Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- התחל עם תולעים גלולה שטף ולהוסיף מאגר תמוגה המכיל SDS, חומר ניקוי, ו DDT, סוכן הפחתת. זה מפרק את קוטיקל מגן של התולעת חושף את הגוף עבור ניתוק התא.
לאחר מכן, הסר את ריאגנטים תמוגה עם כמה שטיפות של מאגר בידוד קר. חשוב כי מאגר זה הוא של osmolarity הנכון כדי למנוע מוות של תאים.
הוסף מדיה המכילה סרום כדי לעצור את תגובת האנזים ואנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום. Pellet ולשטוף את המדגם מספר פעמים כדי להסיר את רוב הפסולת.
לבסוף, מניחים את הצינור על הקרח כדי לאפשר משקעים הכבידה. פסולת כולל שרידים של קוטיל או גושים התא יתיישבו, בעוד תאים מנותקים להישאר תלויים בשכבה העליונה של התקשורת. תאים אלה יכולים לשמש עבור culturing לטווח קצר או לבודד אוכלוסיות תאים ספציפיות על ידי FACS או immunoprecipitation.
בפרוטוקול הדוגמה, אנו לנתק תולעים מהונדסות המבטא GFP בנוירונים של עניין לבודד ולנתח תאים אלה.
- לאחר איסוף בעלי החיים, צנטריפוגה אותם ב 1,600 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את כל supernatant ולהשעות מחדש את התולעים ב 1 מיליליטר של מדיה M9. להעביר את ההשעיה צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 1,600 פעמים g במשך חמש דקות כדי גלולות התולעים. לאחר מכן, להוסיף 200 מיקרוליטרים של מאגר SDS-DDT ולהדגיר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. התולעים עכשיו צריך להיראות מקומט לאורך הגוף אם צפו תחת מיקרוסקופ אור.
לאחר מכן, הוסיפו 800 מיקרוליטרים של חיץ בידוד קר כקרח וערבבו על ידי החלקה עדינה של הצינור.
חזור על תהליך צנטריפוגה ושטיפה זה חמש פעמים בסך הכל, הקפד להסיר בזהירות את מאגר הבידוד בכל פעם. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של תערובת פרוטאז מ Streptomyces griseus מומס במאגר בידוד, לכדור.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. הקפדה על הפרעה מכנית על ידי pipetting למעלה ולמטה 60 עד 70 פעמים עם קצה מיקרופיפט 200 microliter נגד החלק התחתון של הצינור.
לאחר חמש עד שבע דקות, שברי תולעת צריכים להיות קוטיקל מופחת בעליל ותרסיס של תאים יהיה גלוי בקלות. לעצור את התגובה על ידי הוספת 900 microliters של בינוני L15 זמין מסחרית של ליבוביץ בתוספת 10% FBS ו פניצילין סטרפטומיצין.
צנטריפוגה ב 10,000 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי גלולה שברים מבודדים ותאים. לשטוף את התאים כדוריים פעמיים יותר עם L15 קר בתוספת מדיה באמצעות 1 מיליליטר של מדיה לכל לשטוף.
לאחר מכן, קח את השכבה העליונה, שהיא כ 700 עד 800 microliters, ולהעביר אותו צינור microcentrifuge. השתמש מונה תאים אוטומטי או hemocytometer כדי למדוד את צפיפות התא של 10 עד 25 microliters של תאים מבודדים.
