Wizualizacja i analiza ilościowa aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej przez genotoksynę w komórkach z wykorzystaniem raportera opartego na białkach fluorescencyjnych

Nasze laboratorium bada naprawę DNA zależną od PARP1 i PARP2 oraz szlaki odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach normalnych i przekształconych. Wyzwaniem w tej dziedzinie jest ilościowa analiza aktywacji PARP1 i PARP2 w komórkach, przy jednoczesnym unikaniu lizy komórek. Pozwala to na badania lokalizacji podkomórkowej.

Na początek należy dodać 375 mikrolitrów surowicy płodowej bydła oraz DMEM wolnego od penicyliny i streptomycyny do sterylnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj do rurki 10 mikrolitrów odczynnika transfekcyjnego opartego na lipidach oraz wszystkie wymagane plazmidy. Delikatnie stuknij w rurkę mikrowirówkową, aby wymieszać medium, odczynnik transfekcyjny i DNA plazmidowe.

Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut, aby umożliwić powstanie DNA i kompleksu odczynnikowego transfekcji. Następnie dodaj mieszankę plazmidów i odczynników transfekcyjnych kroplami do 60-milimetrowej miseczki zawierającej hodowlowane komórki o długości 293 stóp bez usuwania podłoża i sprowadź komórki do inkubatora na 48 godzin. Następnie pobierz pożywkę hodowlową z transfekowanych komórek o średnicy 293 stóp.

Aby wyizolować cząstki lentiwirusa, przefiltruj zebrane medium przez sterylny filtr o średnicy 0,45 mikrometra, aby oddzielić resztki komórkowe od cząstek lentiwirusa. Do transdukcji należy hodować pożądane komórki przez 24 godziny i sprawdzić, czy konfluencja komórek wynosi od 20% do 40%. Następnie dodaj jeden mililiter wirusa, jeden mililiter podłoża wzrostu oraz dwa mikrolitry polibrenu do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, delikatnie wymieszanej przez inwersję. Teraz usuń podłoże wzrostu z płyty z sześcioma dołkami.

Dodaj do każdego dołka mieszankę wirusa, medium i polibrenu. Umieść komórki z mieszanką transdukcyjną w inkubatorze zawierającym nawilżoną atmosferę o temperaturze 32 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 16 do 18 godzin. Aby zweryfikować ekspresję aminokwasów RNF146, 100 do 182 EGFP, nasiona 200 000 komórek ekspresujących LivePAR na miskę hodowlową zawierającą pokrywki.

Poczekaj na 24 do 36 godzin na przyklejenie się do warstw okładki, kondycjonuj podłoże i rozpocznij replikację. Następnie wystaw komórki ekspresujące LivePAR na dane odczynniki. Dodaj związki bezpośrednio do medium zawierającego komórki na pokrywkach i delikatnie mieszaj podłoże w naczyniach do hodowli komórek, aby rozprowadzić związki.

Inkubuj naczynia o średnicy 60 milimetrów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 do 90 minut. Aby utrwalić komórki, usuń podłoże i przemyj komórki PBS. Umieść komórki w 4% formaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu formaldehydu przemyj komórki trzykrotnie PBS. Następnie dodaj do ogniw trzy mililitry zimnego metanolu i acetonu w proporcji 7:3, aby je utrwalić. Postaw naczynia w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dziewięć minut.

Następnie usuń roztwór acetonu metanolowego. Po trzykrotnym umyciu komórek PBS, pipetuję 15 mikrolitrów medium antyfade zawierającego DAPI na szklaną szkiełkę. Delikatnie zamontuj pokrywę na nośniku montażowym, tak że komórki są skierowane do środka, minimalizując pęcherzyki.

Wycentruj i przymocuj okładkę na szklanym szkiełku i uszczelnij boki, nakładając na krawędzie niewielką ilość przezroczystej emalii do paznokci. Umieść szkiełka w ciemności, aby szkliwo paznokci mogło wyschnąć. Po pobraniu i zainstalowaniu Image J otwórz Image J i zainstaluj plik tekstowy makra LivePAR_Macro klikając Wtyczki, wybierając Makra i wybierając Instalacja.

Otwórz wszystkie pliki konfokalne w Obrazie J i zapisz je jako pliki TIFF, aby zachować oryginalne pliki. Następnie otwórz dokument kalkulacyjny i zapisz go jako Date_CellLineFociAnalysis. Analizuj jeden plik TIFF na raz.

Naciśnij 1, aby znaleźć jądra. Gdy okno menedżera ROI się otworzy, zaznacz wszystkie wpisy i naciśnij dodaj, aby nałożyć obszar jąder na oryginalny obraz. Usuń błędnie zidentyfikowane jądra i wyklucz jądra, które nie znajdują się w pełni w ramce.

Następnie narysuj jądro narzędziem Freehand Selection i naciśnij 2, aby ilościowo określić ogniska PAR. Wybierz każde jądro w menedżerze ROI i policz liczbę ognisk w jednym jądrze. Skopiuj i wklej dane ilościowe do otwartego dokumentu kalkulacyjnego po ocenie wszystkich jąder w pliku.

Podobnie powtórz analizę dla wszystkich plików TIFF. Po zakończeniu nakreśl ogniska PAR na jądro w wybranym oprogramowaniu. Komórki kontrolne pojazdu wykazały pankomórkowe barwienie EGFP.

Komórki objęte genotoksyną wykazały nagromadzenie ognisk jądrowych reprezentujących lokalizację w jądrze. Wstępne leczenie inhibitorami PARP1 i PARP2 veliparibem spowodowało utratę ognisk PAR. Ilościowe określenie liczby ognisk PAR w jądrze w funkcji czasu i warunków leczenia przyniosło podobne wyniki.

Protokół ten pozwala nam ilościowo określić aktywację osi sygnalizacji PARP1 i PARP2 w odpowiedzi na genotoksyny i następujące po zmianach genetycznych. Stosowaliśmy tradycyjne techniki immunofluorescencji w tym teście, aby potwierdzić kolokalizację białek z poli-ADP-rybozą. W przyszłości wykorzystujemy ten test do testów genotoksyczności, do analizy wysokoprzepustowości inhibitorów PARP1, PARP2 lub PARP oraz do identyfikacji nowych czynników zaangażowanych w sygnalizację PARP1 i PARP2.