Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości

Opisujemy nasz protokół dla metody klonowania o wysokiej przepustowości, CRISPRshuttle. Polega ona na przenoszeniu docelowych fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR. Istniejące techniki, takie jak infuzja bramy i klonowanie jednowektorowe, amplifikacja PCR. Takie podejście wymaga procedur specyficznych dla fragmentacji, w tym podstawowego projektu i walidacji wydzielania. Te tagi są pracochłonne i czasochłonne. Wahadłowiec CRISPR eliminuje PCR, jednocześnie przenosząc docelowe fragmenty DNA między wektorami do sekwencyjnych reakcji w probówkach. Metoda ta wykracza poza konieczność obchodzenia się z konkretnymi fragmentami, a tym samym przyspiesza konstruowanie próbek.

[Narrator] Na początek przygotuj mieszankę wzorcową dla określonej liczby reakcji trawienia, łącząc odczynniki pokazane na ekranie. Ułóż odpowiednio oznakowane rurki o pojemności 0,2 mililitra w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie. Przygotować mieszaninę wzorcową dla liczby N reakcji, mieszając odpowiednie ilości buforu CAS9 sgRNA 10 CAS9 i wody uzdatnionej DEPC. Dokładnie wymieszaj mieszankę główną i odkręć ją. Podwielokrotność 3,75 mikrolitra wzorca wymieszać do każdej probówki reakcyjnej. Dodaj 0,75 mikrolitra 0,03 mikromolowego plazmidu PLX 304 ORF do każdej dokładnie wymieszanej probówki i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Przygotuj mieszankę główną, łącząc 0,14 mikrolitra 3,36 mikromolowego zlinearyzowanego pBIDC-UASC-pLXvect i 1,8 mikrolitra głównej mieszanki montażowej Gibsona. Dokładnie wymieszaj mieszankę główną i odkręć ją. Teraz podaczuj 1,94 mikrolitra wzorca do każdej probówki. Dodaj 1,66 mikrolitra rozszczepionego plazmidu CAS9 do każdej probówki. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Rozmrozić kompetentne komórki bakteryjne na lodzie. Porcję 10 mikrolitrów rozmrożonych komórek do każdej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Delikatnie wymieszaj 10 mikrolitrów właściwych ogniw z jednym mikrolitrem produktu montażowego Gibsona. Umieść probówki na lodzie na 30 minut. Szok termiczny probówek w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie schładzanie na lodzie przez dwie minuty. Dodaj 100 mikrolitrów podgrzanej pożywki SOC do każdej probówki i wstrząsaj z prędkością 250 obr./min przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec umieść komórki na płytkach agarowych LB zawierających 15 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na rysunku przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy restrykcyjnej plazmidów UAS-cDNA/ORF wygenerowanych za pomocą systemu CRISPRshuttle. W tej analizie trawienie restrykcyjne 15 konstruktów UAS-cDNA/ORF z PVU2 wykazało, że wszystkie próbki wykazywały oczekiwane wzorce fragmentów w około 1072 parach zasad i 1820 parach zasad.