Name: Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Poznaj metodę klonowania wahadłowego CRISPR do transferu fragmentów DNA między wektorami bez amplifikacji PCR. Ta technika zwiększa efektywność inżynierii genetycznej i oszczędza zasoby w badaniach molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było wspierane przez grant z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32071135) oraz fundusz startowy z Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China. Jesteśmy wdzięczni prof. Feng Zhangowi za uprzejme dostarczenie plazmidu pX330 oraz dr Xiaohui Cai za pomoc techniczną.

1. Określenie optymalnych miejsc rozszczepienia Cas9/sgRNA flankujących cDNA/ORF
<ol>
	<li>Przygotowanie plazmidów cDNA/ORF<ol>
		<li>Pozyskaj klony cDNA/ORF z repozytoriów publicznych. UWAGA: Ten protokół wykorzystuje klony ORF oparte na wektorach pLX304 z ludzkiej biblioteki ekspresji lentiwirusowej8 o szerokości CCSB.</li>
		<li>Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu do minipreparacji plazmidu i zmierz jego stężenie za pomocą spektrofotometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projektowanie sgRNA<ol>
		<li>Wejdź na stronę internetową CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Wklej obszar 20-100 pz szkieletu wektorowego pLX304 flankujący koniec ORF 3' w polu docelowym.</li>
		<li>Wybierz Drosophila melanogaster jako gatunek i kliknij Znajdź miejsca docelowe. Wybierz kandydatów sgRNA, którzy według prognoz będą mieli wydajność ponad 80%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat sgRNA<ol>
		<li>Zsyntetyzuj starter do przodu (5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′), gdzie (N)20 reprezentuje sekwencję docelową sgRNA, a starter odwrotny sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGTGCCACTT-3′). UWAGA: Zalecane są podkłady oczyszczone przez PAGE.</li>
		<li>Wygeneruj matrycę DNA do transkrypcji sgRNA in vitro (IVT) za pomocą PCR. Przygotować 100 μl reakcji zawierającej po 5 μl matrycy pX330 (plazmid Addgene 42230; 0,1 ng/μL), starter do przodu (10 μM) i starter sgRNA-REV (10 μM); 50 μl 2x wysokiej jakości mieszanki wzorcowej PCR; i 35 μl ultraczystej wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC).</li>
		<li>Amplifikuj w termocyklerze PCR za pomocą następującego programu: 98 °C przez 30 s; 5 cykli w temperaturze 98°C przez 8 s, 52 °C przez 15 s, 72 °C przez 5 s; 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 8 s, 72 °C przez 20 s; 72 °C przez 2 min.</li>
		<li>Rozwiąż produkty PCR na 0,8% żelu agarozowym. Wytnij pasmo ~120 pz i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.</li>
		<li>Przygotować 10 μl reakcji IVT zawierającej 300 ng oczyszczonego fragmentu DNA, 3,33 μl mieszaniny buforowej NTP, 0,67 μl mieszaniny polimerazy T7 RNA i ultraczystą wodę uzdatnioną DEPC. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
		<li>Określić ilościowo nieoczyszczone sgRNA za pomocą spektrofotometrii, rozcieńczyć do 20 ng/μl ultraczystą wodą poddaną działaniu DEPC i zamrozić w temperaturze -80 °C w małych podwielokrotnościach. UWAGA: Leczenie DNazą nie jest konieczne, ponieważ resztkowe DNA nie zakłóca dalszych reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena sgRNA<ol>
		<li>Trawić plazmid cDNA/ORF zawierający szkielet wektora pLX304 za pomocą enzymu restrykcyjnego. Rozpuść powstałe fragmenty DNA za pomocą 0,8% żelu agarozowego. Oczyść substrat DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.</li>
		<li>Przygotuj 5 μl mieszaniny reakcyjnej rozszczepienia Cas9 zawierającej 0,2 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,5 μl 20 ng/μL sgRNA, 0,015 pmol substratu DNA, 0,5 μl 10x buforu Cas9 i ultraczystą wodę poddaną działaniu DEPC. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Rozwiąż produkty łupliwości za pomocą 0,8% żelu agarozowego. Uwzględnij nierozszczepiony substrat DNA jako kontrolę negatywną.</li>
		<li>Wizualizuj wzorce cięcia za pomocą cyfrowego systemu obrazowania i wybierz sgRNA z minimalną resztkową nieszczelną substratem do kolejnych eksperymentów (ryc. 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zamiana genu oporności na antybiotyki wektora docelowego
UWAGA: W tym protokole używamy przykładu zamiany genu oporności na ampicylinę wektora docelowego pBID-UASC z genem oporności na chloramfenikol, generując w ten sposób wektor docelowy zawierający chloramfenikol pBIDC-UASC.
<ol>
	<li>Usuń gen oporności na ampicylinę z pBID-UASC. UWAGA: Gen oporności na ampicylinę pBID-UASC został usunięty przez trawienie Cas9 w połączeniu z dwoma sgRNA, f1Ori5-G4 (sekwencja docelowa: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') i Amp3-G2 (sekwencja docelowa: 5'-GGAACGAAAAACTCACGTTAA-3'), w wyniku czego powstał liniowy szkielet wektorowy pBID-UASC o długości 7,687 pz. Te dwa sgRNA celują odpowiednio w 5' w górę i 3' w dół genu oporności na ampicylinę.<ol>
		<li>Przygotować 10 μl reakcji rozszczepienia zawierającej 0,03 pmol pBID-UASC, 0,25 μL 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 20 ng f1Ori5-G4, 20 ng Amp3-G2, 1 μL 10x Cas9 Buffer i ultraczystą wodę uzdatnioną DEPC. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. UWAGA: Plazmid rozszczepiony przez Cas9, bez oczyszczania, jest bezpośrednio poddawany montażowi Gibsona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR-amplifikacja genu oporności na chloramfenikol. UWAGA: Gen oporności na chloramfenikol o sile 840 pz amplifikowano z plazmidu pMartini-Cam6 metodą PCR przy użyciu f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC GTCGCGTATGTATGATAGGTT-3') i Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') podkłady.<ol>
		<li>Przygotuj gen oporności na chloramfenikol metodą PCR, wzmacniając gen oporności na chloramfenikol o wartości 840 pz. Przygotuj 20 μl reakcji PCR zawierającej 2 μL pMartini-Cam (0,1 ng/μL), 1 μL f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL buforu 5x, 0,4 μL dNTPs (10 mM), 0,4 μL polimerazy DNA o wysokiej wierności (2,5 jednostki/μL), 11,2 μL wody ultraczystej.</li>
		<li>Przeprowadzić PCR w następujących warunkach termocyklingu: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 1 minutę; 5 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 46 °C przez 15 s, 72 °C przez 20 s; 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 20 s; 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 2 min. Przeprowadź reakcję w termocyklerze.</li>
		<li>Rozpuścić produkty rozszczepienia za pomocą 0,8% żelu agarozowego i oczyść fragment DNA o objętości 840 pz za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstaw gen oporności na chloramfenikol do zlinearyzowanego szkieletu wektora pBID-UASC, w wyniku czego powstanie pBIDC-UASC.<ol>
		<li>Przeprowadzić reakcję montażu Gibsona 2 μL: 0,008 pmol genu oporności na chloramfenikol 840 pz, 0,002 pmol zlinearyzowanego pBID-UASC (krok 2.1.1), 1,0 μl 2x mieszanki głównej zespołu Gibsona. Przeprowadzać reakcję w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przekształć 10 μl kompetentnych komórek E. coli w 1 μl produktu reakcji ligacji. Wybrać transformanty na płytce LB uzupełnionej 15 μg/ml chloramfenikolu.</li>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię i poddaj ją późniejszej hodowli bakteryjnej i minipreparacji plazmidu. Zweryfikować wektor docelowy zawierający chloramfenikol pBIDC-UASC za pomocą analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Budowa wektora docelowego kompatybilnego z CRISPRshuttle
UWAGA: Kaseta CRISPRshuttle składa się z około 20-40 sekwencji szkieletowych wektorów pz, które otaczają zarówno końce 5', jak i 3' docelowych fragmentów DNA, z jednym lub dwoma unikalnymi miejscami restrykcyjnymi znajdującymi się między nimi.
<ol>
	<li>Wyżarzanie oligonukleotydów za pomocą termocyklera z następującym programem: 94 °C przez 2 min; 70 cykli po 52 s w temperaturze (95-N) °C, gdzie N oznacza numer cyklu. UWAGA: Wyżarzona kaseta wahadłowa CRISPR zawiera 5'-wysięgi uzupełniające EcoRI i XbaI.</li>
	<li>Zaktualizuj wyżarzoną kasetę CRISPRshuttle do trawionego przez EcoRI/XbaI WEKTORA DOCELOWEGO PBIDC-UASC, aby wygenerować wektor docelowy zgodny z CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect. UWAGA: Ta ligacja eliminuje oryginalne miejsca EcoRI i XbaI w wielu miejscach klonowania, co sprawia, że miejsca EcoRI i XhoI w środku kasety CRISPRshuttle są unikalne w końcowym wektorze. Unikalne miejsca ograniczeń w kasecie CRISPRshuttle umożliwiają linearyzację wektora docelowego kompatybilnego z CRISPRshuttle.<ol>
		<li>Przygotować 5 μl reakcji ligacji zawierającej 14 ng 8,451 bp pBIDC-UASC trawionego przez EcoRI/XbaI, 0,02 pmol wyżarzonej kasety CRISPRshuttle, 0,5 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 0,3 μl ligazy DNA T4. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C.</li>
		<li>Przekształć 10 μl komórek kompetentnych E. coli w 1 μl produktu reakcji ligacji. Wybrać transformanty na płytce LB uzupełnionej 15 μg/ml chloramfenikolu i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię i poddaj ją późniejszej hodowli bakteryjnej i minipreparacji plazmidu. Zweryfikuj wektor docelowy zgodny z CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect poprzez analizę restrykcji i sekwencjonowanie DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Generowanie plazmidów UAS-cDNA/ORF za pomocą CRISPRshuttle
UWAGA: Protokół CRISPRshuttle polega na tym, że dwuetapowe reakcje w probówkach są przeprowadzane równolegle przed transformacją bakteryjną (ryc. 1).
<ol>
	<li>Reakcja w probówce, krok 1<ol>
		<li>Wyciąć ORF z plazmidów pLX304-ORF poprzez rozszczepienie szkieletu wektora za pomocą Cas9 w połączeniu z dwoma sgRNA, pLX304-CMV-G16 (sekwencja docelowa: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', zlokalizowana w szkielecie wektora pLX304 flankującym koniec ORF 5') i pLX304-3'-G1 (sekwencja docelowa: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', zlokalizowana w szkielecie wektora pLX304 flankującym koniec ORF 3').<ol>
			<li>Przygotować mieszankę wzorcową dla danej liczby (N) reakcji trawienia w następujący sposób: (N+1) x 0,4 μL 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,5 μL 80 ng/μL pLX304-CMV-G1, (N+1) x 0,5 μL 80 ng/μL pLX304-3'-G1, (N+1) x 0,4 μL 10x Cas9 Buffer, i (N+1) x 1,45 μl ultraczystej wody uzdatnionej DEPC.</li>
			<li>Dokładnie wymieszaj i odwiruj mieszankę główną. Podwielokrotność 3,75 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Dodaj 0,75 μl plazmidu 0,03 μM pLX304-ORF do każdej probówki. Dokładnie wymieszać i inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. UWAGA: Rozcieńczyć każdy plazmid pLX304-ORF do stężenia 0,03 μM ultraczystą wodą uzdatnioną DEPC. Jeśli stężenie jest mniejsze niż 0,03 μM, dodaj plazmidowe DNA bezpośrednio do reakcji. Plazmidy rozszczepione Cas9 nie muszą być oczyszczane po reakcjach rozszczepienia i mogą być bezpośrednio użyte do późniejszego montażu Gibsona.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja w probówce, krok 2<ol>
		<li>Włóż wycięte ORF do wektora docelowego zgodnego z CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect za pomocą zespołu Gibsona, w wyniku czego utworzą się plazmidy UAS-cDNA/ORF.<ol>
			<li>Digest pBIDC-UASC-pLXvect z EcoRI i XbaI. Oddzielić zlinearyzowany pBIDC-UASC-pLXvect za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oczyścić za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.</li>
			<li>Przygotuj mieszankę wzorcową dla danej liczby (N) reakcji montażu Gibsona w następujący sposób: (N+1) x 0,14 μL 3,36 μM zlinearyzowanego pBIDC-UASC-pLXvect i (N+1) x 1,8 μL mieszanki głównej zespołu Gibsona.</li>
			<li>Dokładnie wymieszaj i odwiruj mieszankę główną. Podwielokrotność 1,94 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Do każdej probówki dodać 1,66 μl plazmidu z rozszczepionym Cas9. Dokładnie wymieszać i inkubować reakcje w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę. UWAGA: Mieszankę wzorcową i probówki należy przechowywać w lodzie przed inkubacją w temperaturze 50 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć E. coli za pomocą produktów montażowych Gibson. UWAGA: Produkty montażu Gibsona nie wymagają oczyszczania przed transformacją E. coli .<ol>
		<li>Rozmrozić kompetentne komórki bakteryjne na lodzie. Porcję 10 μl komórek do każdej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. UWAGA: Zalecane są kompetentne komórki bakteryjne o wydajności przemiany co najmniej 1 × 108 jtk/μg DNA pUC19.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj 10 μl kompetentnych ogniw z 1 μl produktów montażowych Gibsona. Ułóż na lodzie na 30 min.</li>
		<li>Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 1 minutę, a następnie schładzanie na lodzie przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodać 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki SOC (37 °C) do każdej probówki. Wytrząsać z prędkością 250 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umieścić komórki na płytkach LB zawierających 15 μg/ml chloramfenikolu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. UWAGA: Przeprowadzenie tych procedur na dużą skalę zajmuje zazwyczaj kilka godzin. O ile nie zaznaczono inaczej, zarówno odczynniki, jak i zestawy reakcyjne należy przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weryfikacja plazmidów UAS-cDNA/ORF.<ol>
		<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię w 4,5 ml pożywki LB za pomocą 15 μg/ml chloramfenikolu. Wstrząsać z prędkością 250 obr./min przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wyizoluj DNA plazmidu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu.</li>
		<li>Przygotuj 20 μl reakcji trawienia restrykcyjnego dla każdego plazmidu zawierającego 300-500 ng plazmidowego DNA, 0,3 μl PvuII, 2 μl 10x buforu i ultraczystą wodę. Przeprowadzać reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Rozdziel fragmenty DNA za pomocą 0,8% żelu agarozowego. Obraz w świetle UV (rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Kluczowym krokiem w protokole CRISPRshuttle jest przygotowanie linearyzowanych wektorów docelowych kompatybilnych z CRISPRshuttle. Aby zapewnić całkowite trawienie, należy użyć nadmiaru enzymów restrykcyjnych do trawienia wektorów, a zdecydowanie zaleca się oczyszczanie trawionych wektorów w żelu. Kolejnym kluczowym krokiem jest trawienie plazmidów cDNA/ORF za pomocą Cas9. Jeśli budowa plazmidu nie powiedzie się, użyj elektroforezy w żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy przynajmniej częściowe cDNA/ORF zostały uwolnione z ...

Konstruowanie bibliotek plazmidowych całego genomu na podstawie dostępnych zasobów jest podstawą i warunkiem wstępnym zastosowania genomiki funkcjonalnej do analizy procesów biologicznych. Obecne metody klonowania o wysokiej przepustowości, w tym systemy klonowania Gateway, In-Fusion, Creator i Univector, wymagają amplifikacji PCR docelowych fragmentów DNA 1,2,3,4,5. Ten warunek wstępny pociąga za sobą specyficzne dla fragmentów przepływy pracy obejmujące wiele standardowych operacji, w tym między innymi projektowanie starterów oligonukleotydowych, oczyszczanie żelu i walidację sekwencji poprzez sekwencjonowanie. W rezultacie, konstruowanie bibliotek plazmidowych obejmujących cały genom (np. bibliotek nadekspresji cDNA/ORF) stało się pracochłonne i czasochłonne, co utrudnia postęp genomiki funkcjonalnej.
Wcześniej opracowaliśmy CRISPRmass, wysokoprzepustową metodę klonowania zaprojektowaną w celu integracji określonych fragmentów DNA (np. modułu UAS) z wieloma plazmidami o identycznych szkieletach wektorów6. Korzystając z CRISPRmass, skonstruowaliśmy ponad 5500 plazmidów UAS-cDNA/ORF opartych na GAL4/UAS z biblioteki Drosophila cDNA/ORF, Drosophila Genomics Resource center (DGRC) Gold Collection6. Jednak CRISPRmass nie ma możliwości przenoszenia fragmentów DNA między wektorami, co ogranicza jego zastosowanie w klonowaniu o wysokiej przepustowości.
Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy klonowanie wahadłowców oparte na CRISPR (CRISPRshuttle), nowatorską metodę o wysokiej przepustowości, która ułatwia transfer wielu docelowych fragmentów DNA do docelowych wektorów z plazmidów dawcy7. Proces ten wymaga tylko dwóch sekwencyjnych reakcji w probówce, co pozwala obejść wymóg specyficznego dla fragmentów postępowania z dyskretnymi celami DNA7.
Protokół CRISPRshuttle obejmuje dwie sekwencyjne reakcje w probówkach (ryc. 1). Po pierwsze, wspólne sekwencje szkieletu wektorowego plazmidów dawcy są rozszczepiane przez Cas9 / sgRNA w celu uwolnienia docelowych fragmentów DNA. Fragmenty te są następnie przenoszone do kasety CRISPRshuttle wektora kompatybilnego z CRISPRshuttle za pomocą zespołu Gibsona w celu wygenerowania końcowych plazmidów. Kaseta CRISPRshuttle składa się z sekwencji szkieletowej wektora o długości ~20-40 pz, która flankuje końce 5' i 3' fragmentów DNA pochodzących z plazmidów dawcy oraz jedno lub dwa unikalne miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych znajdujące się między tymi sekwencjami flankującymi. Wektor kompatybilny z CRISPRshuttle jest konstruowany przez włożenie kasety CRISPRshuttle do wektora docelowego, który jest następnie linearyzowany przez trawienie miejsc restrykcyjnych w kasecie. Wektor docelowy musi być nosicielem genu oporności na antybiotyki innego niż w plazmidach dawcy; Jeśli gen oporności jest identyczny, przed użyciem musi zostać zastąpiony innym genem.
Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystujący CRISPRshuttle do budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF. Proces ten polega na przeniesieniu ludzkich ORF z biblioteki CCSB-Broad Lentiviral Expression Library do wektora transgenezy Drosophila pBID-UASC 8,9. CRISPRshuttle usprawnia budowę bibliotek plazmidów obejmujących cały genom, ułatwiając w ten sposób badania genomiki funkcjonalnej.

<table><tbody><tr><td>Agar w proszku</td><td>Baza chemiczna</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>Agarozy</td><td>Sangon powiedział:</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany cyfrowy system analizy obrazu żelu</td><td>Tanon</td><td>Tanon-2500B</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sangon powiedział:</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu E.Z.N.A.</td><td>Omega</td><td>Zobacz materiał D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plazmidowe DNA Mini Kit I</td><td>Omega</td><td>Zobacz materiał D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>Czynnik chłodniczy R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Szybki zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności</td><td>NEB</td><td>E2050 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler PCR</td><td>LongGene (Długi Gen)</td><td>Zobacz materiał T20</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Platinum SuperFi II</td><td>Thermo Scientific</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>Czynnik chłodniczy R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Gorący start High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>Zobacz materiał M0494 TGL</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>Język GenScript</td><td>Z03386 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>Zhichu powiedział:</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Shimadzu powiedział:</td><td>Specyfikacja BioSpec-nano</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Preparat Promega</td><td>Zobacz materiał M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 Kompetentna chemicznie komórka</td><td>TransGen (Pokolenie Transpłciowe)</td><td>CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Oxoid (Oxoid)</td><td>Zobacz materiał LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI powiedział:</td><td>NEB</td><td>Czynnik R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Oxoid (Oxoid)</td><td>Zobacz materiał LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

klonowanie wahadłowe oparte na crispr: metoda klonowania o wysokiej przepustowości

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

Opracowanie bibliotek plazmidowych całego genomu przy użyciu istniejących repozytoriów genomowych stanowi kluczowy warunek wstępny dla systematycznej charakterystyki funkcjonalnej genów w różnych procesach biologicznych. Obecne wysokoprzepustowe metodologie transferu fragmentów DNA między wektorami wymagają jednak amplifikacji sekwencji docelowych metodą PCR przed klonowaniem, co sprawia, że generowanie kolekcji plazmidów w skali genomu jest technicznie trudne i czasochłonne. Wykorzystując kasetę CRISPRshuttle, opracowaliśmy nową, wysokoprzepustową metodę klonowania, klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR (klonowanie wahadłowców CRISPR), które ułatwia transfer wielu fragmentów DNA z plazmidów dawcy o identycznych sekwencjach szkieletowych do wektora kompatybilnego z CRISPRshuttle bez amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR. W tym miejscu przedstawiamy protokół dla CRISPRshuttle. Protokół ten obejmuje dwie sekwencyjne reakcje w probówkach przed transformacją bakteryjną. Po pierwsze, docelowe fragmenty DNA są wycinane z plazmidów dawcy przez rozszczepienie za pośrednictwem Cas9 ich wspólnej sekwencji szkieletu wektora. Po drugie, wycięte fragmenty DNA są wprowadzane do linearyzowanych wektorów kompatybilnych z CRISPRshuttle poprzez montaż Gibsona. Nasze wyniki pokazują, że wydajność wahadłowca CRISPRshuttle przekracza 94% i że dwóch badaczy może wygenerować około 300 plazmidów w ciągu 7 dni za pomocą CRISPRshuttle. CRISPRshuttle ułatwia wydajny, elastyczny i opłacalny transfer fragmentów DNA między wektorami, znacznie usprawniając generowanie biblioteki plazmidów w całym genomie.

Wykorzystano system CRISPRshuttle do stworzenia kolekcji plazmidów UAS-cDNA/ORF obejmującej 1397 genów ludzkich, które są konserwowane u Drosophila7. Analiza restrykcyjna wykazała, że CRISPRshuttle osiąga wydajność na poziomie 94,5% w przypadku zastosowania kompatybilnych z CRISPRshuttle wektorów docelowych zawierających dwie sekwencje powtórzone oraz 96,1% w przypadku zastosowania wektorów docelowych bez sekwencji powtórzonych7. Nasze dane wykazały, że zazwyczaj d...

Opisujemy protokół wysokoprzepustowej metody klonowania, klonowania wahadłowego opartego na CRISPR (klonowanie wahadłowe CRISPR), który umożliwia transfer interesujących fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR.

Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

Opisujemy nasz protokół dla metody klonowania o wysokiej przepustowości, CRISPRshuttle. Polega ona na przenoszeniu docelowych fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR. Istniejące techniki, takie jak infuzja bramy i klonowanie jednowektorowe, amplifikacja PCR. Takie podejście wymaga procedur specyficznych dla fragmentacji, w tym podstawowego projektu i walidacji wydzielania. Te tagi są pracochłonne i czasochłonne. Wahadłowiec CRISPR eliminuje PCR, jednocześnie przenosząc docelowe fragmenty DNA między wektorami do sekwencyjnych reakcji w probówkach. Metoda ta wykracza poza konieczność obchodzenia się z konkretnymi fragmentami, a tym samym przyspiesza konstruowanie próbek.[Narrator] Na początek przygotuj mieszankę wzorcową dla określonej liczby reakcji trawienia, łącząc odczynniki pokazane na ekranie. Ułóż odpowiednio oznakowane rurki o pojemności 0,2 mililitra w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie. Przygotować mieszaninę wzorcową dla liczby N reakcji, mieszając odpowiednie ilości buforu CAS9 sgRNA 10 CAS9 i wody uzdatnionej DEPC. Dokładnie wymieszaj mieszankę główną i odkręć ją. Podwielokrotność 3,75 mikrolitra wzorca wymieszać do każdej probówki reakcyjnej. Dodaj 0,75 mikrolitra 0,03 mikromolowego plazmidu PLX 304 ORF do każdej dokładnie wymieszanej probówki i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Przygotuj mieszankę główną, łącząc 0,14 mikrolitra 3,36 mikromolowego zlinearyzowanego pBIDC-UASC-pLXvect i 1,8 mikrolitra głównej mieszanki montażowej Gibsona. Dokładnie wymieszaj mieszankę główną i odkręć ją. Teraz podaczuj 1,94 mikrolitra wzorca do każdej probówki. Dodaj 1,66 mikrolitra rozszczepionego plazmidu CAS9 do każdej probówki. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Rozmrozić kompetentne komórki bakteryjne na lodzie. Porcję 10 mikrolitrów rozmrożonych komórek do każdej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Delikatnie wymieszaj 10 mikrolitrów właściwych ogniw z jednym mikrolitrem produktu montażowego Gibsona. Umieść probówki na lodzie na 30 minut. Szok termiczny probówek w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie schładzanie na lodzie przez dwie minuty. Dodaj 100 mikrolitrów podgrzanej pożywki SOC do każdej probówki i wstrząsaj z prędkością 250 obr./min przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec umieść komórki na płytkach agarowych LB zawierających 15 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na rysunku przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy restrykcyjnej plazmidów UAS-cDNA/ORF wygenerowanych za pomocą systemu CRISPRshuttle. W tej analizie trawienie restrykcyjne 15 konstruktów UAS-cDNA/ORF z PVU2 wykazało, że wszystkie próbki wykazywały oczekiwane wzorce fragmentów w około 1072 parach zasad i 1820 parach zasad.

crispr-based-shuttle-cloning-a-high-throughput-cloning-method

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged.  W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ten protokół opisuje kroki klonowania wielu pojedynczych przewodnikowych RNA do jednego wektora konkategorującego RNA przewodnika, co jest szczególnie przydatne w tworzeniu wielogenowych nokautów przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. Wytwarzanie podwójnych nokautów w organoidach jelitowych przedstawiono jako możliwe zastosowanie tej metody.

Protokół wielokrotnego nokautu genów w organoidach jelita cienkiego myszy przy użyciu konkategomera CRISPR

Tutaj przedstawiono prostą, efektywną i opłacalną metodę klonowania sgRNA.

Przewodnik CRISPR Klonowanie RNA dla systemów ssaków

Ten manuskrypt opisuje metodę opartą na CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) do prostego i szybkiego badania roli wielu genów kandydujących w równoległej proliferacji komórek ostrej białaczki szpikowej (AML). Technika ta jest skalowalna i może być stosowana również w innych liniach komórek nowotworowych.

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Prezentujemy protokół do modułowego montażu opartego na CRISPR (CRISPRmass), metody wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF u Drosophila przy użyciu publicznie dostępnych zasobów cDNA/ORF. CRISPRmass może być stosowany do edycji różnych bibliotek plazmidów.

Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Poznaj metodę klonowania wahadłowego CRISPR do transferu fragmentów DNA między wektorami bez amplifikacji PCR. Ta technika zwiększa efektywność inżynierii genetycznej i oszczędza zasoby w badaniach molekularnych.

Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości

Przeglądaj więcej filmów