ניתוק תא יחיד של אלגנים Caenorhabditis: שיטה לבודד תאים חיים

Overview

וידאו זה מתאר שיטה לנתק תולעים שלמות לתוך השעיה של תא יחיד מתאים FACS או immunoprecipitation של תאים שלמים.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מגרמניה ואח ', בידוד של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות מאלגנים של תולעת עגולה Caenorhabditis, J. Vis. Exp. (2019).

1. הכנה ואיסוף של תולעים מיושנות לבידוד תאים

שים לב: מוסבר להלן הבידוד של נוירונים שימוש מן הלא-17 מהונדס ::זןGFP (OH13083) המתקבל מרכז גנטיקה Caenorhabditis (CGC) מאגר המתח באוניברסיטת מינסוטה. זה הכרחי כדי לשמור על תנאים סטריליים כדי למנוע זיהום מפטריות או חיידקים.

1. הכינו וסנכרנו תולעים בשיטת הלבנה כמתואר על ידי T. Stiernagle. לניסויי הזדקנות, תולעי צלחת על צלחות בינוניות צמיחה נמטודית (NGM) המכילות תמיסת מים של 25 מיקרומטר של פלואורודוקסיורידין (FuDR) כדי להפחית את ייצור הביצים ולעצור את בקיעת הביצים. בדוק צלחות אגר באופן קבוע כדי למנוע זיהום או ביצה בוקעת כמו זה יגרום לתוצאות לא אמינות.
   שים לב: עבור unc-17::תאי GFP, בדרך כלל שלושה לוחות NGM 100 מ"מ x 15 מ"מ משמשים כדי לבודד כמות מספקת של תאים מעניינים.
2. לאסוף תולעים ולהכין מאגרים לבידוד תאים.
   1. לאסוף תולעים בצינור חרוט 15 מ"ל. לשטוף תולעים מצלחת עם 1.5 מ"ל של חיץ M9 (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM_{Na 2}HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7.0) וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,600 x g. השלך על טבעי ולשטוף תולעים עם 1 מ"ל של מאגר M9. צנטריפוגה חוזרת לשטוף במשך חמש פעמים בסך הכל כדי להסיר זיהום E. coli ככל האפשר.
      שים לב: הוספת אנטיביוטיקה (50 מיקרוגרם / מ"ל), כגון ampicillin, בשלב זה יכול לעזור להפחית זיהום חיידקי.
   2. עבור שתי דגימות, להכין 2 מ"ל של נתרן דודצ'יל סולפט-dithiothreitol (SDS-DTT) מאגר תמוגה: 200 מ"מ DTT, 0.25% (w / v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8.0), ו 3% (w / v) סוכרוז.
   3. הכן 15 מ"ל של מאגר בידוד (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) ולאחסן אותו על קרח.
      שים לב: יש לבצע הן את מאגר התמוגה SDS-DTT והן את מאגר הבידוד לפני כל ניסוי.
3. שיבוש קוטיקל ובידוד תא יחיד
   1. חיות צנטריפוגה שנאספו בשלב 1.2.1 במשך 5 דקות ב 1,600 x גרם. הסר את כל התולעים supernatant ולהשעות 1 מ"ל של מדיה M9 ולהעביר צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
   2. תולעי גלולה עם צנטריפוגה ב 1,600 x g במשך 5 דקות.
   3. הוסף 200 μL של מאגר תמוגה SDS-DTT לתולעים ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). תולעים צריך להיראות "קריצה" לאורך הגוף אם צפו תחת מיקרוסקופ אור.
      שים לב: חשיפה ממושכת למאגר תמוגה SDS-DTT עלולה לגרום למוות של תולעים, אשר ניתן לפקח על ידי התבוננות תולעים. תולעים מתות יתרחבו ולא יתכרבלו.
   4. מוסיפים 800 μL של חוצץ בידוד קר כקרח ומערבבים על ידי צינור מצליף בעדינות.
   5. תולעי גלולה במשך 1 דקות ב 13,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס, להסיר supernatant ולשטוף עם 1 מ"ל של מאגר בידוד.
   6. חזור על שלב 1.3.5 בסך הכל חמש פעמים, בזהירות הסרת מאגר בידוד בכל פעם.
   7. הוסף 100 μL של תערובת פרוטאז מ Streptomyces griseus (15 מ"ג / מ"ל) (שולחן החומרים)מומס במאגר בידוד לכדור ודגורה במשך 10-15 דקות ב RT.
      שים לב: כמו עם מאגר תמוגה SDS-DTT, עיכול פרוטאז המורחב עלול לגרום מחשוף מוגזם של חלבונים לאורך קרום הפלזמה, מניעת בידוד של משטח חשוף GFP באמצעות חרוזים מגנטיים.
   8. במהלך הדגירה עם תערובת פרוטאז, להחיל הפרעה מכנית על ידי צנרת דגימות למעלה ולמטה נגד החלק התחתון של צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל עם קצה מיקרופיפט μL 200 עבור ~ 60-70 פעמים. שמור את קצה פיפטה על הקיר של צינור microcentrifuge עם לחץ מתמיד כדי לנתק כראוי תאים.
   9. כדי לקבוע את שלב העיכול, להסיר נפח קטן (~ 1-5 μL) של תערובת העיכול, להפיל אותו על שקופית זכוכית ולבדוק אותו באמצעות מיקרוסקופ תרבות הרקמה. לאחר 5-7 דקות של דגירה, שברי תולעת צריך להיות קוטיקל מופחת בעליל תרחיף של תאים יהיה גלוי בקלות.
   10. עצירת תגובה עם 900 μL של בינוני L-15 קר זמין מסחרית של ליבוביץ בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS) ו פניצילין סטרפטומיצין (ריכוז סופי ב 50 U / mL פניצילין ו 50 מיקרוגרם / mL סטרפטומיצין).
   11. גלולה מבודדת שברים ותאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים כדורי עם 1 מ"ל של מדיה L-15-בתוספת קר פעמיים נוספות כדי להבטיח כי פסולת עודפת קוטיקל מוסר.
   12. Resuspend תאים כדוריים ב 1 מ"ל של מדיה L-15 בתוספת ולהשאיר על הקרח במשך 30 דקות. קח את השכבה העליונה, כ 700-800 μL, לצינור microcentrifuge. שכבה זו מכילה תאים ללא פסולת תאים ותשמש בבידוד הבא של תאים מעניינים.
   13. בהתאם להוראות היצרן, השתמש במונה תאים אוטומטי או בהמוציטרומטר כדי למדוד את צפיפות התא של 10-25 μL של תאים מבודדים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010