Summary
हम यहाँ वर्णन कैसे जीवित कोशिकाओं में अंतर-जंक्शनों के माध्यम से सेलुलर संचार कल्पना करने के लिए लूसिफ़ेर पीले रंग का एक एकल कोशिका microinjection करते हैं, और कुछ उपयोगी सुझाव प्रदान करने के लिए। हम जानते हैं कि इस पत्र कार्यात्मक अंतराल जंक्शनों के कारण सेलुलर युग्मन की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए हर किसी को मदद मिलेगी उम्मीद है। यहाँ वर्णित सब कुछ सिद्धांत रूप में हो सकता है,, 1000 Daltons नीचे आणविक वजन के साथ अन्य फ्लोरोसेंट रंजक के लिए अनुकूलित।
Introduction
अंतराल जंक्शनों कहनेवाला चैनलों कि पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच 1 ख़बर अनुमति देते हैं। यह संचार दो या अधिक पड़ोसी कोशिकाओं, जहां हर एक को एक connexon या hemichannel साथ योगदान देता है कहनेवाला चैनल फार्म को जोड़ता है। स्तनधारी कोशिकाओं में, connexon छह connexins, चार transmembrane डोमेन और एक सी है और कोशिका द्रव्य 2 के भीतर एन टर्मिनल के साथ monomers द्वारा बनाई है। अंतराल जंक्शनों न केवल, आयनों, दूसरा दूत और छोटे चयापचयों के प्रवाह की अनुमति है, लेकिन यह भी इस तरह के synaptic प्रसारण, दिल संकुचन, सेल के विकास और भेदभाव 3, 4, 5, 6 के रूप में कई शारीरिक प्रक्रियाओं में सेलुलर संचार के कई रूपों के लिए योगदान 7, 8। इसके अलावा अंतराल जंक्शनों के साथ संबद्ध किया गया हैकैंसर 9, 10, 11 पेशी शोष, कुछ आनुवंशिक बीमारियों और रोगों 12 demyelinating सहित कई बीमारियों।
कहनेवाला crosstalk के इस प्रकार के कई तरीकों 13, 14, 15, 16 से मूल्यांकन किया जा सकता है। इस पत्र में, हम कैसे जीवित कोशिकाओं में अंतर-जंक्शनों के माध्यम से सेलुलर संचार कल्पना करने के लिए लूसिफ़ेर पीले रंग का एक एकल कोशिका microinjection प्रदर्शन करने के लिए दिखा। हम कैसे कोशिकाओं और micropipette, micromanipulator के उपयोग और एक थाइमिक उपकला कोशिका लाइन में लूसिफ़ेर पीले रंग का इंजेक्शन तैयार करने पर चर्चा की। आमतौर पर, इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया सेल डाई के साथ लोड करने के लिए लॉग इन कोशिकाओं की औसत से विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि की खाई नीचे आणविक वजन के साथ अन्य फ्लोरोसेंट रंगों के साथ प्रयोग किया जा सकता हैजंक्शनों कट ऑफ जो लगभग 1,000 डाल्टन है।
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Protocol
1. कक्ष की तैयारी
- एक मशीन में परीक्षण किया जा करने के लिए एक थाइमिक उपकला कोशिका लाइन (IT76M1) या सेल की एक संस्कृति को बनाए रखने (37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2)।
- पीबीएस 1x के साथ कोशिकाओं को धो लें (इस आइटम 3x दोहराने)।
- 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को trypsin जोड़ें।
- मध्यम trypsin और सेंट्रीफ्यूज (5 मिनट के लिए 800 XG) के साथ कोशिकाओं के लिए 10% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) के साथ (trypsin के मद में जोड़ा 1.3 की मात्रा का दो बार) जोड़ें।
- एक hemocytometer में कोशिकाओं की गणना।
- सेल के प्रकार के अनुसार के रूप में कोशिकाओं युग्मन अनुमति देने के लिए एक दूसरे के साथ निकट संपर्क में रहना होगा कोशिकाओं के घनत्व को समायोजित करें। नोट: हमारे मामले में, हम प्रति 35 मिमी पेट्री डिश 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया।
2. Micropipette तैयारी
- एक गिलास केशिका micropipette (1.5 मिमी व्यास) व्यास के अंतिम 0.2 माइक्रोन से निर्दिष्ट के रूप में micropipette खींचो तो के रूप में लगभग 30 MΩ के अंतिम प्रतिरोध प्राप्त करने के लिएएफ "> 17, 18।
नोट: वैकल्पिक रूप से, इंजेक्शन pipettes खरीदा जा सकता है। प्रतिरोध सेल के आकार पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए एक उच्च प्रतिरोध microelectrode अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं के लिए आवश्यक होगा, उदाहरण के (100-150 MΩ) 19 के लिए। एक आम समस्या यह है कि हो सकता है लूसिफ़ेर पीला समाधान है जो तब micropipette में बाधा डालती कर सकते हैं और पूर्व निस्पंदन या centrifugation आवश्यकता हो सकती है की तेज़ी है। इंजेक्शन से पहले, micropipette माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण किया जाना चाहिए, अगर वहाँ एक बाधा या व्यवधान 13 के किसी भी प्रकार है पता लगाने के लिए। micropipette एक खारा समाधान के अंदर micropipette टिप के साथ भंडारण इंजेक्शन लगाने के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है।
3. परीक्षण Micropipette
- 150 mmol / एल एलआईसीआई में लूसिफ़ेर पीला समाधान (5%) तैयार करें और micropipette एक सिरिंज का उपयोग कर लोड या backfilling द्वारा (में यह भंडारण समाधान डाल)।
- micropipe रखेंmicroinjection कार्य केंद्र पर IT76M1 कोशिकाओं के साथ 35 मिमी पेट्री डिश पर टीटीई और सेल माध्यम में कांच micropipette की नोक डूब। micropipette पर ध्यान दें और एक पल्स लगाने से एक डाई बहने परीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
4. एकल कोशिका लूसिफ़ेर पीला Microinjection
- सही सेल परत एक उच्च Magni जिया (40X) का उपयोग कर ऊपर माइक्रोस्कोप ध्यान दें, फिर धीरे धीरे micromanipulator का उपयोग कोशिकाओं को पिपेट कम है।
- लक्ष्य सेल पंचर जब टिप काफी करीब कोशिका झिल्ली को छूने के लिए है, और सेल में भंडारण लागू करने के लिए एक छोटा सा hyperpolarizing पल्स लागू होते हैं। लागू वोल्टेज डाई का शुद्ध प्रभारी पर निर्भर करेगा इंजेक्शन जा। वैकल्पिक रूप से, कुछ अन्य रंगों के रूप में तालिका 1 में दिखाया गया है इस तकनीक के साथ प्रयोग किया जा सकता है।
नोट: सिद्धांत रूप में मेगावाट के साथ किसी भी हाइड्रोफिलिक डाई कम से कम 1KDa इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, स्थानांतरण की दर वजन और hydrophilicity के अनुसार भिन्न हो सकता है। इसके अतिरिक्त, यूइस्तेमाल डाई की Nspecific हस्तांतरण मूल्यांकन किया जाना चाहिए। - सेल छवियों पर कब्जा डाई इंजेक्शन के बाद 3 मिनट या समय चूक माइक्रोस्कोपी (30 एफपीएस) के साथ एक छोटी सी फिल्म बनाते हैं।
नोट: एक समान दृष्टिकोण Hitomi एट अल (2015) 20 में देखा जा सकता है। के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया कहनेवाला पुलों से संचार (अधूरा बँटवारा), rhodamin dextran (2 से 10 केडीए के लिए) है, जो अंतराल जंक्शनों के माध्यम से पारित नहीं होता है, लेकिन कहनेवाला पुलों और nanotubules के कुछ प्रकार की सिफारिश की है के माध्यम से गुजरता एक सह इंजेक्शन से बचने के लिए ।
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Representative Results
Thymic उपकला कोशिका लाइन आईटी 76MI रूप में इन कोशिकाओं 43 21 connexin द्वारा गठित कार्यात्मक अंतराल जंक्शनों व्यक्त करने के लिए वर्णित किया गया अंतराल जंक्शनों द्वारा डाई युग्मन मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। चित्रा 1 जब पिपेट की नोक के नीचे एक सेल में लागू लूसिफ़ेर पीला के इंजेक्शन से पता चलता है। कुछ ही मिनटों के बाद, लॉग इन कोशिकाओं फ्लोरोसेंट (तारों) अंतराल जंक्शनों के माध्यम से फ्लोरोसेंट रंजक के प्रसार का संकेत हो जाते हैं। कोशिकाओं और समय फ्लोरोसेंट बन की संख्या सीधे इन कोशिकाओं के बीच सेलुलर संचार की डिग्री के साथ जुड़ा हुआ है। चित्रा 2 से पता चलता थाइमिक उपकला कोशिकाओं में भंडारण के इंजेक्शन और सम्मिलित करता है (डालने घ) भंडारण और rhodamine dextran (10kDa) के सह इंजेक्शन दिखा। जैसी कि उम्मीद थी LY एक पड़ोसी सेल से गुजरता है, हालांकि rhodamine dextran इसकी उच्च आणविक वजन की वजह से नहीं है। इसके अलावा, एक जीजे अवरोधक की उपस्थिति (डालने एफ), octanol, bloआसपास की कोशिकाओं को डाई के पारित होने cked। वैकल्पिक रूप से, एक के लिए एक विशेष सेल या जीजे के समारोह पर एक दवा के प्रभाव के युग्मन की डिग्री मूल्यांकन कर सकते हैं। चित्रा 3 ए के साथ या बिना dexamethasone टीईसी कोशिकाओं में भंडारण के इंजेक्शन से पता चलता है। तब 100 कोशिकाओं इंजेक्शन थे dexamethasone की उपस्थिति और संवाद स्थापित करने के लिए 1 या 2 कोशिकाओं के प्रतिशत में, दवा के बिना नियंत्रण के संबंध में इसी तरह की थी। हालांकि संवाद स्थापित करने के 3 या 4 कोशिकाओं की संख्या अधिक है जब नियंत्रित करने के लिए की तुलना में था। पांच या 6 कोशिकाओं और dexamethasone की उपस्थिति में जी जे संचार के साथ 7 या 8 कोशिकाओं नियंत्रण में नहीं मनाया गया, इस प्रकार यह दर्शाता है कि dexamethasone टीईसी कोशिकाओं में युग्मन की डिग्री की वृद्धि हुई।
चित्रा 1: IT-76MI कोशिकाओं में लूसिफ़ेर पीला इंजेक्शन। (ए) micropipette कोशिका झिल्ली के करीब। (बी (सी) एक परीक्षण नाड़ी है कि क्या वास्तव में इलेक्ट्रोड डाई इंजेक्शन है सत्यापित करने के लिए तैयार की गई थी। (डी) पिपेट कोशिका झिल्ली को छुआ और यह लूसिफ़ेर पीला रंग के साथ आरोप लगाया गया था। (ई) सेल का आरोप लगाया (तीर द्वारा संकेत), कम से कम पांच पड़ोसी की कोशिकाओं के लिए अंतराल जंक्शनों के माध्यम से पारित करने के लिए X20 डाई की अनुमति दी। एफ) एक डिजिटल ज़ूम बेहतर दृश्य की अनुमति के लिए किया गया था। तारों कोशिकाओं है कि इसके विपरीत चरण माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 ए) में आरोप लगाया गया है बाहर बिंदु। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: थाइमिक उपकला कोशिकाओं (टीईसी) में लूसिफ़ेर पीला इंजेक्शन। चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी। (ए बी) मानव Thymic उपकला कोशिका। (सी और डी) Thymic नर्स सेल, (ई और एफ) एक माउस Thymic उपकला कोशिका लाइन, क्रमशः। (डी) में डालने rhodamine-dextran 10kDa का एक इंजेक्शन (अंतराल जंक्शनों के माध्यम से प्रवेश के योग्य नहीं) के बाद एक ही सेल (तीर) से पता चलता है। (ई) और (एफ) में सम्मिलित टीईसी लाइन 10 मिनट के लिए octanol 1 मिमी (एक अंतराल जंक्शन अवरोधक) के साथ पूर्व इलाज में डाई हस्तांतरण के अभाव दिखा। सभी पैनलों में तारों इंजेक्शन कोशिकाओं के निशान। (वायुसेना) एक्स 200 अल्वेस एट अल से Reproduced। 1995 5। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: गैप जंक्शन संचारn एक चूहे उपकला कोशिका लाइन में dexamethasone की वृद्धि हुई। टीईसी 1 माइक्रोन dexamethasone के साथ इलाज किया गया, और युग्मन डिग्री लूसिफ़ेर पीला डाई हस्तांतरण परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था। (ए) माइक्रोस्कोपी क्षेत्रों (चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति, क्रमश: छोड़ दिया और सही पैनल में) इंजेक्शन सेल और उन है कि जब भंडारण इंजेक्ट किया गया था (बढ़ाई 320X) मिलकर थे चित्रण। सभी पैनलों में तारों इंजेक्शन कोशिकाओं के निशान। (बी) Histograms नियंत्रण और dexamethasone इलाज कोशिकाओं के युग्मन के पैटर्न दिखा। विश्लेषण समूह प्रति 100 microinjections के शामिल हैं। अल्वेस एट अल।, 2000 23 से reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| डाई | मेगावॉट | / उत्तेजना उत्सर्जन |
| hydroxycoumarin कार्बोक्जिलिक एसिड | 206 | 386/488 |
| calcein नीला | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | 279 | 358/461 |
| Carboxyfluorescein | 376 | 492/517 |
| ethidium आयोडाइड (ब्रोमाइड) | 314 | 518/605 |
| लूसिफ़ेर पीला सीएच | 443 | 428/536 |
| एलेक्सा स्त्राव 488 | 570.5 | 495/519 |
| calcein | 622 | 494/517 |
| प्रोपीडियम आयोडाइड | 414 | 535/617 |
तालिका 1: रंगों वर्तमान में microinjection प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया। यहाँ में,कुछ आणविक वजन और / उत्तेजना उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ रंगों का इस्तेमाल किया।
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Discussion
आदेश में हालांकि कहनेवाला चैनलों द्वारा पारगम्य 16 के लिए आवश्यक हैं, कार्यात्मक कहनेवाला खाई जंक्शन की उपस्थिति, ट्रेसर, जो झिल्ली अभेद्य हैं का उपयोग सत्यापित करने के लिए। Fluorescein, पहले फ्लोरोसेंट रंजक निरीक्षण करने के लिए सेल करने वाली सेल युग्मन 22, गैर जंक्शनल झिल्ली 3 के बीच पारगम्य है और इसलिए लूसिफ़ेर पीला डाई 15 से प्रतिस्थापित किया गया है। वर्तमान में, फ्लोरोसेंट ट्रेसर के कई अलग अलग प्रकार के बीच में सबसे अच्छा विकल्प की गुंजाइश है और प्रयोग की शर्तों पर निर्भर करता है खोजने के लिए। फ्लोरोसेंट रंगों के साथ सेल लोडिंग की प्रक्रिया आकृति विज्ञान का मूल्यांकन, एकल कक्षों के समारोह और कोशिकाओं के बीच हस्तांतरण की गतिज दर परमिट। इसके अलावा, डाई microinjection कोशिकाओं 21, 23 के बीच की खाई को जंक्शनों के शारीरिक भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए अनुमति देता है, सी की डिग्री के बाद सेellular संचार मिलकर कोशिकाओं की संख्या से संबंधित है।
कई महत्वपूर्ण कारकों को सफलतापूर्वक microinjection डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सामान्य सेल homeostasis और अखंडता को बनाए रखा जाना चाहिए, इस प्रकार एक छोटे से इंजेक्शन समय डाई और microinjection के साथ तकनीकी विशेषज्ञता के (<1 एस) की जरूरत है। कब्जा कर लिया छवियों का एक बेहतर समाधान प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कारकों में एक ठंडा सीसीडी कैमरा, जगह में प्रतिदीप्ति फिल्टर और एक उच्च NA उद्देश्य 14 के उपयोग के चल रहा है। 1) ग्रिड के साथ सेल संस्कृति व्यंजन एक विशेष इंजेक्शन सेल भी गिलास नीचे व्यंजन उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए कल्पना करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं;: इसके अलावा, कुछ सुझाव उपयोगी के रूप में हो सकता है 2) यह microinjections शुरू करने से पहले 10-20 खींच लिया सुई बनाने के लिए सिफारिश की है, 3) के आधार पर प्रतिरोध का इलेक्ट्रोड टिप किया जा सकता है बहुत उपयोगी है, लोड हो रहा है micropipette के साथ डाई का उपयोग केशिकत्व से छू विंदुक टिप में डाई समाधान; 4) यह पिपेट के पूरे शरीर, कुछ microliters लोड करने के लिए टिप और 2 से 3 मिमी भरने के लिए ऊपर टिप के लिए पर्याप्त है आवश्यक नहीं है; 5) एक कम बढ़ाया लेंस के साथ प्रयोग शुरू और पिपेट दीवारों की छाया देखने के लिए प्रयास करें। बाद में, पिपेट संभव के रूप में और सेल को छूने से पहले के रूप में करीब ले जाते हैं, ऐसे 40x या अधिक से अधिक के रूप में उच्च बढ़ाई उद्देश्य के लिए पाली,; 6) कुछ समूह एक साँस microinjector का उपयोग करें। वायवीय इंजेक्शन सबसे अच्छा विकल्प है क्योंकि यह सटीक नहीं है और अज्ञात मात्रा इंजेक्षन सकता है नहीं है; एक नाड़ी के साथ प्रोटोकॉल डाई की एक ज्ञात मात्रा इंजेक्षन करने के लिए मानकीकृत किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह गहराई की वजह से cytosol ऊपर झिल्ली में सुई की सिफारिश की है; नाभिक ऊपर झिल्ली में इंजेक्शन यह घायल और सेल शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित कर सकता है। अंत में, कोशिकाओं है कि फ्लैट भी नहीं हैं फ्लैट लोगों पर बेहतर कर रहे हैं।
सारांश में, इस विधि के अंतराल जंक्शनों लेकिन जरूरत से कहनेवाला संचार अध्ययन करने के लिए प्रभावी हैविशेषज्ञता / अनुभव और अच्छी सामग्री और उपकरणों के उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए। हमें उम्मीद है कि इस लेख और वीडियो मदद शुरुआती समझते हैं और इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
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