Name: Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach Danio rerio. To podejście poprawia czułość analizy i skraca czas przetwarzania próbek w badaniach toksykologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (numer grantu: 81972999) oraz Suzhou Science and Technology Development Plan (Podstawowe Badania nad Zastosowaniami Medycznymi, SKY2023036 i SKY2023115).

1. Przykładowe traktowanie
<ol>
	<li>Kolekcja PM2.5 
	<ol>
		<li>Zbieraj PM2,5 na filtrach z membraną kwarcową 47 mm. 
		UWAGA: PM2,5 został zebrany w miejskim Suzhou w Chinach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja EOM
	<ol>
		<li>Pokrój filtr na kawałki i umieść w stożkowej szklanej kolbie ze 150 ml acetonitrylu.</li>
		<li>Ultradźwięki podsycić kolbę w temperaturze 35 °C przez 1 godzinę i przenieść ekstrakt do czterech probówek o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować przy 7 000 × g przez 20 minut, następnie przenieść supernatant do wyparki obrotowej i zagęścić go do około 5 ml.</li>
		<li>Odparować do sucha pod przepływem azotu w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C i rozpuścić pozostałość w dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie zarodków danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Utrzymuj danio pręgowanego w systemie recyrkulacyjnym w 14-godzinnym cyklu światła i 10-godzinnym ciemnym cyklu w temperaturze 28 °C16.</li>
		<li>Zebrać zapłodnione jaja (200 zarodków w grupie) i przenieść je na szklane szalki Petriego (szkło sodowo-wapniowe, 80 x 15 mm) z 30 ml wody z systemu recyrkulacyjnego.</li>
		<li>Dodać 30 μl EOM (10 mg/ml) do szklanej szalki Petriego zawierającej 200 zarodków w 2 godziny po zapłodnieniu (hpf). Nieleczone grupy służą jako ślepe kontrole. 
		UWAGA: Końcowe stężenie EOM wynosi 10 mg/l, w oparciu o wskaźnik wad rozwojowych serca (rysunek uzupełniający S1).</li>
		<li>Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 28 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki QuEChERS
<ol>
	<li>Wyjąć z inkubatora szalki z zarodkami w temperaturze 72 hpf. Umyj zarodki 3x czystą wodą.</li>
	<li>Przenieś zarodki do probówek o pojemności 1,5 ml (w zależności od grupy) i usuń nadmiar wody.</li>
	<li>Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 30 minut, aby liofilizować embyros17 i liofilizować je. Następnie zmiel zarodki za pomocą szklanej pałeczki.</li>
	<li>Dodaj 25 μl 16 zmieszanego roztworu wzorcowego WWA (2,0 μg / ml) do grupy kontrolnej DMSO, aby przetestować odzyskiwanie szczytów.</li>
	<li>Dodać 1 ml n-heksanu i wirować przez 30 s, a następnie ultradźwięki w temperaturze 35 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować przy 7 000 × g przez 5 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.5 i 2.6.</li>
	<li>Odparować zebrane supernatanty do sucha pod przepływem azotu w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C.</li>
	<li>Dodaj 1 ml acetonitrylu i wiruj przez 30 s.</li>
	<li>Dodaj 10 mg pierwszorzędowej aminy drugorzędowej (PSA), 45 mg siarczanu magnezu i 15 mg szczeliwa C18, a następnie wiruj przez 30 sekund.</li>
	<li>Odwirować przy 7 000 × g przez 5 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.9 i odwirować przy 7 000 × g przez 5 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki.</li>
	<li>Odparować supernatant do 0,5 ml w azocie.</li>
	<li>Przefiltruj przez mikroporowatą membranę 0,22 μm.</li>
</ol>
3. Oznaczanie WWA za pomocą HPLC
<ol>
	<li>Przygotować serię roztworów roboczych (w zakresie od 1 do 500 ng/ml) dla 16 WWA zmieszanego z acetonitrylem i wstrzyknąć je do chromatografu cieczowego, używając acetonitrylu i wody jako fazy ruchomej.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 20 μl i zastosować następującą procedurę elucji: 0-18,5 min, 40% acetonitrylu do 100% acetonitrylu; 18,5-28 min, 100% acetonitrylu; 28-29,5 min, 100% do 40% acetonitrylu; czas zatrzymania: 32 min; temperatura kolumny: 25 °C; natężenie przepływu: 1,8 ml/min. Wykreślić krzywą wzorcową ze stężeniami masowymi wzorcowych roztworów roboczych na osi x i odpowiadającymi im obszarami pików na osi y, obejmujący zakres od 5 ng/ml do 500 ng/ml. 
		UWAGA: Długości fal wzbudzenia/emisji WWA można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć oczyszczoną próbkę (z kroku 2.14) do chromatografu cieczowego za pomocą detektora fluorescencyjnego (FLD) i detektora diodowego (DAD).</li>
	<li>Zidentyfikuj obecność WWA, porównując czasy retencji i mierząc powiązane obszary pików. 
	UWAGA: Stężenia masowe WWA zostały określone przy użyciu wcześniej wygenerowanej krzywej wzorcowej z kroku 3.1.1.</li>
	<li>Obliczyć wewnętrzne stężenia 16 WWA na podstawie zmierzonych stężeń masowych próbek.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+maternal+exposure+to+ambient+particulate+pollution+with+incident+spontaneous+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicol+Environ+Saf%22%5BJournal%5D)">Association of maternal exposure to ambient particulate pollution with incident spontaneous pregnancy loss.</a> Ecotoxicol Environ Saf. 224, 112653(2021).</li>
<li>Grippo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+exposure+during+pregnancy+and+spontaneous+abortion+and+stillbirth%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Air pollution exposure during pregnancy and spontaneous abortion and stillbirth.</a> Rev Environ Health. 33 (3), 247-264 (2018).</li>
<li>Tanner, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+exposure+to+ambient+benzene+and+pm2.+5+during+pregnancy+and+the+risk+of+selected+birth+defects+in+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Associations between exposure to ambient benzene and pm2. 5 during pregnancy and the risk of selected birth defects in offspring.</a> Environ Res. 142, 345-353 (2015).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+air+pollution+exposure+and+congenital+anomalies%3A+An+updated+systematic+review+and+meta-analysis+of+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Health+Res%22%5BJournal%5D)">Global air pollution exposure and congenital anomalies: An updated systematic review and meta-analysis of epidemiological studies.</a> Int J Environ Health Res. 34 (5), 2333-2352 (2024).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources%2C+transformation%2C+and+health+implications+of+pahs+and+their+nitrated%2C+hydroxylated%2C+and+oxygenated+derivatives+in+PM2.5+in+Beijing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Geophys+Res-Atmos%22%5BJournal%5D)">Sources, transformation, and health implications of pahs and their nitrated, hydroxylated, and oxygenated derivatives in PM2.5 in Beijing.</a> J Geophys Res-Atmos. 120 (14), 7219-7228 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+priority+sources+of+PM2.5-bound+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+by+their+contribution+to+disability+adjusted+life+years%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Determining priority sources of PM2.5-bound polycyclic aromatic hydrocarbons by their contribution to disability adjusted life years.</a> Atmos Environ. 248, 118202(2021).</li>
<li>Carls, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+embryos+are+damaged+by+dissolved+pahs%2C+not+oil+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Fish embryos are damaged by dissolved pahs, not oil particles.</a> Aquat Toxicol. 88 (2), 121-127 (2008).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+of+the+organic+fraction+from+hydraulic+fracturing+flowback+and+produced+waters+to+early+life+stages+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity of the organic fraction from hydraulic fracturing flowback and produced waters to early life stages of zebrafish (Danio rerio).</a> Environ Sci Technol. 52 (6), 3820-3830 (2018).</li>
<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Sci Total Environ. 719, 135097(2020).</li>
<li>Manjunatha, B., Deekshitha, B., Seo, E., Kim, J., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+induced+by+particulate+matter+%28PM2.5%29+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity induced by particulate matter (PM2.5) in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Aquat Toxicol. 238, 105928(2021).</li>
<li>Chen, J., Zhang, M., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PM2.5+induces+cardiac+defects+via+AHR-SIRT1-PGC-1%CE%B1+mediated+mitochondrial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">PM2.5 induces cardiac defects via AHR-SIRT1-PGC-1α mediated mitochondrial damage.</a> Environ Toxicol Pharmacol. 106, 104393(2024).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AHR+and+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AHR and Wnt/β-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355, 31-38 (2016).</li>
<li>González-Curbelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+applications+of+the+QuECHERS+method%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution and applications of the QuECHERS method.</a> TrAC Trends Anal Chem. 71, 169-185 (2015).</li>
<li>Wilkowska, A., Biziuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+pesticide+residues+in+food+matrices+using+the+qQuECHERS+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of pesticide residues in food matrices using the qQuECHERS methodology.</a> Food Chem. 125 (3), 803-812 (2011).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+toxicity+and+bioconcentration+of+pyrimorph+in+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Acute toxicity and bioconcentration of pyrimorph in zebrafish, Brachydanio rerio.</a> Pest Manag Sci. 67 (9), 1178-1183 (2011).</li>
<li>Aleström, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+Housing+and+husbandry+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: Housing and husbandry recommendations.</a> Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Ji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+m6A+RNA+methylation+contributes+to+PM2.5-induced+cardiac+malformations+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hazard+Mater%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae.</a> J Hazard Mater. 457, 131749(2023).</li>
<li>Alegbeleye, O. O., Opeolu, B. O., Jackson, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycyclic+aromatic+hydrocarbons%3A+A+critical+review+of+environmental+occurrence+and+bioremediation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Manage%22%5BJournal%5D)">Polycyclic aromatic hydrocarbons: A critical review of environmental occurrence and bioremediation.</a> Environ Manage. 60 (4), 758-783 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Zarodki danio pręgowanego są potężnym modelem kręgowców do badań toksyczności rozwojowej, ale ich niewielki rozmiar komplikuje wykrywanie półlotnych związków organicznych (SVOC), takich jak WWA. Podczas przygotowywania próbek kluczowe znaczenie ma zapobieganie zanieczyszczeniu zarodków danio pręgowanego. Właściwe czyszczenie próbek jest kluczowym krokiem w celu uniknięcia przenoszenia związków z pożywki ekspozycyjnej do ekstraktu próbki. Niepełne mycie może prowadzić do przeszacowania, podczas gdy nadmierne mycie może po...

Drobny pył zawieszony (PM2.5), o średnicy aerodynamicznej 2.5 μm lub mniejszej. jest głównym czynnikiem ryzyka środowiskowego. Ze względu na swoje niewielkie rozmiary PM2,5 jest w stanie przedostać się do układu krążenia i przeniknąć przez barierę matczyno-płodową. Badania epidemiologiczne powiązały narażenie matki na PM2,5 ze spontanicznym poronieniem i różnymi chorobami wrodzonymi1,2,3,4. Jednak mechanizmy leżące u podstaw embrionalnej toksyczności PM2,5 nie są dobrze poznane. WWA, główny toksyczny składnik PM2,5, są wysoce toksyczne dla ludzi ze względu na swoje właściwości mutagenne i rakotwórcze5,6. Spośród setek WWA, 16 zostało sklasyfikowanych jako zanieczyszczenia o wysokim priorytecie przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska (EPA).
Danio rerio, jest potężnym modelowym organizmem kręgowców ze względu na swoje genetyczne podobieństwo do ludzi, szybki rozwój, wysoki wskaźnik reprodukcji i łatwość utrzymania. Przezroczystość zarodków danio pręgowanego pozwala na bezpośrednią obserwację całego ciała pod mikroskopem, umożliwiając szczegółowe badania. Rozpuszczone WWA mogą przenikać do zarodków danio pręgowanego poprzez dyfuzję7. W wielu badaniach wykorzystano zarodki danio pręgowanego do zbadania toksycznych skutków i mechanizmów ekstrahowalnej materii organicznej (EOM) z PM2.58,9,10,11. Jednak większość z tych badań scharakteryzowała tylko 16 priorytetowych WWA w EOM, bez wykrycia wewnętrznych poziomów WWA w zarodkach danio pręgowanego12. Wyzwanie to może wynikać z niewielkich rozmiarów zarodków danio pręgowanego i złożoności macierzy embrionalnej.
Metoda Szybkiej, Łatwej, Taniej, Skutecznej, Wytrzymałej i Bezpiecznej (QuEChERS) jest innowacyjną techniką przygotowania próbek używaną do analizy pozostałości pestycydów, leków weterynaryjnych i innych zanieczyszczeń w próbkach żywności i środowiska13,14. W połączeniu z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC), metoda ta została wykorzystana do wykrycia pestycydów u danio pręgowanego15. WWA, które zawierają dwa lub więcej pierścieni benzenowych, mają silne właściwości fluorescencyjne, dzięki czemu szczególnie nadają się do wykrywania za pomocą detektorów fluorescencyjnych. W tym badaniu opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego narażonych na EOM.

<table><tbody><tr><td>16 Mieszanina WWA roztwory wzorcowe&nbsp;</td><td>o2si Smart Solutions (Karolina Południowa, USA)</td><td>110124-06</td><td>16 Mieszane roztwory wzorcowe WWA&nbsp; obejmuje naftalen (Nap), acenaftylen (Acy), ace-naften (Ace), fluoren (Flo), fenantren (Phe), antracen (Ant), fluoranten (grypa), piren (Pyr), benzo [a] antracen (BaA), chryzen(Chr), benzo [b] fluoranten (BbF), benzo [k] fluoranten (BkF),benzo [a] piren (BaP), inden [1,2,3-cd] piren (IcdP), dibenz [a, h]antracen (DahA), benzo [g,h,i] perylen (BghiP).</td></tr><tr><td>1260 Infinity II LC System</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, Stany Zjednoczone)</td><td></td><td>FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Scharlab (Barcelona,Hiszpania)</td><td>AC03661000</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>CNWBOND HC-C18 SPE&nbsp;</td><td>ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Szanghaj, CHINY)</td> <td>Szczeliwo SBEQ-CA0801</td><td>C18 to szczeliwo z odwróconymi fazami o dobrej równowadze między hydrofilowym i hydrofobowym, które może dobrze adsorbować i oddzielać polarne i niepolarne związki organiczne</td></tr>.<tr><td>Ziemia okrzemkowa</td><td>Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)</td><td>12214013</td><td>Do separacji, oczyszczania i usuwania zanieczyszczeń organicznych&zwnj;</td></tr><tr><td>Dyspersyjny SPE 15 mL, EN</td><td>Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)</td><td>5982-5056</td><td>Filtr do oczyszczania próbek</td></tr><tr><td></td><td>ANPEL Laboratory Technologies (Szanghaj) Inc. (Szanghaj, CHINY)</td> <td>SCAA-104</td><td>Filtr igłowy fazy organicznej (nylon), 0,22 i mikro; m</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Scharlab (Barcelona, Hiszpania)</td><td>HE02481000</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Millipore</td><td>Merck (New Jersey, USA)</td><td></td><td>Przygotuj ultraczystą wodę</td></tr><tr><td>Organomation - N-EVAP Nitrogen Evaporators</td><td>Organomation (Massachusetts, USA)</td><td></td><td>Rozpuszczalniki do odparowywania</td></tr><tr><td>Sorvall ST4 Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA)</td><td></td><td>wirowanie</td></tr><tr><td>&nbsp; Vortex- Genie 2 (G560E)</td><td>Scientific Industries (Nowy Jork, USA)</td><td></td><td>Vortex</td></tr><tr><td>ZORBAX Eclipse PAH</td><td>Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)</td><td>959990-918</td><td>Ta kolumna jest powszechnie stosowana w systemach HPLC w celu uzyskania precyzyjnej i wiarygodnej analizy WWA.</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowana metoda quechers-hplc do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych

A Modified QuEChERS-HPLC Method for Detection of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Zebrafish Embryos Exposed to Fine Particulate Matter

Narażenie matki na drobny pył zawieszony (PM2.5), o średnicy aerodynamicznej 2.5 μm lub mniejszej, zostało powiązane z samoistnym poronieniem i różnymi chorobami wrodzonymi u ludzi. Mechanizmy leżące u podstaw tej przyczyny pozostają jednak niejasne. Zarodki danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania toksyczności rozwojowej PM2,5, ale pomiar wewnętrznych poziomów wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA), głównych toksycznych składników PM2,5, stanowi wyzwanie. W tym badaniu opracowaliśmy szybką, łatwą, tanią, skuteczną, wytrzymałą i bezpieczną metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (QuEChERS-HPLC) do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA wymienionych na liście priorytetowych zanieczyszczeń amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (EPA). Zarodki danio pręgowanego traktowano ekstrahowalną materią organiczną (EOM) z PM2,5 przez 2-72 godziny po zapłodnieniu (hpf). Do przygotowania próbek wykorzystano metodę QuEChERS, a do analiz jakościowych i ilościowych WWA wykorzystano HPLC-FLD/DAD (HPLC z detektorem fluorescencyjnym i detektorem diodowym). Udało nam się wykryć sześć WWA (fenantren, antracen, fluoren, acenaften, fluoranten i piren) w zarodkach danio pręgowanego narażonych na PM2,5. Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania mechanizmów toksyczności rozwojowej indukowanej przez PM2,5.

Cała procedura ekspozycji na EOM, przygotowania próbek i detekcji PAH została przedstawiona na Rysunku 1. W przypadku HPLC-FLU/DAD za akceptowalny uznano stosunek sygnału do szumu wynoszący 3:1, przy zakresie detekcji od 0,3 do 5,0 ng/mL. Granice wykrywalności metody mieściły się w przedziale od 3,0 × 10-4 do 5,0 × 10-3 ng/organizm. Wszystkie krzywe kalibracyjne wykazały wysoką liniowość (r2 &gt; 0,999). Wartości precyzji określone przy użyciu ekstraktów uzys...

Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego.

Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych

Maternal exposure to fine particulate matter (PM2.5), with an aerodynamic diameter of 2.5 &#181;m or less, has been linked to spontaneous abortion and ...

Badania te mają na celu opracowanie zmodyfikowanej metody QuEChERS-HPLC do ilościowego oznaczania WWA w zarodkach zebry zebry narażonych na EOM, wypełniając obecną lukę spowodowaną wyzwaniami technicznymi w pomiarze wewnętrznych poziomów WWA ze względu na wielkość masy zarodków i złożoność ich macierzy biologicznej. Uzyskanie wiarygodnych wyników wymaga 200 zarodków na grupę, co stanowi praktyczne wyzwanie. Połączenie HPLC z detektorem fluorescencji może jeszcze bardziej zwiększyć czułość tej metody. W porównaniu z innymi technikami, ta zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC znacznie skraca czas oczekiwania próbki i zapewnia szybkie i skuteczne podejście do analizy poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego narażonych na EOM.[Narrator] Na początek przygotuj próbkę QuEChERS, wyjmując szalki zawierające zarodki z inkubatora po 72 godzinach od zapłodnienia. Umyj zarodki trzy razy czystą wodą. Przenieś zarodki do 1,5-mililitrowych probówek i usuń nadmiar wody. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 30 minut, aby liofilizować zarodki. Po liofilizacji zmiel zarodki za pomocą szklanej pałeczki. Dodaj 25 mikrolitrów 16 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych lub WWA, wymieszaj roztwór wzorcowy do grupy kontrolnej DMSO, aby przetestować odzyskiwanie skoków. Następnie dodaj jeden mililitr n-heksanu i wiruj przez 30 sekund. Ultradźwiękowo mieszaninę w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 30 minut. Teraz odwiruj próbkę o masie 7,000 g przez pięć minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki. Zebrane supernatanty odparować do sucha pod przepływem azotu w łaźni wodnej o temperaturze 35 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr acetonitrylu i wiruj przez 30 sekund. Dodaj 10 miligramów pierwszorzędowej aminy drugorzędowej, 45 miligramów siarczanu magnezu i 15 miligramów C18 do próbki, a następnie wiruj przez 30 sekund. Odwirować przy 7 000 g przez pięć minut i przenieść supernatant do świeżej probówki. Odparować supernatant do 0,5 mililitra pod azotem i przefiltrować próbkę przez mikroporowatą membranę o średnicy 0,22 mikrometra. Przygotuj serię roztworów roboczych w zakresie od jednego do 500 nanogramów na mililitr dla wzorca 16 WWA przy użyciu acetonitrylu. Wstrzyknąć 20 mikrolitrów roztworów próbek do chromatografu cieczowego przy użyciu fazy acetonitrylowej lub wodno-ruchomej i postępować zgodnie z procedurą elucji pokazaną na ekranie. Wykreślić krzywą wzorcową ze stężeniami masowymi wzorcowych roztworów roboczych na osi x i odpowiadającymi im obszarami pików na osi y, obejmującymi zakres od pięciu nanogramów na mililitr do 500 nanogramów na mililitr. Wstrzyknąć oczyszczoną próbkę do chromatografu cieczowego wyposażonego w detektor fluorescencyjny (FLD) i detektor diodowy (DAD). Zidentyfikuj obecność WWA, porównując czasy retencji. Zmierz obszary pików, aby określić stężenie. Na koniec należy obliczyć wewnętrzne stężenia 16 WWA na podstawie zmierzonych stężeń masowych. Stężenia wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) w zarodkach danio pręgowanego w ciągu 72 godzin po zapłodnieniu podano w poniższej tabeli. Sześć WWA udało się wykryć w ekstrahowalnej materii organicznej (EOM) w embrionach danio pręgowanego. Natomiast w próbkach kontrolnych DSMO zidentyfikowano tylko dwa WWA, na poziomach znacznie niższych niż w próbkach EOM.

a-modified-quechers-hplc-method-for-detection-polycyclic-aromatic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje użycie chromatografii gazowej w przestrzeni czołowej do określenia stężenia etanolu w zarodkach ryb danio pręgowanych. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do jakościowej i ilościowej analizy lotnych związków organicznych.

Chromatografia gazowa w przestrzeni nadpowierzchniowej: technika oceny stężenia etanolu w zarodkach danio pręgowanego

Ten film demonstruje bardzo czuły test oparty na immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń oksydacyjnych wywołanych PM2.5 w sercach zarodków danio pręgowanego poprzez pomiar poziomów 8-OHdG i γH2AX, które wskazują odpowiednio na uszkodzenie DNA i pęknięcia dwuniciowego DNA.

Test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA za pośrednictwem PM2,5 w zarodkach ryb

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Narażenie na teratogeny może powodować wady wrodzone. Danio pręgowany jest przydatny do określania potencjału teratogennego chemikaliów. Wykazujemy użyteczność danio pręgowanego, wystawiając zarodki na działanie różnych poziomów azotynów, a także w różnych momentach ekspozycji. Pokazujemy, że azotyny mogą być toksyczne i powodować poważne wady rozwojowe.

Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu modelu larw danio pręgowanego, w tym procesu ekspozycji i testów wskaźników neurobehawioralnych.

Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych PM2.5 w wypreparowanych sercach zarodków danio pręgowanego.

Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego

Zarodki/larwy danio pręgowanego rozwijają się zewnętrznie i są optycznie przezroczyste. Bioakumulację mikrodrobin plastiku u ryb we wczesnych stadiach życia można łatwo ocenić za pomocą znakowanych fluorescencyjnie mikrogranulek.

Akumulacja i dystrybucja fluorescencyjnych mikrodrobin plastiku we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego

Zwiększona częstotliwość analiz farmakologicznych i toksykokinetycznych metali i związków na bazie metali u danio pręgowanego może być korzystna dla środowiskowych i klinicznych badań tłumaczeniowych. Ograniczenie związane z nieznaną ekspozycją na wodę zostało przezwyciężone poprzez przeprowadzenie analizy metali śladowych na strawionej tkance danio pręgowanego przy użyciu spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie.

Absorpcja dawki ekspozycji na związki na bazie platyny i rutenu u danio pręgowanego za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie o szerszych zastosowaniach

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach Danio rerio. To podejście poprawia czułość analizy i skraca czas przetwarzania próbek w badaniach toksykologicznych.

Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych (Wideo) | JoVE Journal

Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych

Przeglądaj więcej filmów