Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych
June 13th, 2025
Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego.
Badania te mają na celu opracowanie zmodyfikowanej metody QuEChERS-HPLC do ilościowego oznaczania WWA w zarodkach zebry zebry narażonych na EOM, wypełniając obecną lukę spowodowaną wyzwaniami technicznymi w pomiarze wewnętrznych poziomów WWA ze względu na wielkość masy zarodków i złożoność ich macierzy biologicznej. Uzyskanie wiarygodnych wyników wymaga 200 zarodków na grupę, co stanowi praktyczne wyzwanie. Połączenie HPLC z detektorem fluorescencji może jeszcze bardziej zwiększyć czułość tej metody. W porównaniu z innymi technikami, ta zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC znacznie skraca czas oczekiwania próbki i zapewnia szybkie i skuteczne podejście do analizy poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego narażonych na EOM.
[Narrator] Na początek przygotuj próbkę QuEChERS, wyjmując szalki zawierające zarodki z inkubatora po 72 godzinach od zapłodnienia. Umyj zarodki trzy razy czystą wodą. Przenieś zarodki do 1,5-mililitrowych probówek i usuń nadmiar wody. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 30 minut, aby liofilizować zarodki. Po liofilizacji zmiel zarodki za pomocą szklanej pałeczki. Dodaj 25 mikrolitrów 16 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych lub WWA, wymieszaj roztwór wzorcowy do grupy kontrolnej DMSO, aby przetestować odzyskiwanie skoków. Następnie dodaj jeden mililitr n-heksanu i wiruj przez 30 sekund. Ultradźwiękowo mieszaninę w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 30 minut. Teraz odwiruj próbkę o masie 7,000 g przez pięć minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki. Zebrane supernatanty odparować do sucha pod przepływem azotu w łaźni wodnej o temperaturze 35 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr acetonitrylu i wiruj przez 30 sekund. Dodaj 10 miligramów pierwszorzędowej aminy drugorzędowej, 45 miligramów siarczanu magnezu i 15 miligramów C18 do próbki, a następnie wiruj przez 30 sekund. Odwirować przy 7 000 g przez pięć minut i przenieść supernatant do świeżej probówki. Odparować supernatant do 0,5 mililitra pod azotem i przefiltrować próbkę przez mikroporowatą membranę o średnicy 0,22 mikrometra. Przygotuj serię roztworów roboczych w zakresie od jednego do 500 nanogramów na mililitr dla wzorca 16 WWA przy użyciu acetonitrylu. Wstrzyknąć 20 mikrolitrów roztworów próbek do chromatografu cieczowego przy użyciu fazy acetonitrylowej lub wodno-ruchomej i postępować zgodnie z procedurą elucji pokazaną na ekranie. Wykreślić krzywą wzorcową ze stężeniami masowymi wzorcowych roztworów roboczych na osi x i odpowiadającymi im obszarami pików na osi y, obejmującymi zakres od pięciu nanogramów na mililitr do 500 nanogramów na mililitr. Wstrzyknąć oczyszczoną próbkę do chromatografu cieczowego wyposażonego w detektor fluorescencyjny (FLD) i detektor diodowy (DAD). Zidentyfikuj obecność WWA, porównując czasy retencji. Zmierz obszary pików, aby określić stężenie. Na koniec należy obliczyć wewnętrzne stężenia 16 WWA na podstawie zmierzonych stężeń masowych. Stężenia wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) w zarodkach danio pręgowanego w ciągu 72 godzin po zapłodnieniu podano w poniższej tabeli. Sześć WWA udało się wykryć w ekstrahowalnej materii organicznej (EOM) w embrionach danio pręgowanego. Natomiast w próbkach kontrolnych DSMO zidentyfikowano tylko dwa WWA, na poziomach znacznie niższych niż w próbkach EOM.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do ilościowego określania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) w zarodkach danio pręgowanego. Metoda radzi sobie z wyzwaniami związanymi z pomiarem wewnętrznych poziomów WWA z powodu małej wielkości i złożonej macierzy biologicznej zarodków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Toksykologia środowiskowa
- Chemia analityczna
- Biologia rozwoju
Tło
- Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) są zanieczyszczeniami środowiskowymi.
- Zarodki danio pręgowanego służą jako model do badania rozwojowych efektów toksyn.
- Pomiar poziomów WWA w małych próbkach biologicznych stwarza trudności techniczne.
- Istniejące metody mogą nie zapewniać wystarczającej wrażliwości potrzebnej do dokładnego ilościowego określenia.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody ilościowego określania WWA w zarodkach danio pręgowanego.
- Poprawa wrażliwości i zmniejszenie czasu przetwarzania próbek w porównaniu do istniejących technik.
- Ułatwienie analizy ekspozycji na WWA w badaniach rozwojowych.
Stosowane metody
- Zmodyfikowana metoda ekstrakcji QuEChERS w połączeniu z HPLC.
- Zastosowanie detektora fluorescencji w celu zwiększenia wrażliwości.
- Przygotowanie zarodków i liofilizacja przed analizą.
- Generowanie krzywej standardowej do ilościowego określania WWA.
Główne wyniki
- Wykryto sześć WWA w zarodkach danio pręgowanego eksponowanych na ekstrahowalną materię organiczną (EOM).
- Tylko dwa WWA zidentyfikowano w próbkach kontrolnych DMSO.
- Zmodyfikowana metoda znacznie skróciła czas przetwarzania próbek.
- Niezawodne ilościowe określenie WWA zostało osiągnięte za pomocą nowej metody.
Wnioski
- Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC jest skuteczna w analizie WWA w zarodkach danio pręgowanego.
- To podejście radzi sobie z poprzednimi ograniczeniami technicznymi w pomiarze WWA.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia wpływu zanieczyszczeń środowiskowych na rozwój.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative detection of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in small, complex biological matrices is a critical challenge in early toxicology and environmental risk assessment workflows. The modified QuEChERS-HPLC method enables sensitive, reproducible measurement of internal PAH levels in zebrafish embryos, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in developmental toxicity studies. This capability strengthens translational continuity from environmental exposure models to preclinical safety evaluation in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of toxicant-induced developmental pathways using quantitative PAH measurements.
- Supports biological de-risking by clarifying internal exposure-response relationships in model systems.
- Facilitates predictive confidence in linking environmental exposures to mechanistic outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides validated sample preparation and detection workflows for high-throughput toxicant screening.
- Delivers standardized, quantitative outputs for cross-condition comparison and assay reproducibility.
- Enables reliable evaluation of compound effects on PAH uptake and metabolism in embryos.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for assessing developmental toxicity of environmental contaminants.
- Supports continuity from discovery-stage exposure models to preclinical safety assessment.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by quantifying internal toxicant burden.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust quantification of PAHs in zebrafish embryos, informing both mechanistic studies and translational toxicology workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on toxicant mechanisms and pathway involvement.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers sensitive detection and statistical comparison of PAH levels across experimental groups.
- Translational Research: Bridges environmental exposure models to preclinical safety endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for repeated use in toxicology and exposure studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental toxicity studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in PAH quantification workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage based on quantitative exposure data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of compounds with favorable safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sample preparation, HPLC operation, and analytical chemistry.
- Needs access to HPLC systems with fluorescence and diode array detectors.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Adaptation may be needed for different model organisms or biological matrices.
- Sample throughput is limited by the requirement for large embryo numbers per group.
