Name: Wizualizacja i analiza ilościowa aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej przez genotoksynę w komórkach z wykorzystaniem raportera opartego na białkach fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:48:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy aktywacji PARP1/PARP2 w żywych komórkach ssaków z wykorzystaniem raportera fluorescencyjnego PBD-EGFP. Technika ta umożliwia wizualizację ognisk PAR i badanie dynamiki naprawy DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Specjalne podziękowania dla Marie Migaud (University of South Alabama) za jej ciągłe wsparcie dotyczące dostarczania NRH na przestrzeni lat i za jej fachowe rady. Badania w laboratorium Sobola nad naprawą DNA, analizą uszkodzenia DNA oraz wpływem ekspozycji genotoksycznej & stresu replikacyjnego były wspierane przez granty z NIH [ES029518, ES028949, CA238061, CA236911, AG069740 i ES032522] oraz z NSF [NSF-1841811]. Wsparcie zostało również zapewnione przez Legoretta Cancer Center Endowment Fund (dla R.W.S.).

1. Produkcja lentiwirusu
UWAGA: W tym protokole wykorzystywany jest system pakowania lentiwirusów trzeciej generacji42,43 do wygenerowania komórek ekspresujących genetycznie zakodowanego reportera PAR. Cząstki lentiwirusowe są produkowane w komórkach 293FT za pomocą systemu czterech plazmidów, obejmującego komponenty osłonki, regulacyjne i pakujące, wraz z konstruktem pLV-EF1A-LivePAR-Hygro kodującym domeny WWE z domeną EGFP RNF146, która wiąże łańcuchy poli(ADP-rybozy). Otrzymany wirus jest używany do wygenerowania stabilnych linii komórkowych do wizualizowania i ilościowego określania akumulacji PAR.
<ol>
	<li>Hodowla komórek 293FT o niskiej liczbie przeszczepów w DMEM zawierającym 10% FBS i 1% Pen/Strep w zwilżonej atmosferze w 37 ˚C i 5% CO2. Upewnij się, że komórki 293FT nie były w hodowli dłużej niż 3 tygodnie. 
	UWAGA: Rutynowo używamy komórek 293FT o liczbie przeszczepów od 3 do 10. Komórki 293FT zostały przetransformowane i skutejone przez dużą antygenę T wirusa SV40. Komórki te mają wysoką skuteczność transfekcji, która jest niezbędna do produkcji białek rekombinowanych i badań nad ekspresją genów. Reagują dobrze zarówno na metody transfekcji oparte na lipidach, jak i transdukcji wirusowej.</li>
	<li>Na dzień 1, rozłóż 1,7 x 105 komórek 293FT na 60 mm naczyń do hodowli tkankowej w końcowej objętości 5,5 mL pożywki do 5,5 mL. Włóż naczynia z komórkami do inkubatora na 24 h.</li>
	<li>Na dzień 2 (dzień transfekcji), dodaj 375 μL pożywki DMEM bez FBS i Pen/Strep do 1,5 mL sterylnej mikrocentrifugacji. Następnie dodaj 10 μL lipidowego reagentu transfekcyjnego, 4 μg plazmidu pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, 2 μg plazmidu pMD2.g(VSVG), 2 μg plazmidu pRSV-REV i 2 μg plazmidu pMDLg/pRRE. Delikatnie stuknij mikrocentrifugacyjną tubę, aby wymieszać pożywkę, reagent transfekcyjny i DNA plazmidu (unikaj wirowania). Inkubator przez 15-30 min w temperaturze pokojowej, aby pozwolić na utworzenie kompleksu DNA/reagent transfekcyjny.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę plazmidu/reagentu transfekcyjnego do 60 mm naczynia zawierającego komórki 293FT do transfekcji bez usuwania pożywki, kroplą po kropli. Włóż komórki z powrotem do inkubatora na 48 h. 
	UWAGA: Ten okres pozwala na produkcję i uwolnienie cząstek lentiwirusowych do pożywki wzrostu.</li>
	<li>Na dzień 4, zebrać pożywkę kulturową z transfekowanych komórek 293FT w celu izolowania cząstek lentiwirusu. Przefiltrować przez sterylny filtr 0,45 μm, aby oddzielić szczątki komórkowe od cząstek lentiwirusu.</li>
	<li>Określić tytuł lentiwirusu z dostępnymi reagentami (opcjonalnie). 
	UWAGA: Ta metoda zwykle daje 105 do 106 jednostek infekcyjnych na mL (IFU/mL), co odpowiada około mnożnikowi infekcji (MOI) ~5, gdy jest używany zgodnie z poniższym punktem transdukcji.</li>
	<li>Rozłóż pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusu do czterech sterylnych kriowialek (1,0 mL na tubę) i przechowuj w -80 ˚C.</li>
</ol>
2. Transdukcja
UWAGA: Ta sekcja opisuje protokół transdukcji lentiwirusowej stosowany do wprowadzenia transgenu do linii komórkowych (Rysunek 1B). Był on konsekwentnie skuteczny w naszym laboratorium1,3,33,37,44,45.
<ol>
	<li>Hodowla linii komórkowej do wyboru (niska liczba przeszczepów) w odpowiedniej pożywce w zwilżonej atmosferze w 37 ˚C i 5% CO2. 
	UWAGA: Zacznij od wczesnego przeszczepu potrzebnego typu komórek. Nowa fiolka komórek musi być rozmrożona i przeszczepiona co najmniej raz przed zasiewem do transdukcji.</li>
	<li>Na dzień 1, zasiej 1 x 105-1,5 x 105 komórek na dole, na każdej połowie 6-dzielnej płytki w 2 mL pożywki do wzrostu. Włóż komórki z powrotem do inkubatora na 24 h.</li>
	<li>Na dzień 2 (dzień transdukcji), upewnij się, że komórki mają pomiędzy 20% a 40% konfluencji. Dodaj 1 mL wirusa, 1 mL pożywki do wzrostu i 2 μL polibreny (2 mg/mL) do 15 mL stożkowej tubki i delikatnie wymieszaj przez inwersję (unikaj wirowania). 
	UWAGA: Polibrena jest używana podczas transdukcji lentiwirusowej, aby zapobiec odpychaniu elektrostatycznemu między cząstkami wirusa a błoną komórkową. Ponieważ polibrena jest dodatnio naładowana, oddziałuje z ujemnie naładowanymi glikoproteinami wirusowymi, neutralizując ich ładunek. Ponadto polibrena wiąże glikozaminoglikany w pożywce kulturalnej, zapobiegając

R.W.S. jest współzałożycielem firmy Canal House Biosciences, LLC, jest w Radzie Doradczej Naukowej i ma udziały w firmie, ale ta firma nie była zaangażowana ani konsultacje nie były związane z tym badaniem. Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów.

Test LivePAR został opracowany w celu wykrycia miejsc uszkodzeń DNA jądrowego, w których PARP1/PARP2 aktywnie syntetyzuje łańcuchy PAR. Aby to osiągnąć, fragment RNF146 kodujący domenę WWE (aminokwasy 100–182) został połączony z EGFP1,2,3,37. Dodatkowe sondy PAR, które opisaliśmy, kodują EGFP połączone z resztkami aminokwasowymi 1 do 166 DTX4, resztkami aminokwasowymi 22 do 112 PARP11 i aminokw...

Ten protokół opisuje test LivePAR, który umożliwia wizualizację i ilościową analizę poli(ADP-rybozy) (PAR) w miejscach obrażeń genomu, głównie związanych z naprawą usuwania zasad (BER) lub naprawą pojedynczych łańcuchów (SSBR), w komórkach ssaków1,2,3. BER jest kluczowy dla ścieżki naprawy DNA, która usuwa uszkodzone lub zmodyfikowane zasady z DNA (dla przeglądów na temat BER i PARylacji, patrz4,5,6,7). BER zaczyna się od glikozylaz DNA, które rozpoznają i wycinają zmodyfikowane zasady4, pozostawiając miejsce apurynowo/apyrimidynowe (AP), na przykład, metylopurynowa glikozylaza (MPG), która wycina smetryzowane zasady8,9, lub 8-oksogwaninowa glikozylaza (OGG1), która wycina 8-oksogwaninę9,10. Miejsca AP są następnie ścinane przez endonukleazę AP 1 (APE1)11,12,13, tworząc nacięcie w łańcuchu DNA. Polimeraza, a mianowicie polimeraza DNA β (Polβ)14,15, dostosowuje i wypełnia lukę używając nieuszkodzonego łańcucha jako szablonu, a na koniec ligazy DNA uszczelniają naprawiony łańcuch16,17, na przykład, ligaza DNA I lub ligaza DNA III.
Kluczowymi graczami w BER i SSBR są poli(ADP-rybozy) polimerazy 1 i 2 (PARP1/PARP2)18,19,20, enzymy, które szybko wykrywają łamania łańcucha DNA podczas BER lub SSBR. Po wykryciu tych łamań, PARP1/PARP2 katalizuje dodanie polimerów ADP-rybozy do siebie i innych białek—proces nazywany PARylacją (dla przeglądu, patrz6)—poprzez hydrolizę NAD+. To tworzy dynamiczny szkielet białkowy (PAR), który rekrutuje inne czynniki naprawy DNA do miejsca uszkodzenia, poprawiając wierność naprawy DNA. Aby zarządzać tym dynamicznym szkieletem PAR, kilka białek przyczynia się do hydrolizy i usuwania łańcuchów PAR, w tym hydrolaza akceptora ADP-rybozy 3 (ARH3), terminalna glikozylohydrolaza ADP-rybozy 1 (TARG1), hydrolaza mono-ADP-rybozy 1/2 (MacroD1/2) i glikohydrolaza poli(ADP-rybozy) (PARG)6,21,22,23,24,25,26. Jednak PARG jest głównie odpowiedzialny za ten proces21,27 i odgrywa kluczową rolę w reakcji na uszkodzenie DNA (DDR)28,29.
PARG jest więc krytycznie związany z funkcją PARP1 i PARP2. Podczas gdy PARP1 i PARP2 tworzą polimery PAR, PARG działa jako enzym "czyszczący", hydrolizując te polimery i skutecznie odwracając PARylację30,31. Ten proces jest niezbędny do zakończenia zarówno BER, jak i SSBR oraz do pozwolenia PARP1/PARP2 na recykling, aby odpowiedzieć na nowe uszkodzenia DNA. W konsekwencji, PARP1, PARP2, PARylacja i PARG działają w skoordynowany sposób, zapewniając wydajną i odwracalną naprawę DNA przez BER i SSBR4,6.
Stopień PARylacji może być wpłynięty przez różne czynniki i odgrywa istotną rolę w ogólnej reakcji na uszkodzenie DNA32. Te czynniki obejmują ekspozycję na genotoksyny, które dodają addukty do zasad DNA, takie jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG), metyl metansulfonian (MMS), nadtlenek wodoru (H2O2) lub terc-butylohydroperoksym (tBuOOH). Ponadto, stopień PARylacji może być wpłynięty przez cząsteczki, które modulowują proces PARylacji, takie jak dihydronikotynamidowe rybozyd (NRH), prekursor NAD+, który zwiększa aktywację PARP poprzez zwiększenie poziomów NAD+, lub FK866, inhibitor NAMPT, który może zmniejszać poziomy NAD+ i negatywnie regulować aktywację PARP3. Wreszcie, mutacje genetyczne lub inhibicja małymi cząsteczkami enzymów takich jak PARP1/PARP2, PARG lub innych białek naprawy DNA (np. defekty w BER lub rekombinacji homologicznej, takie jak BRCA1/BRCA2) mogą zmienić aktywację PARP33,34,35,36.
Test LivePAR wykorzystuje fragment białka z pierścieniem palca 146

<table><tbody><tr><td>Czynniki reagujące, chemikalia i peptydy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m Durapore steriflip filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>20 x 20 mm Microscope coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 22-170-371</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, 100 mm</td><td>VWR</td><td>Cat# 25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 430166</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates, 6-well</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-161</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials, 2 mL</td><td>VWR</td><td>Cat# 89499-722</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 60-29-7</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>Disposable sterile filters, 0.45 &micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Decon Labs</td><td>Cat# 2701</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologics</td><td>Cat# S11150</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10687010</td><td></td></tr><tr><td>Large Kim Wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Cat# 34256</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X GoStix Plus Kit</td><td>Takara</td><td>Cat# 631280</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MNNG</td><td>Molport</td><td>Cat# N493990</td><td></td></tr><tr><td>NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl) tetrahydrofuran-2-yl]-4H-pyridine-3-carboxamide)</td><td>Marie Migaud lub NuChem Sciences Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PARG inhibitor (PDD00017273)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SML1781</td><td></td></tr><tr><td>PARPi inhibitor (Veliparib, ABT-888)</td><td>MedChemExpress</td><td>Cat# HY-10129</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>tBuOOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 180345000</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-x2 (Transfection reagent)</td><td>Mirus</td><td>Cat# MIR-6006</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>VWR</td><td>Cat# 0694</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (H-1000) anti-fade mounting medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NC1695563</td><td></td></tr><tr><td>Linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>293-FT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>(derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>LN428</td><td>Generosity gift from</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>(Human glioblastoma tumor cell line)</td><td>Dr. Ian Pollack (University of Pittsburgh)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>(human hTERT-immortalized retinal pigment epithelial cells)</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>(Human osteosarcoma cell line)</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Lab stock# 253</td><td>Addgene, Cat# 12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Lab stock# 254</td><td>Addgene, Cat# 12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Lab stock# 252</td><td>Addgene, Cat# 12259</td><td></td></tr><tr><td>pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR is the WWE domain of RNF146, amino acid residues 100-182, fused to EGFP; contains a Hygromycin resistance cassette)</td><td>Lab stock# 1727</td><td>Addgene, Cat# 176063</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie i algorytmy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (for preparation of figures)</td><td>Adobe Systems</td><td>Version 2024</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Version 10.5.0 (Mac OS X)</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji parp1/parp2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

Visualization and Quantitative Analysis of Genotoxin-Induced PARP1/PARP2 Activation in Cells Using a Fluorescent Fusion Protein-Based Reporter

Poli(ADP-ryboza) (PAR) to polimer ADP-rybozy syntetyzowany przez cztery członków rodziny enzymów polimerazy ADP-rybozy — PARP1, PARP2, PARP5a i PARP5b. Jednak tylko PARP1 i PARP2 syntetyzują PAR w odpowiedzi na łamanie DNA. PAR jest definiowane jako modyfikacja białka potranslacyjna, ale wykazano również, że istnieje jako modyfikacja DNA lub RNA. Poziomy PAR są dodatkowo regulowane przez PARG, glikohydrolazę PAR, która wraz z PARP1 i PARP2, reguluje poziomu PAR indukowanego uszkodzeniem DNA w komórce. Dynamiczna synteza i degradacja PAR jest kluczowa dla jego roli regulatorowej w naprawie DNA oraz reakcji na uszkodzenie DNA, co z kolei wpływa na reorganizację chromatyny, replikację, transkrypcję i śmierć komórki. Aktywacja PARP1/PARP2 i akumulacja PAR mogą być uważane za miejsca trwającej naprawy przez wycinanie zasady lub naprawy pojedynczego łamania DNA; jednak liczne aktywaty PARP1/PARP2 są również związane ze stresem replikacyjnym i innymi procesami metabolicznymi DNA. Po uformowaniu, łańcuchy PAR ułatwiają rekrutację czynników naprawy DNA i reakcji na uszkodzenie DNA (DDR) do miejsc uszkodzenia DNA lub genomicznej obrażenia poprzez ich domeny wiązania PAR (PBD). Dziesięć różnych PBD rozpoznaje różne regiony cząsteczki PAR, w tym motyw wiązania PAR, cynkowy palec PAR binding, domenę WWE i makrodomenę, między innymi PBD. Aby ułatwić analizę komórkową dynamiki PAR, użyliśmy PBD połączonych z ulepszoną zieloną białkową fluorescencyjną (EGFP), aby zoptymalizować ilościową analizę PAR w komórkach. Opisujemy test, który wykorzystuje fragment RNF146 kodujący domenę PBD/WWE, połączony z EGFP, do wizualizacji i ilościowego określenia akumulacji PAR w miejscach genomicznej obrażenia i trwającej BER lub SSBR. Opisujemy kroki eksperymentalne, w tym produkcję cząstek lentiwirusowych, transdukcję docelową linię komórek, leczenie komórek ssaczych w celu wywołania uszkodzenia genomicznego DNA, pozyskiwanie konfokalnych mikrogrfii fluorescencyjnych i półautomatyczną ilościową analizę danych.

Komórki wykazujące ekspresję sondy LivePAR można uzyskać poprzez wytworzenie lentiwirusa kodującego białko fuzyjne RNF146(100-182)-EGFP (Ryc. 1A). Komórki można analizować po ekspresji przejściowej przez okres do dwóch tygodni po transdukcji lub jako stabilne linie komórkowe po selekcji higromycyną (Ryc. 1B)1. Po traktowaniu genotoksyną, indukowane uszkodzeniem DNA ogniska PAR można zwizualizować w jądrze komórkowym, a następnie, po utrwa...

Tu opisujemy metodę wizualizowania opartych na komórkach, lokalizacji subkomórkowej i analizy ilościowej ognisk wzbogaconych poli(ADP-rybozą) (PAR) w fiksowanych komórkach ssaków. Ten test umożliwia ilościową ocenę miejsc aktywacji PARP indukowanej uszkodzeniem DNA, w tym związaną z naprawą po wycinaniu zasad lub naprawą pojedynczych rozerwaniach łańcucha, w jądrach komórek narażonych na genotoksyczne substancje.

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

Poly(ADP-ribose) (PAR) is a polymer of ADP-ribose synthesized by four members of the ADP-ribose polymerase family of enzymes&#8212;PARP1, PARP2, PARP5a, ...

Nasze laboratorium bada naprawę DNA zależną od PARP1 i PARP2 oraz ścieżki odpowiedzi na uszkodzenie DNA w normalnych i przekształconych komórkach. Wyzwaniem w tej dziedzinie jest ilościowa analiza aktywacji PARP1 i PARP2 w komórkach przy jednoczesnym uniknięciu lizy komórkowej. Umożliwia to badania lokalizacji subkomórkowej.Na początek dodaj 375 mikrolitrów surowicy wołowej płodowej i DMEM bez Penicyliny-Streptomycyny do 1,5-mililitrowej sterylnej mikrocentrfużującej epruwetki. Następnie dodaj 10 mikrolitrów lipidowego reagentu transfekcyjnego i wszystkie wymagane plazmidy do epruwetki. Delikatnie potnij mikrocentrfużującą epruwetkę, aby wymieszać medium, reagent transfekcyjny i DNA plazmidowe.Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut, aby umożliwić tworzenie kompleksów DNA i reagentu transfekcyjnego. Następnie dodaj mieszaninę plazmidu i reagentu transfekcyjnego kroplowo do 60-milimetrowej łódki zawierającej hodowanych komórek 293FT bez usuwania medium i wróć z komórkami do inkubatora na 48 godzin. Następnie zebrać medium kulturalne z transfektowanych komórek 293FT.Aby odizolować cząstki lentiwirusu, przefiltruj zebrane medium przez sterylny filtr 0,45-mikrometra, aby oddzielić reszty komórkowe od cząstek lentiwirusu. Do transdukcji uzyskaj pożądane komórki hodowane przez 24 godziny i upewnij się, że stężenie komórek wynosi między 20% a 40%. Następnie dodaj jeden mililitr wirusa, jeden mililitr medium hodowlanego i dwa mikrolitrów Polybrene do 15-mililitrowej stożkowej epruwetki, delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Teraz usuń medium hodowlane z płytki sześciocomorowej.Dodaj mieszaninę wirusa, medium i Polybrene do każdej komórki. Umieść komórki z mieszanką transdukcyjną w inkubatorze zawierającym stężoną atmosferę w temperaturze 32 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 16 do 18 godzin. Aby zweryfikować ekspresję aminokwasów RNF146, 100 do 182 EGFP, wysiej 200 000 komórek ekspresujących LivePAR na każdej płytce hodowlanej zawierającej pokrywy.Pozwól komórkom 24 do 36 godzin na przyleganie do pokryw, kondycjonowanie medium i rozpoczęcie replikacji. Następnie wystaw komórki ekspresujące LivePAR na podawane reagenty. Dodaj związki bezpośrednio do medium zawierającego komórki na pokrywach i delikatnie mieszaj medium w naczyniach hodowlanych komórek, aby rozprowadzić związki.Inkubuj 60-milimetrowe łódki w 37 stopniach Celsjusza przez 60 do 90 minut. Aby fiksować komórki, usuń medium i przepłucz komórki buforem PBS. Fiksuję komórki w 4% formaldehydzie w buforze PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Po usunięciu formaldehydu przepłucz komórki trzy razy buforem PBS. Następnie dodaj trzy mililitry zimnego metanolu i acetonu do komórek w proporcji 7:3, aby je fiksować. Umieść łódki w minus 20 stopniach Celsjusza przez dziewięć minut.Następnie usuń roztwór metanolu i acetonu. Po przepłukaniu komórek trzy razy buforem PBS, pipetą przenieś 15 mikrolitrów medium przeciwzmętniającego zawierającego DAPI na szkiełko laboratoryjne. Delikatnie zamontuj pokrywę na medium montażowym z komórkami skierowanymi do wewnątrz, minimalizując pęcherzyki powietrza.Środkowo i zabezpiecz pokrywę na szkiełku laboratoryjnym i uszczelń boki, stosując niewielką ilość przezroczystego lakieru do paznokci na krawędziach. Umieść szkiełka w ciemności, aby pozwolić lakierze na wyschnięcie. Po pobraniu i zainstalowaniu Image J, otwórz Image J i zainstaluj plik tekstowy makro LivePAR_Macro, klikając na Wtyczki, wybierając Makro i wybierając Zainstaluj.Otwórz wszystkie pliki konfokalne w Image J i zapisz pliki jako TIFF, aby zachować oryginalne pliki. Następnie otwórz dokument arkusza kalkulacyjnego i zapisz go jako Date_CellLineFociAnalysis. Analizuj po jednym pliku TIFF na raz.Naciśnij 1, aby znaleźć jądra. Kiedy okno menedżera ROI się otworzy, zaznacz wszystkie wpisy i naciśnij dodaj, aby nałożyć obszar jąder na oryginalne zdjęcie. Usuń niepoprawnie zidentyfikowane jądra i wyklucz jądra, które nie są w całości w ramce.Następnie narysuj jądro za pomocą narzędzia Wybór wolnym ręką i naciśnij 2, aby sprecyzować foki PAR. Zaznacz każde jądro w menedżerze ROI i policz liczbę fokusów na jądro. Skopiuj i wklej sprecyzowane dane do otwartego dokumentu arkusza kalkulacyjnego po ocenie wszystkich jąder w pliku.Podobnie powtórz analizę dla wszystkich plików TIFF. Po zakończeniu przedstaw foki PAR na jądro w wybranym oprogramowaniu. Komórki kontrolne z pojazdem wykazały pancelularne barwienie EGFP. Komórki traktowane genotoxinami wykazały akumulację foki jądrowych reprezentujących lokalizację w jądrze. Pretreatowanie inhibitorem PARP1 i PARP2, weliparibem, skutkowało utratą foki PAR. Ilościowa analiza liczby foki PAR na jądro w funkcji czasu i warunków leczenia wykazała podobne wyniki.Ten protokół pozwala nam na ilościową analizę aktywacji osi sygnalizacyjnej PARP1 i PARP2 w odpowiedzi na genotoxiny oraz po zmianach genetycznych. Zastosowałyśmy tradycyjne techniki immunofluorescencji w tym badaniu, a

visualization-quantitative-analysis-genotoxin-induced-parp1parp2

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 wywołanej genotoксиnami w komórkach przy użyciu reportera opartego na białku fuzyjnym z fluorescencyjnym markerem

Opisano metodę monitorowania aktywności ubikwityna-proteasomowej w żywych komórkach. Wygenerowano białka fuzyjne: destabilizowane degronem GFP- (GFP-dgn) oraz stabilne GFP-dgnFS, które następnie wprowadzono do komórek za pomocą lentiwirusem wektora ekspresyjnego. Technika ta pozwala na stworzenie stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję GFP-dgn/GFP-dgnFS, w której aktywność ubikwityna-proteasomową można łatwo ocenić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.

Monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) destabilizowanego przez degron (dgn)

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Cytotoksyczna aktywność fenantrydyny PJ-34 w komórkach nowotworowych przechodzących mitozę została udokumentowana w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania konfokalnego na żywo. PJ-34 zlikwidował ludzkiego raka piersi Komórki MDA-MB-231 zawierające extracentrosomy w mitozie. W przeciwieństwie do normalnej dwuogniskowej mitozy, pozacentrosomy nie były skupione w dwóch biegunach wrzeciona w obecności PJ-34.

Śmierć komórki związana z nieprawidłową mitozą obserwowana przez obrazowanie konfokalne w żywych komórkach rakowych

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Ten artykuł opisuje protokoły do oceny wpływu białek fluorescencyjnych na agregację i toksyczność nieprawidłowo sfałdowanej ekspansji poliglutaminy w celu szybkiej oceny nowo niescharakteryzowanego białka fluorescencyjnego w kontekście reporterów fluorescencyjnych.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

W tym badaniu przedstawiamy test in vitro komórkowy do identyfikacji teratogenicznych substancji chemicznych. Dynamikę sygnalizacji czynników wzrostu fibroblastów (FGF)/współczynnika odpowiedzi surowicy (SRF) mierzono w ludzkich indukowanych pluripotentnych komórkach macierzystych (iPS), a ryzyko teratogenności oceniano poprzez kwantyfikację chemicznego zakłócenia tego szlaku sygnalizacyjnego.<br...

Testy toksyczności rozwojowej oparte na monitorowaniu sygnału czynnika wzrostu fibroblastów w ludzkich indukowanych pluripotentnych komórkach macierzystych w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę ilościowej analizy aktywacji PARP1/PARP2 w żywych komórkach ssaków z wykorzystaniem raportera fluorescencyjnego PBD-EGFP. Technika ta umożliwia wizualizację ognisk PAR i badanie dynamiki naprawy DNA.

Wizualizacja i analiza ilościowa aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej przez genotoksynę w komórkach z wykorzystaniem raportera opartego na białkach fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

Przeglądaj więcej filmów