standardowy czas trwania może wynosić 16-24 godziny, niektóre testy można odczytać już w ciągu 6 godzin7. Przy określaniu czasu trwania testu należy również wziąć pod uwagę obawy dotyczące toksyczności małych cząsteczek lub siRNA, które mogą zagrozić żywotności komórek.
Podsumowując, testy przedstawione w tym badaniu i w pełni opisane w niedawnej publikacji7 zapewniają szybką i solidną ocenę biegłości w zakresie komórkowego DSBR. Są bardzo czułe i miareczkowane, dzięki czemu można je poddać badaniom genetycznym i farmakologicznym. Co najważniejsze, ponieważ substraty reporterowe mogą być wprowadzane do komórek przez transfekcję przejściową, mają one potencjał do wykorzystania w dowolnym modelu komórki transfekcyjnej, który jest przedmiotem zainteresowania, a nie ograniczają się do określonych linii komórkowych poprzez stabilną integrację, jak ma to miejsce w przypadku chromosomalnych reporterów DSBR. Jednak wyraźnym ograniczeniem tych reporterowych testów pozachromosomalnych jest to, że brak integracji z genomem może nie w pełni podsumować fizjologiczny, chromatynowy kontekst naprawy DNA i związanych z nim wskazówek regulacyjnych i orkiestracji15. W tym celu pozachromosomalne testy reporterowe stanowią uzupełnienie istniejących metod oceny DSBR i rozszerzają zestaw narzędzi odpowiednich zarówno do badań podstawowych, jak i odkrywania leków.

Pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) reprezentują szczególnie toksyczną klasę uszkodzeń DNA1, dzięki czemu komórki wyewoluowały wiele ścieżek naprawy DSB (DSBR) w celu naprawy tych zmian. Cztery główne mechanizmy DSBR to rekombinacja homologiczna (HR), niehomologiczne łączenie końcówek (NHEJ), łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) i wyżarzanie pojedynczej nici (SSA)2,3. Szlaki DSBR przyczyniają się do utrzymania zdrowego rozwoju i fizjologii tkanek oraz chronią przed chorobami, takimi jak rak. Co więcej, te mechanizmy naprawcze mają potencjał terapeutyczny dla rozwoju modulatorów małocząsteczkowych w onkologii precyzyjnej. Na przykład celowanie w polimerazę DNA θ (Polθ), kluczowy enzym w szlaku naprawy MMEJ, wzbudziło zainteresowanie ze względu na jego syntetyczną śmiertelność z niedoborem HR w raku4.
Zrozumienie DSBR ma zatem szerokie implikacje kliniczne i potrzebne są funkcjonalne testy komórkowe zdolne do pomiaru aktywności wszystkich głównych szlaków DSBR5. Testy muszą nadawać się zarówno do badań genetycznych, jak i farmakologicznych oraz być możliwe do zastosowania w różnych modelach komórkowych będących przedmiotem zainteresowania. Aby wesprzeć wysiłki związane z odkrywaniem leków małocząsteczkowych, testy muszą być bardzo czułe, miareczkowe, mieć szybki czas realizacji i być skalowalne do formatów o wysokiej przepustowości, odpowiednich do badań przesiewowych związków.
Ogólnie, DSBR był wcześniej mierzony za pomocą systemów testów reporterowych opartych na fluorescencji, stabilnie zintegrowanych z genomem komórki6. Jednakże, podczas gdy fizjologiczna rekapitulacja chromosomalnego DSBR jest wyraźną zaletą, takie testy są ograniczone do modelu gospodarza, w którym reporter jest zintegrowany, wykorzystują pracochłonne przygotowanie i analizę próbek za pomocą cytometrii przepływowej i mają ograniczoną przepustowość, czas realizacji, solidność i czułość, wszystkie niezbędne cechy niezbędne do odkrywania leków.
Tutaj opisujemy zestaw testów reporterowych DSBR, które pozwalają na ocenę czterech głównych ścieżek DSBR. Zestaw substratów do testów reporterowych jest opisany w Rysunek 1 i szczegółowo opisany w niedawnej publikacji7. Są one pozachromosomalne, co pozwala na ich wprowadzenie do komórek przez prostą transfekcję przejściową i włączenie genu reporterowego nanolucyferazy8, który musi zostać odtworzony przez zaangażowanie w określone mechanizmy DSBR, rodzi czułość, solidność i skalowalność. W protokole uwzględniono następujące warianty substratu reporterowego DSBR (Rysunek 1):
Niezależny od resekcji MMEJ: Ten liniowy substrat składa się z regionu dwuniciowego DNA (dsDNA) z nawisami jednoniciowego DNA (ssDNA), które naśladują wycięte końcówki DNA9. Cztery mikrohomologie nukleotydowe na końcach regionów ssDNA kodują kodon start dla genu reporterowego. Naprawa tego substratu za pomocą MMEJ przywraca otwartą ramkę odczytu genu reporterowego (ORF).
MMEJ zależne od resekcji: N-końcowy ekson genu reporterowego jest przerywany przez segment zawierający kodon stop, który jest otoczony przez 8 mikrohomologii par zasad (bp). Resekcja końca nukleolitycznego jest wymagana przed naprawą za pośrednictwem MMEJ w celu przywrócenia nienaruszonego genu reporterowego.
Blunt NHEJ: Gen reporterowy jest podzielony na sekcje N- i C-końcowe, z których ta ostatnia jest umieszczona przed promotorem. DSB jest wytwarzany przy użyciu EcoRV i wymaga bezpośredniej ligacji (bez przetwarzania końcowego) przez NHEJ w celu ponownego połączenia obu części genu reporterowego i przywrócenia reporterowego ORF.
Non-blunt NHEJ: DSB znajduje się wewnątrz intronu i będzie miał spójne lub niespoiste końce, w zależności od wyboru enzymu restrykcyjnego. Naprawa tego podłoża przez NHEJ wymaga podwiązania poprzedzonego obróbką końcową.
Długa matryca HR: N-końcowy ekson genu reporterowego jest przerywany przez segment DNA zawierający miejsca restrykcyjne, które zastępują 22 pz oryginalnej sekwencji genu reporterowego. Aby przywrócić tę sekwencję, naprawa przez HR wykorzystuje szablon homologii 2,5 kilozasady (kb) umieszczony poniżej C-końcowego eksonu.
Krótki szablon HR: Miejsce restrykcyjne potrzebne do wygenerowania DSB zastępuje część natywnej sekwencji genu reporterowego i wprowadza kodon stop w ramce. Podobnie jak wersja z długim szablonem, ten substrat HR wymaga dalszego szablonu homologii (360 pz) w celu dokładnej naprawy i przywrócenia reportera ORF.
SSA: Ten substrat zawiera przedwczesny kodon stop znajdujący się w N-końcowym eksonie genu reporterowego. Usunięcie tego kodonu stop i przywrócenie nienaruszonej sekwencji genu reporterowego wymaga naprawy przez SSA, która obejmuje dwukierunkową resekcję dalekiego zasięgu przed wyrównaniem homologii.
Dla generowania DSB, niektóre z substratów reporterowych mogą być trawione za pomocą I-SceI (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W ten sposób zostanie wygenerowany liniowy substrat z niespójnymi końcami w zależnym od resekcji MMEJ, nietępym NHEJ, długich matrycach HR i reporterach SSA, które mają tandemowe miejsca I-SceI w odwróconej orientacji. W krótkim szablonowym substracie reporterowym HR, trawienie pojedynczego miejsca I-SceI wygeneruje spójne końce. Nietępe NHEJ, zależne od resekcji plazmidy MMEJ, długie matryce HR i SSA mogą być również trawione za pomocą HindIII, co wytworzy komplementarne spójne końce.
Udostępniamy protokoły generowania substratów testowych reporterowych i opisujemy, jak testy mogą być przeprowadzane, dostarczając szczegółów na temat tego, jak można je wykorzystać do ilościowego oznaczania DSBR, w tym miareczkowych odpowiedzi na małe cząsteczki, oceny siły komórkowej, aktywności na miejscu i selektywności szlaku.

<table><tbody><tr><td>10x Bufor TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>20% żel akryloamidowy TBE</td><td>Invitrogen</td><td>EC6315BOX</td><td></td></tr><tr><td>50x Bufor TAE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13321</td><td></td></tr><tr><td>6x Gel Loading Dye, fioletowy</td><td>NEB</td><td>B7024S</td> 96-dołkowa biała płytka <td></td></tr><tr><td>(z przezroczystym dnem i pokrywką)</td><td>Porvair</td><td>204012</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Tasak Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>z fosfatazy antarktycznej i bufora 10X</td> na podstawie perełek <td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>430-101</td><td>Czytnik płytek</td></tr><tr><td>Countess II Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX1000</td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>Niestandardowe oligonukleotydy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zamówienie niestandardowe</td><td>Do niezależnego od resekcji substratu MMEJ. Patrz tabela 2.</td></tr><tr><td>Dozownik związków D300e</td><td>Tecan</td><td>30100152</td><td>na bazie DMSO</td></tr><tr><td>Kaseta D300e D4+ Tecan</td><td></td><td>30097371</td><td>Kaseta o dużej objętości do dozownika związków D300e</td></tr><tr><td>Kaseta D300e T8+</td><td>Tecan</td><td>30097370</td><td>Kaseta o małej objętości do dozownika związków D300e</td></tr><tr><td>Sultlenek dimetylu, klasa hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Nośnik dla związków, używany na rysunku 4 i Ryc. 5</td></tr><tr><td>Plazmidy źródłowe reportera DSBR</td><td>Artios</td><td></td><td>Dostępne dla społeczności akademickiej na żądanie&nbsp;</td></tr><tr><td>EcoRV-HF i 10x bufor CutSmart</td><td>NEB</td><td>R3195M</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu PAN-Biotech</td><td>P30-3031&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1211</td><td>Drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowej</td></tr><tr><td>Komórki HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Przykładowa linia komórkowa używana w protokole</td></tr><tr><td>HindIII-HF i 10x bufor CutSmart</td><td>NEB</td><td>R3104M</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Biologia molekularna klasa wody</td><td>Fisher Scientific</td><td>10275262</td><td></td></tr><tr><td>SceI i 10x Tango Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>ER1771</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>VWR</td><td>20842.33</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME odczynnik i bufor</td><td>PolyPlus</td><td>114-15</td><td>Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów</td></tr><tr><td>MegaStar 1.6</td><td>VWR</td><td>521-1749</td><td>Wirówka do probówek 15 lub 50 ml</td></tr><tr><td>MEM Eagle</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-08056</td><td>Pożywka hodowlana do komórek HEK-293</td></tr><tr><td>Mikropłytka Wytrząsarka</td><td>Fisherbrand</td><td>15504070</td><td>Wytrząsarka orbitalna MicroStar</td></tr><tr><td>17R</td><td>VWR</td><td>521-1647</td><td>Wirówka do probówek 1,5 lub 2 ml</td></tr><tr><td>MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>5840300</td><td>Dozownik odczynników na bazie komórek lub wody</td></tr><tr><td>MultiDrop Standard Kaseta</td><td>Thermo Fisher</td><td>24072670</td><td>Kaseta do dozownika odczynników MultiDrop</td></tr><tr><td>NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate</td> Odczynnik lucyferazy <td>Promega</td><td>N1630 lub N1650</td><td>Reporter (NanoLuc) do gaszenia luminescencji Firefly i wykrywania luminescencji NanoLuc. Część zestawu Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System</td></tr><tr><td>ONE-Glo EX Luciferazy Assay Buffer and Substrate</td><td>Promega</td><td>N1630 lub N1650</td><td>Control lucyferazy (Firefly) do wykrywania Firefly. Część zestawu Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System</td></tr><tr><td>PBS (bez wapnia i magnezu)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Plazmid Firefly (lub podobny)</td><td>Promega</td><td>E1310 (lub równoważny)</td><td>Plazmid kontrolny Firefly</td></tr><tr><td>pNL1.1 Plazmid NanoLuc (lub podobny)</td><td>Promega</td><td>N1091 (lub równoważny)</td><td>Plazmid kontrolny NanoLuc, do regulacji ustawień sprzętu/eksperymentów optymalizacyjnych</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 1 kb Drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N0552S</td><td>Drabinka DNA o wysokiej masie cząsteczkowej</td></tr><tr><td>Octan sodu (3 M), pH 5,5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9740</td><td>Do regulacji pH podczas ekstrakcji żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick</td></tr><tr><td>SYBR Gold (10 000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Do wizualizacji ssDNA i dsDNA</td></tr><tr><td>SYBR Safe (10,000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Do wizualizacji dsDNA tylko</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4 i 10x bufor ligazy</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie błękitem trypanowym 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Do pomiaru żywotności podczas liczenia komórek</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA; 0,25% trypsyna i 0,53 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>XhoI oraz 10x bufor CutSmart</td><td>NEB</td><td>R0146M</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici dna przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

Naprawa pęknięć podwójnej nici DNA (DSB) jest kluczowa dla utrzymania stabilności genomu i żywotności komórek. Naprawa DSB (DSBR) w komórkach odbywa się za pośrednictwem kilku mechanizmów: rekombinacji homologicznej (HR), niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), łączenia końcówek za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) i wyżarzania pojedynczej nici (SSA). Testy komórkowe są niezbędne do pomiaru biegłości i modulacji tych szlaków w odpowiedzi na różne bodźce.
Tutaj prezentujemy zestaw pozachromosomalnych testów reporterowych, z których każdy mierzy rekonstytucję genu reporterowego nanolucyferazy przez jeden z czterech głównych szlaków DSBR w komórkach. Po przejściowej transfekcji do komórek będących przedmiotem zainteresowania, naprawę substratów reporterowych specyficznych dla szlaku można zmierzyć w czasie krótszym niż 24 godziny poprzez wykrycie luminescencji nanolucyferazy (NanoLuc).
Te solidne testy są ilościowe, czułe, miareczkowane i podatne na wysokoprzepustowy format przesiewowy. Właściwości te zapewniają szerokie zastosowanie w badaniach nad naprawą DNA i odkrywaniu leków, uzupełniając obecnie dostępny zestaw narzędzi komórkowych testów DSBR.

Naprawę każdego z testów reporterowych można wykryć i ilościowo określić, stosując tę samą procedurę. Prawidłowa naprawa substratu przez odpowiadający mu szlak naprawczy w komórkach przywróci nienaruszony, funkcjonalny ORF kodujący NanoLuc. Sygnał luminescencyjny ten można wykryć za pomocą czytnika płytek.
Współtransfekcja nienaruszonym plazmidem kodującym lucyferazę świetlikową służy jako kontrola transfekcji. Kontrola ta spełnia dwa cele. Po pierwsze, stanowi standard do normalizacji sygnału NanoLuc, ponieważ nie powinna być ona zaburzana przez modulację DSBR za pomocą środków genetycznych lub farmakologicznych. Po drugie, może ona wskazywać na poza-celowe zaburzenia komórkowe wpływające na sygnał lucyferazy, takie jak modulacja cyklu komórkowego, wpływ na transkrypcję/translację lub ogólna toksyczność.
Stosunek NanoLuc do Firefly służy jako zastępczy odczyt naprawy. Wartości luminescencji można wyeksportować i przeanalizować poprzez normalizację dwóch sygnałów lucyferazy z tej samej studzienki. W przypadku badań nad perturbacjami genetycznymi (np. porównywania typu dzikiego z KO lub siRNA nietargetującym z targetującym), naprawę zazwyczaj normalizuje się względem próbki rodzicielskiej (komórek typu dzikiego lub komórek traktowanych kontrolnym siRNA nietargetującym). W przypadku modulacji farmakologicznej wartości z próbki traktowanej związkiem są normalizowane względem wartości uzyskanej po traktowaniu nośnikiem.
Pełna walidacja opisanego zestawu reporterów została niedawno opublikowana7. Dane obrazujące charakterystykę genetycznej i farmakologicznej modulacji DSBR przedstawiono na Rysunku 4 (zaadaptowano z 7). Polθ jest kluczowym mediatorem MMEJ, a utrata lub inhibicja tego enzymu ma prowadzić do specyficznego zniesienia komórkowego MMEJ3,10. Wykorzystując linię komórkową, w której wyciszono gen POLQ kodujący Polθ11, test reporterowy MMEJ niezależny od resekcji wykazuje, że MMEJ jest rzeczywiście niemal całkowicie zahamowany. Ocena sygnałów luminescencji NanoLuc i Firefly pokazuje, że obserwowany defekt naprawy jest wynikiem zmniejszenia sygnału NanoLuc (kodowanego przez substrat reporterowy), podczas gdy sygnał Firefly (kontrola) pozostaje niezmieniony (Rysunek 4A-C). W przeciwieństwieństwie do tego, ocena wydajności NHEJ z wykorzystaniem reportera NHEJ dla końców tępych wykazuje, że nokaut POLQ nie hamuje naprawy substratu reporterowego (Rysunek 4D-F). Wspólnie te dane genetyczne potwierdzają specyficzną rolę Polθ w naprawie pośredniczonej przez MMEJ. Obserwacje te zostały w pełni powtórzone farmakologicznie przy użyciu ART55812,13, niedawno opisanego, silnego i specyficznego inhibitora domeny polimerazy Polθ (Rysunek 4G), gdzie zaobserwowano miareczkowalną inhibicję MMEJ, wynikającą ze specyficznego spadku sygnału NanoLuc, a nie sygnału Firefly (Rysunek 4H). Co więcej, zgodnie z danymi genetycznymi, nie stwierdzono wpływu na NHEJ (Rysunek 4I,J). Razem dane te podkreślają, w jaki sposób reportery te mogą być wykorzystywane do charakterystyki genetycznej modulacji szlaków DSBR oraz do wykazania komórkowej potencji i specyficzności względem celu/szlaku w przypadku małych cząsteczek.
<img alt="Wydajność naprawy DNA, wyniki testu luminescencyjnego, NHEJ, MMEJ, komórki POLQ(-), efekt stężenia ART558." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wpływ nokautu genetycznego i farmakologicznego hamowania Polθ na sygnały reporterowe MMEJ i NHEJ. Komórki eHAP1 WT oraz POLQ(-) przetransfekowano kontrolnym plazmidem Firefly oraz (A-C) niezależnym od resekcji reporterem MMEJ lub (D-F) reporterem NHEJ dla tępych końców. Procent naprawy MMEJ lub NHEJ stanowi stosunek luminescencji NanoLuc do luminescencji Firefly, znormalizowany względem kontroli traktowanej DMSO, 24 h po transfekcji. Dane przedstawiają średnią ± SEM z trzech powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało średnią z 8 powtórzeń technicznych. Komórki HEK-293 przetransfekowano kontrolnym plazmidem Firefly oraz (G,H) niezależnym od resekcji reporterem MMEJ lub (I,J) reporterem NHEJ dla tępych końców i poddano działaniu inhibitora polimerazy Polθ ART558. Procent naprawy stanowi stosunek luminescencji NanoLuc do luminescencji Firefly, znormalizowany względem kontroli traktowanej DMSO, 24 h po transfekcji. Procent hamowania poszczególnych sygnałów luminescencyjnych w (G) i (I) obliczono względem kontroli traktowanej DMSO i przedstawiono odpowiednio w (H) i (J). Dane przedstawiają średnią ± SEM z 2 powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało średnią z 4 powtórzeń technicznych. Rysunek opracowano na podstawie pracy Rajendra i wsp.7. Skróty: NanoLuc = nanolucyferaza; MMEJ = łączenie końców zależne od mikrohomologii; NHEJ = niespecyficzne łączenie końców; WT = typ dziki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywa naprawy HR, test luminescencyjny IC50 dla CAM833; wykres porównania danych NanoLuc i Firefly." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Hamowanie sygnału reportera HR przez inhibitor RAD51 CAM833. (A) Komórki HEK-293 przetransfekowano substratem reporterowym HR z długim matrycem oraz kontrolnym plazmidem lucyferazy Firefly, a następnie poddano działaniu inhibitora RAD51 CAM83314. Luminescencję NanoLuc i Firefly odczytano 16 h po transfekcji. Procent naprawy HR stanowi stosunek luminescencji NanoLuc do luminescencji Firefly, znormalizowany do kontroli traktowanej DMSO. Linie przerywane wskazują procent hamowania HR oraz stężenie CAM833 dla EC50 krzywej. Dane przedstawiają średnią ± SEM z 2 powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało średnią z 4 powtórzeń technicznych. (B) Obliczono procentowe hamowanie poszczególnych sygnałów luminescencyjnych z (A) w stosunku do kontroli traktowanej DMSO. Linie przerywane wskazują procentowe hamowanie NanoLuc i Firefly przy stężeniu 3,33 µM CAM833 (EC50). Spadek sygnału Firefly przy stężeniach CAM833 ≥ 10 µM wskazuje na toksyczność związku przy wysokich dawkach; jednak redukcja sygnału NanoLuc jest obserwowana przy stężeniach, w których sygnał Firefly pozostaje niezmieniony, co sugeruje, że CAM833 indukuje celowane hamowanie HR. Rycina została zaadaptowana z Rajendra et al.7. Skróty: NanoLuc = nanolucyferaza; HR = rekombinacja homologiczna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Podłoże reporterowe</td>
			<td>Plazmid źródłowy 
			(rozmiar w kb, oporność)</td>
			<td colspan="3">Generowanie DSB</td>
			<td>Przewidywana wielkość końcowego substratu reporterowego (kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">MMEJ niezależna od resekcji</td>
			<td>4,0, Kan</td>
			<td colspan="3">Wycięte końce 3' poprzez ligację czapeczek</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">MMEJ zależny od resekcji</td>
			<td>6,5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (nielepkich), HindIII (lepkich)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) tępych</td>
			<td>4.3, Kan</td>
			<td colspan="3">Końce tępe po wycięciu z plazmidu za pomocą EcoRV</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Nienitko-końcowe NHEJ</td>
			<td>6,7, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (nielepkie), HindIII (lepkie)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Długi szablon HR</td>
			<td>9,2, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (nielepkie), HindIII (lepkie)</td>
			<td>9.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Krótki szablon HR</td>
			<td>9,3, Amp</td>
			<td colspan="3">I-SceI (kohezyjne)</td>
			<td>9.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">SSA</td>
			<td>9,5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (niekohezyjne), HindIII (kohezyjne)</td>
			<td>9.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Plazmidy substratowe reporterowe. Skróty: DSB = pęknięcie dwuniciowe; MMEJ = łączenie końców zależne od mikrohomologii; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie pojedynczej nici; Kan = kanamycyna; Amp = ampicylina.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Sekwencja (5’-3’)</td>
			<td>Dostawca</td>
			<td>Oczyszczanie</td>
			<td>Funkcja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">5’[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT 
			GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC 
			CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>elektroforeza w żelach poliakrylamidowych</td>
			<td>Kaptur lewy, długi oligonukleotyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">5’[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGE</td>
			<td>Kaptur lewy, krótki oligonukleotyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">5’[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA 
			CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG 
			GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC 
			GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>żel elektroforetyczny (PAGE)</td>
			<td>Prawy kapturek, długi oligonukleotyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">5’[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA 
			GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGE</td>
			<td>Kapturek prawy, krótki oligonukleotyd</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Oligonukleotydy do końcówek (caps) w celu generowania podłoża reporterowego MMEJ niezależnego od resekcji. Skróty: ssDNA = jednoniciowy DNA; dsDNA = dwuniciowy DNA; MMEJ = łączenie końców zależne od mikrohomologii; PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Mikrohomologie są podkreślone.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analiza reporterowa</td>
			<td>DNA substratu reporterowego NanoLuc (µg DNA/1x106 komórki)</td>
			<td>plazmid kontrolny lucyferazy świetlika (µg DNA/1x106 komórki)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMEJ niezależny od resekcji</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMEJ zależna od resekcji</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niespecyficzne łączenie końców (Blunt NHEJ)</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nieliniowe NHEJ (nie-tępe NHEJ)</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długi szablon HR</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krótki szablon HR</td>
			<td>2</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSA</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Ilości DNA do przejściowej transfekcji substratów reportera NanoLuc oraz kontrolnego plazmidu lucyferazy Firefly (HEK-293, format płytki 96-dołkowej). Skróty: MMEJ = łączenie końców pośredniczone przez mikrohomologię; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie pojedynczej nici.

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is ...

Artios opracowuje nowatorskie leki przeciwnowotworowe ukierunkowane na odpowiedź na uszkodzenie DNA. Aby to umożliwić, opracowaliśmy szereg nowatorskich testów do pomiaru aktywności naprawy DNA komórkowego. Testy te miały duży wpływ na nasze programy, prowadząc do testowania zasobów w fazie klinicznej u pacjentów z wysokimi niezaspokojonymi potrzebami medycznymi.Dokładny pomiar aktywności komórkowej w miejscu docelowym ma zasadnicze znaczenie dla rozwoju nowych terapii celowanych. Generowanie testów dla czynników naprawy DNA o właściwościach wymaganych do napędzania skutecznej kampanii odkrywania leków było wyzwaniem, niezależnie od tego, czy chodzi o potrzebę wysokiej przepustowości, solidnego sygnału do szumu, szybkiej realizacji, a najlepiej możliwości przenoszenia do różnych systemów biologicznych. Opracowaliśmy zestaw solidnych ilościowych i miareczkowych testów reporterowych opartych na luminescencji, aby zmierzyć biegłość czterech głównych ścieżek naprawy pęknięć dwuniciowych, rekombinacji homologicznej, niehomologicznego łączenia końców, łączenia końcówek za pośrednictwem mikrohomologii i wyżarzania jednoniciowego.Te testy reporterowe są walidowane jako odczytujące naprawę zależną od szlaku, są wrażliwe na modulację farmakologiczną i mają szybki czas realizacji. Opracowane przez nas substraty naprawcze są pozachromosomalne, dzięki czemu można je przejściowo transfekować do interesujących ich modeli i łatwo skalować do formatu o wysokiej przepustowości. Wierzymy, że nasze systemy testowe odgrywają ważną rolę w odkrywaniu leków DDR, ale także w pogłębianiu naszego zrozumienia biologii DDR.W związku z tym mamy nadzieję, że metody te pomogą przyspieszyć identyfikację i ściganie nowych celów leków, co doprowadzi do powstania leków na choroby, takie jak rak, w przypadku których istnieje wiele niezaspokojonych potrzeb medycznych. Na początek wygeneruj każdy substrat reporterowy i sprawdź jego stężenie za pomocą spektrofotometru. Uzyskać 200 nanogramów substratu reporterowego.Elektroforezę każdego substratu reporterowego wraz z drabinką DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w 0,7% żelu TAE z agarozy zawierającym fluorescencyjne dwuniciowe barwienie DNA. Sprawdź, czy dla każdego podłoża reporterowego są obserwowane zdefiniowane pasma o odpowiednim rozmiarze. W przypadku oceny wpływu związków na test reporterowy, należy dozować związki rozpuszczone w nośniku do studzienek 96-dołkowej płytki.Aby przygotować mieszankę transfekcyjną na 96-dołkową płytkę, rozcieńczyć plazmid kontrolny Firefly i dwuniciowy substrat reporterowy do naprawy pęknięć NanoLuc w 500 mikrolitrach buforu transfekcyjnego w 1,5-mililitrowej probówce. Po dodaniu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów, mieszaninę DNA należy krótko zwirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby pobrać komórki, poddaj je trypsynizacji i ponownie zawieś w świeżej pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS.Następnie określ liczbę komórek i ponownie zawieś trzy razy 10 do mocy sześciu komórek w 8,5 mililitra podłoża z FBS w świeżej 15-mililitrowej probówce. Dodaj mieszankę transfekcji DNA do zawiesiny komórkowej i kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać. Umieść 80 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na studzience i inkubuj 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.Przygotować kontrolną lucyferazy i odczynnik reporterowy lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać substrat do odpowiedniej objętości buforu do oznaczania w stosunku 1:100 i wymieszać. Gdy płytka i odczynniki osiągną temperaturę pokojową, dodaj 80 mikrolitrów kontrolnego odczynnika lucyferazy świetlików na studzienkę.Potrząsaj płytką przez trzy minuty na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obrotów na minutę. Umieść płytkę w czytniku płytek luminescencyjnych i zmierz kontrolny sygnał luminescencji lucyferazy. Aby zmierzyć sygnał lucyferazy reporterowej, dodaj 80 mikrolitrów odczynnika reporterowego lucyferazy NanoLuc na studzienkę.Po trzyminutowej inkubacji w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obrotów na minutę, pozostaw płytkę do odpoczynku w temperaturze pokojowej na siedem minut. Na koniec zmierz sygnał luminescencji lucyferazy reporterowej w czytniku płytek luminescencyjnych. Ocena sygnału luminescencji komponentu NanoLuc i Firefly wykazała, że zaobserwowana wada naprawcza była spowodowana redukcją sygnału NanoLuc, podczas gdy sygnał sterujący Firefly był niezakłócony.

assessment-dna-double-strand-break-repair-activity-using-high

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Ten protokół przedstawia nowy system genów reporterowych i eksperymentalne ustawienie do wykrywania transkrypcji przy pęknięciach dwuniciowych DNA z czułością pojedynczej cząsteczki.

Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

Implementacja ortotopowego modelu raka nerkowokomórkowego u myszy immunokompetentnych daje badaczowi klinicznie istotny system zdefiniowany przez obecność pierwotnego guza nerki i przerzutów do płuc u tego samego zwierzęcia. System ten może być stosowany do przedklinicznego testowania różnych metod leczenia in vivo.

Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Tutaj prezentujemy przedkliniczne badania przesiewowe przeciwnowotworowych kumaryn z wykorzystaniem hodowli 3D i danio pręgowanego.

Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoid, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego

Poznaj metody oceny aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych testów reporterowych opartych na luminescencji. Te narzędzia wspierają odkrywanie leków przeciwnowotworowych.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji (Wideo) | JoVE Journal

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Przeglądaj więcej filmów