Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym
17 kwietnia 2026
Tu opisujemy metodę wizualizowania opartych na komórkach, lokalizacji subkomórkowej i analizy ilościowej ognisk wzbogaconych poli(ADP-rybozą) (PAR) w fiksowanych komórkach ssaków. Ten test umożliwia ilościową ocenę miejsc aktywacji PARP indukowanej uszkodzeniem DNA, w tym związaną z naprawą po wycinaniu zasad lub naprawą pojedynczych rozerwaniach łańcucha, w jądrach komórek narażonych na genotoksyczne substancje.
Nasze laboratorium bada naprawę DNA zależną od PARP1 i PARP2 oraz ścieżki odpowiedzi na uszkodzenie DNA w normalnych i przekształconych komórkach. Wyzwaniem w tej dziedzinie jest ilościowa analiza aktywacji PARP1 i PARP2 w komórkach przy jednoczesnym uniknięciu lizy komórkowej. Umożliwia to badania lokalizacji subkomórkowej.
Na początek dodaj 375 mikrolitrów surowicy wołowej płodowej i DMEM bez Penicyliny-Streptomycyny do 1,5-mililitrowej sterylnej mikrocentrfużującej epruwetki. Następnie dodaj 10 mikrolitrów lipidowego reagentu transfekcyjnego i wszystkie wymagane plazmidy do epruwetki. Delikatnie potnij mikrocentrfużującą epruwetkę, aby wymieszać medium, reagent transfekcyjny i DNA plazmidowe.
Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut, aby umożliwić tworzenie kompleksów DNA i reagentu transfekcyjnego. Następnie dodaj mieszaninę plazmidu i reagentu transfekcyjnego kroplowo do 60-milimetrowej łódki zawierającej hodowanych komórek 293FT bez usuwania medium i wróć z komórkami do inkubatora na 48 godzin. Następnie zebrać medium kulturalne z transfektowanych komórek 293FT.
Aby odizolować cząstki lentiwirusu, przefiltruj zebrane medium przez sterylny filtr 0,45-mikrometra, aby oddzielić reszty komórkowe od cząstek lentiwirusu. Do transdukcji uzyskaj pożądane komórki hodowane przez 24 godziny i upewnij się, że stężenie komórek wynosi między 20% a 40%. Następnie dodaj jeden mililitr wirusa, jeden mililitr medium hodowlanego i dwa mikrolitrów Polybrene do 15-mililitrowej stożkowej epruwetki, delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Teraz usuń medium hodowlane z płytki sześciocomorowej.
Dodaj mieszaninę wirusa, medium i Polybrene do każdej komórki. Umieść komórki z mieszanką transdukcyjną w inkubatorze zawierającym stężoną atmosferę w temperaturze 32 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 16 do 18 godzin. Aby zweryfikować ekspresję aminokwasów RNF146, 100 do 182 EGFP, wysiej 200 000 komórek ekspresujących LivePAR na każdej płytce hodowlanej zawierającej pokrywy.
Pozwól komórkom 24 do 36 godzin na przyleganie do pokryw, kondycjonowanie medium i rozpoczęcie replikacji. Następnie wystaw komórki ekspresujące LivePAR na podawane reagenty. Dodaj związki bezpośrednio do medium zawierającego komórki na pokrywach i delikatnie mieszaj medium w naczyniach hodowlanych komórek, aby rozprowadzić związki.
Inkubuj 60-milimetrowe łódki w 37 stopniach Celsjusza przez 60 do 90 minut. Aby fiksować komórki, usuń medium i przepłucz komórki buforem PBS. Fiksuję komórki w 4% formaldehydzie w buforze PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Po usunięciu formaldehydu przepłucz komórki trzy razy buforem PBS. Następnie dodaj trzy mililitry zimnego metanolu i acetonu do komórek w proporcji 7:3, aby je fiksować. Umieść łódki w minus 20 stopniach Celsjusza przez dziewięć minut.
Następnie usuń roztwór metanolu i acetonu. Po przepłukaniu komórek trzy razy buforem PBS, pipetą przenieś 15 mikrolitrów medium przeciwzmętniającego zawierającego DAPI na szkiełko laboratoryjne. Delikatnie zamontuj pokrywę na medium montażowym z komórkami skierowanymi do wewnątrz, minimalizując pęcherzyki powietrza.
Środkowo i zabezpiecz pokrywę na szkiełku laboratoryjnym i uszczelń boki, stosując niewielką ilość przezroczystego lakieru do paznokci na krawędziach. Umieść szkiełka w ciemności, aby pozwolić lakierze na wyschnięcie. Po pobraniu i zainstalowaniu Image J, otwórz Image J i zainstaluj plik tekstowy makro LivePAR_Macro, klikając na Wtyczki, wybierając Makro i wybierając Zainstaluj.
Otwórz wszystkie pliki konfokalne w Image J i zapisz pliki jako TIFF, aby zachować oryginalne pliki. Następnie otwórz dokument arkusza kalkulacyjnego i zapisz go jako Date_CellLineFociAnalysis. Analizuj po jednym pliku TIFF na raz.
Naciśnij 1, aby znaleźć jądra. Kiedy okno menedżera ROI się otworzy, zaznacz wszystkie wpisy i naciśnij dodaj, aby nałożyć obszar jąder na oryginalne zdjęcie. Usuń niepoprawnie zidentyfikowane jądra i wyklucz jądra, które nie są w całości w ramce.
Następnie narysuj jądro za pomocą narzędzia Wybór wolnym ręką i naciśnij 2, aby sprecyzować foki PAR. Zaznacz każde jądro w menedżerze ROI i policz liczbę fokusów na jądro. Skopiuj i wklej sprecyzowane dane do otwartego dokumentu arkusza kalkulacyjnego po ocenie wszystkich jąder w pliku.
Podobnie powtórz analizę dla wszystkich plików TIFF. Po zakończeniu przedstaw foki PAR na jądro w wybranym oprogramowaniu. Komórki kontrolne z pojazdem wykazały pancelularne barwienie EGFP. Komórki traktowane genotoxinami wykazały akumulację foki jądrowych reprezentujących lokalizację w jądrze. Pretreatowanie inhibitorem PARP1 i PARP2, weliparibem, skutkowało utratą foki PAR. Ilościowa analiza liczby foki PAR na jądro w funkcji czasu i warunków leczenia wykazała podobne wyniki.
Ten protokół pozwala nam na ilościową analizę aktywacji osi sygnalizacyjnej PARP1 i PARP2 w odpowiedzi na genotoxiny oraz po zmianach genetycznych. Zastosowałyśmy tradycyjne techniki immunofluorescencji w tym badaniu, a
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia ilościową analizę komórkową służącą do wizualizacji i pomiaru akumulacji poli(ADP-rybozy) (PAR) w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Dzięki zastosowaniu domeny wiążącej PAR (PBD) z białka RNF146 połączonej z ulepszonym zielonym białkiem fluorescencyjnym (EGFP), protokół ten umożliwia analizę w czasie rzeczywistym aktywacji PARP1 i PARP2 oraz tworzenia się ognisk PAR w komórkach ssaków bez konieczności lizy komórek. Metoda ta łączy transdukcję lentiwirusową, mikroskopię konfokalną oraz półautomatyczną analizę obrazu w celu oceny dynamiki naprawy DNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Naprawa DNA
- Obrazowanie komórkowe
- Biologia molekularna
Wprowadzenie
- PAR jest modyfikacją potranslacyjną syntetyzowaną głównie przez PARP1 i PARP2 w odpowiedzi na pęknięcia DNA.
- Poziomy PAR są regulowane zarówno przez syntezę (PARP1/PARP2), jak i degradację (PARG).
- Łańcuchy PAR rekrutują czynniki naprawy DNA i odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) poprzez specyficzne domeny wiążące PAR (PBD).
- Ilościowa analiza dynamiki PAR w żywych komórkach jest trudna, ale niezbędna do zrozumienia procesów naprawy DNA.
Cel badania
- Opracowanie testu na żywych komórkach w celu ilościowego określenia akumulacji PAR oraz aktywacji PARP1/PARP2.
- Umożliwienie badań nad lokalizacją subkomórkową ognisk PAR w odpowiedzi na uszkodzenia DNA.
- Ułatwienie wysokoprzepustowego testowania genotoksyczności oraz identyfikacji nowych czynników szlaku PARP.
Zastosowane metody
- Produkcja cząsteczek lentiwirusowych kodujących białko fuzyjne RNF146 (domena PBD/WWE)-EGFP.
- Transdukcja komórek ssaków i walidacja ekspresji LivePAR-EGFP.
- Traktowanie komórek genotoksynami i inhibitorami PARP w celu indukowania lub hamowania powstawania PAR.
- Fiksacja, konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i półautomatyczna kwantyfikacja ognisk PAR przy użyciu makr ImageJ.
Główne wyniki
- Komórki kontrolne (nośnik) wykazywały rozproszone barwienie EGFP, natomiast komórki traktowane genotoksyną wykazywały obecność nuklearnych ognisk PAR.
- Wstępna inkubacja z veliparybem, inhibitorem PARP1/PARP2, zniosła tworzenie się ognisk PAR.
- Ilościowa analiza wykazała dynamiczne zmiany w liczbie ognisk PAR na jądro, zależne od zastosowanego leczenia i czasu.
- Analizę zwalidowano poprzez kolokalizację z tradycyjnymi technikami immunofluorescencji.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia ilościową analizę aktywacji PARP1/PARP2 oraz akumulacji PAR w żywych komórkach.
- Jest on odpowiedni do wysokoprzepustowych testów genotoksyczności oraz przesiewania inhibitorów PARP.
- Metoda ta pozwala na identyfikację nowych czynników zaangażowanych w szlaki sygnalizacyjne PARP oraz mechanizmy naprawy DNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa wizualizacja aktywacji PARP1/PARP2 w żywych komórkach odpowiada na kluczową potrzebę mechanistycznej redukcji ryzyka w procesie walidacji celów naprawy DNA. Ten reporter oparty na fluorescencyjnym białku fuzyjnym umożliwia wysokoprzepustową analizę subkomórkową dynamiki odpowiedzi na uszkodzenia DNA, zwiększając pewność predykcyjną na wczesnych etapach odkrywania i identyfikacji wiodących związków. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji portfelowych poprzez dostarczenie wiarygodnych, ilościowych odczytów w badaniach genotoksyczności i screeningu inhibitorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią kwantyfikację aktywacji PARP1/PARP2 w odpowiedzi na genotoksyny lub zmiany genetyczne.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez lokalizację akumulacji PAR w miejscach uszkodzeń DNA w żywych komórkach.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów szlaków naprawy DNA za pomocą obrazowania ilościowego.
- Zapewnia wiarygodność prognostyczną w celu dalszego rozwoju modulatorów naprawy DNA w procesie badawczym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany test oparty na komórkach do wysokoprzepustowego przesiewania genotoksyczności i inhibitorów PARP.
- Standaryzuje kwantyfikację ognisk PAR przy użyciu półautomatycznej analizy obrazu w celu zapewnienia powtarzalności.
- Umożliwia skalowalną, multipleksową ocenę wpływu związków na sygnalizację naprawy DNA.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do dalszych etapów procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia analizę szlaków naprawy DNA w modelach komórkowych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację modulatorów szlaku PARP.
- Dostarcza ilościowych punktów końcowych dla decyzji o dalszym rozwoju projektu w badaniach translacyjnych, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Umożliwia identyfikację nowych czynników zaangażowanych w sygnalizację PARP, które mają znaczenie dla stabilności genomicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy test integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając ilościową analizę dynamiki naprawy DNA oraz modulacji szlaku PARP w żywych komórkach.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla celów naprawy DNA.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków i profilowania inhibitorów.
- Analityka: Dostarcza pomiary oparte na obrazowaniu liczby ognisk PAR na jądro do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne odkrycia z walidacją w modelach przedklinicznych dla terapii naprawy DNA.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, skalowalną platformę do ciągłej analizy genotoksyczności i szlaków w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naprawy DNA.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację w żywych komórkach i wspiera skalowalne, wysokoprzepustowe przepływy pracy.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój modulatorów naprawy DNA.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie transdukcji lentiwirusowej, mikroskopii konfokalnej oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do hodowli komórkowej, obrazowania fluorescencyjnego oraz infrastruktury obliczeniowej do przetwarzania danych.
- Wymaga standaryzacji konfiguracji testu i protokołów analizy pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwość adaptacji do różnych linii komórek ssaków i modeli uszkodzeń DNA poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od zwalidowanych kontroli hamowania PARP i odpowiedzi na genotoksyny w celu zapewnienia specyficzności testu.
