Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości
13 czerwca 2025
Opisujemy protokół wysokoprzepustowej metody klonowania, klonowania wahadłowego opartego na CRISPR (klonowanie wahadłowe CRISPR), który umożliwia transfer interesujących fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR.
Opisujemy nasz protokół dla metody klonowania o wysokiej przepustowości, CRISPRshuttle. Polega ona na przenoszeniu docelowych fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR. Istniejące techniki, takie jak infuzja bramy i klonowanie jednowektorowe, amplifikacja PCR. Takie podejście wymaga procedur specyficznych dla fragmentacji, w tym podstawowego projektu i walidacji wydzielania. Te tagi są pracochłonne i czasochłonne. Wahadłowiec CRISPR eliminuje PCR, jednocześnie przenosząc docelowe fragmenty DNA między wektorami do sekwencyjnych reakcji w probówkach. Metoda ta wykracza poza konieczność obchodzenia się z konkretnymi fragmentami, a tym samym przyspiesza konstruowanie próbek.
[Narrator] Na początek przygotuj mieszankę wzorcową dla określonej liczby reakcji trawienia, łącząc odczynniki pokazane na ekranie. Ułóż odpowiednio oznakowane rurki o pojemności 0,2 mililitra w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie. Przygotować mieszaninę wzorcową dla liczby N reakcji, mieszając odpowiednie ilości buforu CAS9 sgRNA 10 CAS9 i wody uzdatnionej DEPC. Dokładnie wymieszaj mieszankę główną i odkręć ją. Podwielokrotność 3,75 mikrolitra wzorca wymieszać do każdej probówki reakcyjnej. Dodaj 0,75 mikrolitra 0,03 mikromolowego plazmidu PLX 304 ORF do każdej dokładnie wymieszanej probówki i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Przygotuj mieszankę główną, łącząc 0,14 mikrolitra 3,36 mikromolowego zlinearyzowanego pBIDC-UASC-pLXvect i 1,8 mikrolitra głównej mieszanki montażowej Gibsona. Dokładnie wymieszaj mieszankę główną i odkręć ją. Teraz podaczuj 1,94 mikrolitra wzorca do każdej probówki. Dodaj 1,66 mikrolitra rozszczepionego plazmidu CAS9 do każdej probówki. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Rozmrozić kompetentne komórki bakteryjne na lodzie. Porcję 10 mikrolitrów rozmrożonych komórek do każdej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Delikatnie wymieszaj 10 mikrolitrów właściwych ogniw z jednym mikrolitrem produktu montażowego Gibsona. Umieść probówki na lodzie na 30 minut. Szok termiczny probówek w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie schładzanie na lodzie przez dwie minuty. Dodaj 100 mikrolitrów podgrzanej pożywki SOC do każdej probówki i wstrząsaj z prędkością 250 obr./min przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec umieść komórki na płytkach agarowych LB zawierających 15 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na rysunku przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy restrykcyjnej plazmidów UAS-cDNA/ORF wygenerowanych za pomocą systemu CRISPRshuttle. W tej analizie trawienie restrykcyjne 15 konstruktów UAS-cDNA/ORF z PVU2 wykazało, że wszystkie próbki wykazywały oczekiwane wzorce fragmentów w około 1072 parach zasad i 1820 parach zasad.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wysokoprzepustowej metody klonowania znanej jako klonowanie wahadłowcowe oparte na systemie CRISPR (klonowanie CRISPRshuttle). Ta innowacyjna technika umożliwia przenoszenie fragmentów DNA między wektorami bez konieczności przeprowadzania amplifikacji PCR.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria genetyczna
- Biologia molekularna
- Technologia CRISPR
Wstęp
- Tradycyjne metody klonowania często wymagają amplifikacji PCR.
- Technologia CRISPR zrewolucjonizowała manipulacje genetyczne.
- Metody wysokoprzepustowe są niezbędne do badań na szeroką skalę.
- Efektywny transfer wektora jest kluczowy dla wielu zastosowań.
Cel badania
- Wprowadzenie nowej metody klonowania.
- Usprawnienie procesu przenoszenia fragmentów DNA.
- Eliminacja konieczności stosowania PCR w procedurach klonowania.
Zastosowane metody
- Opracowanie protokołu klonowania CRISPRshuttle.
- Ocena wydajności transferu DNA.
- Porównanie z tradycyjnymi metodami klonowania.
- Zastosowanie metody w różnych systemach wektorowych.
Główne wyniki
- Skuteczny transfer fragmentów DNA pomiędzy wektorami.
- Znaczna redukcja czasu i zasobów w porównaniu z metodami PCR.
- Wysoka wydajność wykazana w wielu testach.
- Potencjał do szerokiego zastosowania w badaniach genetycznych.
Wnioski
- Klonowanie CRISPRshuttle stanowi praktyczną alternatywę dla metod tradycyjnych.
- Metoda ta zwiększa efektywność w inżynierii genetycznej.
- W przyszłych badaniach technikę tę można wykorzystać do złożonych manipulacji genetycznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowe generowanie genomowych bibliotek plazmidowych jest kluczowym elementem umożliwiającym systematyczne badania funkcji genów oraz walidację celów w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym. Klonowanie wahadłowe oparte na systemie CRISPR (CRISPRshuttle) eliminuje konieczność amplifikacji PCR, usprawniając transfer fragmentów DNA między wektorami i przyspieszając tworzenie bibliotek. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną oraz efektywność operacyjną w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szybkie tworzenie bibliotek plazmidów w skali genomu do badań przesiewowych w genomice funkcjonalnej.
- Wspiera systematyczną analizę funkcji genów w różnych szlakach biologicznych.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka oraz rzetelną walidację celów poprzez umożliwienie wysokoprzepustowego generowania konstruktów.
- Zwiększa pewność predykcyjną przy późniejszym wyborze i selekcji celów.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane konstrukty plazmidowe do skalowalnych procesów przesiewowych bez artefaktów sekwencyjnych indukowanych przez PCR.
- Standaryzuje wyniki klonowania, wspierając powtarzalność oraz rozwój ilościowych analiz assay.
- Przyspiesza przygotowanie do wysokoprzepustowej oceny związków oraz platform fenotypowego przesiewu.
- Umożliwia efektywne ponowne wykorzystanie zasobów plazmidów donacyjnych w wielu formatach analiz.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia generowanie konstrukcji genetycznych istotnych dla przebiegu chorób do rozwoju modeli przedklinicznych.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, umożliwiając szybką iterację konstrukcji.
- Redukuje wąskie gardła techniczne w translacyjnych badaniach nad biomarkerami i mechanizmami.
- Poprawia proces podejmowania decyzji o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez dostarczanie niezawodnych narzędzi genetycznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Klonowanie CRISPRshuttle integruje etap wczesnego odkrywania z identyfikacją wiodących kandydatów, umożliwiając płynne przejście od selekcji genów opartej na hipotezach do wysokoprzepustowego generowania i przesiewania konstruktów.
- Biologia odkrywcza: przyspiesza weryfikację hipotez i mapowanie szlaków poprzez umożliwienie szybkiego, skalowalnego klonowania genów docelowych.
- Przesiewy: dostarcza standaryzowane konstrukty bez udziału PCR, co pozwala na odtwarzalny rozwój testów i kampanie przesiewowe.
- Analityka: zapewnia ilościowe dane dotyczące wydajności klonowania i integralności konstruktów, wspierając podejmowanie decyzji w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: ułatwia generowanie konstruktów dla modeli istotnych dla chorób oraz badań nad biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: ustanawia wielokrotnego użytku, wysokoprzepustową platformę klonowania dla bieżących potrzeb portfela projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wysoką wydajność (>94%) i skalowalność, umożliwiając szybkie tworzenie bibliotek przez niewielkie zespoły.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez przyspieszenie dostępności konstruktów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój zwalidowanych celów i testów.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie technik cięcia za pomocą CRISPR/Cas9 oraz metody Gibson assembly.
- Wymagany jest dostęp do kompatybilnych plazmidów donora oraz wektorów gotowych do stosowania z CRISPRshuttle.
- Konieczne jest stosowanie zestandaryzowanych protokołów w celu zapewnienia powtarzalności między zespołami oraz integralności danych.
- Możliwa jest konieczność adaptacji metody do różnych szkieletów wektorowych lub systemów specyficznych dla danego organizmu.
- Wydajność i przepustowość zależą od jakości odczynników oraz optymalizacji procesu roboczego.
