Summary
Denne orthotopic modell av human prostatakreft muliggjør kvantifisering av tumorstørrelse, sirkulerende svulstceller, og dannelse av metastaser distinkt til lungen. Som celler må unnslippe den primære organ, inn i blodstrømmen, og implantat inn i en sekundær side, denne modellen sammenfatter effektivt scenariet hos mennesker.
Abstract
Vårt laboratorium har utviklet en ny orthotopic implantasjon modell av menneskelig prostatakreft (PCA). Som PCA døden skyldes ikke den primære tumor, men dannelsen av distinkte metastase, er evne til effektivt å modellere denne progresjon pre-klinisk er av høy verdi. I denne modellen, blir cellene direkte implantert i ventral flik av prostata i Balb / c atymiske mus, og lov til å utvikle seg i 4-6 uker. Ved terminering av eksperimentet, kan flere adskilte endepunkter skal måles, slik som størrelse og molekylær karakterisering av den primære tumor, tilstedeværelse og kvantifisering av sirkulerende kreftceller i blod og benmarg, og dannelse av metastaser i lungene. I tillegg til en rekke endepunkter, gir denne modell et bilde av et cellene evnen til å invadere og unnslippe primære organ, fyll og overleve i sirkulasjonssystemet, og implantatet og vokse i en sekundærside. Denne modellen har blitt brukt effektivt til å måle metastatiskrespons på både forandringer i protein ekspresjon, så vel som til svar på små molekyl legemiddel, i en kort behandlingstid.
Introduction
Prostatakreft (PCA) er den vanligste diagnosen kreft hos menn, og den nest største årsaken til kreftdød i USA en. Død av PCA er ikke på grunn av dannelsen av den primære tumor, men dannelsen av metastaser. Derfor er forebygging av metastaser hos pasienter med høy viktighet. Musemodeller av PCA tilby et mangfold av muligheter for å avdekke kritiske biologisk informasjon om denne sykdommen.
En rekke musemodeller av PCA eksisterer, hvert med iboende fordeler og begrensninger. Selv om frekvensen av PCA hos mennesker er høye, er naturlig forekommende PCA svært uvanlig hos mus 2, til tross for lik følsomhet hos mus samlet til kreft 3.. En gnager Unntaket er utviklingen av PCA i Lobund Wistar rotter, som kan oppnå priser av PCA av 90% ved 12 måneders alder via induksjon av methylnitrosourea og testosteron fire. Av denne grunn induseres modellsystemer, slik som TRAMP(Transgene adenokarsinom av musen prostata) modell blir ofte brukt. Den TRAMP modellen kan indusere transgene uttrykk spesielt i prostata, og gjennomgår normal progresjon av PCA, fra hyperplasia til prostatahyperplasi intraepitelial neoplasi (PIN) til lymfesystemet og lungemetastaser 5-6. Disse modellene gir fordelene med å være i stand til å måle et bredt spekter av tumorprogresjon, samt inneholder et intakt immun-system. Imidlertid kan de molekylære hendelser underliggende PCA utvikling skiller mellom mus og mennesker, og korrelasjoner mellom mus og kliniske studier har vist variabilitet. I tillegg er begge disse modellene er tidkrevende, som et eksempel på TRAMP modellen krever omtrent 28 uker for å utvikle metastasering.
I å studere metastasering, er ofte en hale-vene eller venstre ventrikkel injeksjon modell som brukes. Denne modellen fordelen av hurtig behandlingstid, og kan i tillegg måle tilstedeværelsen av bein metastaser ved hjelp av spesifikke cellelinjer og betingelser. Yang et al. Har rapportert at subkutan injeksjon av GFP-positive PC3 celler kan føre til mye spredt bein metastase 7, og halevenen og intercardiac injeksjoner har også generert bein metastaseutvikling 8-9. De store begrensninger av disse modellene er knyttet til mangel på en primærtumor som befinner seg innenfor prostata i seg selv. Videre, for modeller avhengige på injeksjon av cancerceller inn i sirkulasjonen, omgår denne hele første halvdel av metastatisk kaskade. Det utelukker dermed undersøkelse av første trinn, herunder invasjon gjennom den primære organ, som er biologisk viktige tiltak av metastatisk transformasjon. Mange regulatorer av metastatisk transformasjon direkte påvirke tidlig celle invasjon. Tidlige trinn i metastatisk kaskade utgjør høyt prioriterte områder for terapeutisk målretting, som når kreftceller spre, utvider klonal variasjon sterkt, og dermed øke biologiskal mangfold og avtagende effektiv terapeutisk målretting.
I et forsøk på å reagere på mange av begrensningene i disse modeller, har vårt laboratorium utviklet en orthotopic modell av human PCA hvori human PCA PC3-M cellelinjen er direkte implantert inn i prostata av Balb / c atymiske mus. Etter 4-6 uker, kan tumorstørrelse, tilstedeværelse av sirkulerende tumorceller (CTCS), og metastaser i lungene og lymfekjertlene alle bli kvantifisert. Vi har effektivt brukt denne modellen for å evaluere effekten av 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (genistein) for å hemme human PCA metastase 10. Kost forbruk av genistein har vært knyttet til reduksjon i prostatacancermetastase eller død 11-12, men har tidligere ikke studien hadde fastslått hvorvidt administrering av genistein kan endre PCA metastase hos dyr eller mennesker. I denne studien demonstrerte vi at behandling med genistein sterkt redusert antall lungemetastaser. I tillegg bestemmes vi genistein alholds aktivering og ekspresjon av flere viktige pro-metastatiske proteiner i den primære tumor, inkludert fokal adhesjon kinase (FAK), p38-mitogen-aktivert protein kinase (p38 MAPK) og varmesjokkprotein 27 (HSP27).
Disse resultatene samsvarer med observasjoner i klinikken. Ved hjelp av blod hentet fra mus, var vi i stand til å måle konsentrasjonene av genistein blod og observert disse til å være lik nivå hos mennesker med vanlig kostholdsråd for inntak av genistein. I tillegg, en fase II studie utført av vår gruppe bestemmes at ved behandling med genistein, menn opplevde nedgang i prostatavevet mRNA uttrykket av gener assosiert med mobilnettet invasjon og metastasering, spesielt matrise metalloproteinase type 2 (MMP-2) 13.
Vi har også benyttet denne modellen for å evaluere effekten av endret gen-produkt-uttrykk i den primære tumor på human PCA metastase 14. Svulsten dempetEssor endoglin er medlem av TGFβ super og undertrykker menneskets PCA cellulær invasjon in vitro via endring av Smad signale 15. Vi utvidet disse studier for å fastslå effekten av endoglin på menneskelig PCA metastasering. Stabil endoglin knockdown, vektor kontroll eller endoglin over uttrykk cellelinjer ble implantert i mus. Endoglin knockdown celler viste det høyeste antall lunge-metastase, samt CTCs i 38% av musene. Mus implantert med kontrollvektor viste en middels reaksjon, med mindre lungemetastase per mus, og CTCs i bare 18% av musene. Høy endoglin implantert mus viste nesten fullstendig undertrykkelse av lungemetastaser, og fullstendig undertrykkelse av CTCs.
Dette er bare to eksempler på det brede utvalget av applikasjoner denne teknikken har. Fra drug discovery, til modellering endringer i molekylær biologi, tilbyr denne modellen en høy gjennomstrømning metode for å vurdere effekten av ulike funksjoner på tumorvekst og muldvarpsielt endringer, tilstedeværelse av CTCs, og dannelse av distinkte metastaser i lunge og lymfeknuter.
Protocol
For alle prosedyrer som involverer dyr, ble protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Northwestern University. Kirurgiske teknikker og dyrepleieforhold ble observert av veterinær ansatte og modifisert for å minimere dyr stress eller dødelighet. Den enkelte institusjon kan ha ulike krav og det er viktig å jobbe med IACUC og dyr ansatte ved utvikling og gjennomføring av denne kirurgiske teknikken.
En. Utarbeidelse av celler for Injection
- Dette trinnet skal utføres så nært som mulig til å starte operasjoner. Trypsinize cellene blir brukt til forsøket, fjern fra plate, og nøytralisere med media. Den PC3-M PCA human cellelinje stabilt transfektert med GFP har blitt brukt for disse forsøk, på grunn av rask vekstbetingelser av PC3-M celler. GFP ble lagt for ekstra enkel påvisning av lungemetastaser i lunge vevsprøver, og hurtig bestemmelse avkreftceller mot immunceller i kulturer fremstilt fra blod og benmarg for å identifisere sirkulerende tumorceller. Ved å endre en spesifikk gen av interesse, og deretter dannelsen av stabile cellelinjer med dette genet endring utføres først, etterfulgt av transfeksjon med GFP. Hvis GFP vil endre funksjonen til dette genet av interesse, kan GFP det utelates. Dette vil gjøre påvisning av lungemetastase vanskeligere, men likevel kan oppnås. I tillegg, ved bruk av spesifikke avbildningsteknologi ved hjelp av fluorescerende markører, slik som luciferase-baserte IVIS, andre fluorescerende proteiner kan brukes i stedet.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 225 x g.
- Isoler 2,5 x 10 5 celler og sentrifuger i 5 minutter ved 225 x g.
- Fjern supernatanten og resuspender celler i 20 mL sterilt saltvann.
- Aspirer cellesuspensjonen i en 0,5 ml sprøyte med en permanent 28 ½ G kanyle (anbefalt: Kendall Monojet, som andre merker har forårsaket problemer), noe som sikrer ingen luft kommer inn nålen along med suspensjon.
- Pakk sprøyte i sterile folie og oppbevares på is til det brukes.
2. Orthotopic Implantasjon av menneskelige prostata kreft celler
- Male 6-8 uker gamle Balb / c atymiske mus brukes. Den ideelle musekroppsvekt for operasjonen er 19 til 21 g, og musene bør få lov til å øke til i det minste 18 g før kirurgi. Mindre dyr er teknisk vanskeligere å operere på. Større dyr har en tendens til å oppleve tregere kinetikk av tumorvekst og metastasering. Dyr bør være plassert i dyrefasilitet i minst en uke før kirurgi for å minimalisere dyret stress. Avhengig av den eksperimentelle utførelse kan behandling begynner en uke før kirurgi.
- Injisere pre-kirurgi smertestillende medikamenter i henhold til dyr anleggets instruksjoner. 0,1 mg / kg kroppsvekt subkutant Buprenex ved hjelp av en 30 ½ G nål festet til en 1 ml sprøyte er foreslått.
- Plasser dyrene inn i isofluran kammeret og vente til dyr er fullt ennesthetized. Ingen tå refleks av muskeltonus bør være til stede ved dette tidspunkt. Denne metoden er anbefalt, men hvis tilgjengelig, kan andre metoder for anestesi brukes i henhold til dyr anleggets instruksjoner.
- Beveg dyret ut av isofluran kammeret i en steril prosedyre hette. Plasser dyret inn i nesepartiet apparat, og re-sikre at dyret er under full bedøvelsen før fortsetter.
- Desinfiser nedre mageregionen med en Betadine skrubb med sterile bomullsdotter, tørk med alkohol tørk, og endelig spray med Betadine løsning. La det tørke.
- Bruk enten en steril skalpell eller skjerpet sterile kirurgiske saks, en lav midtlinje abdominal snitt på ca 3-4 mm er gjort. Løft forsiktig blæren ved hjelp av pinsett og identifisere ventral flik av prostata. Disse to fliker er plassert direkte under blæren. Noen mus vil ha et lite lag av fett som dekker prostata som kan lett flyttes til side ved hjelp av en steril vattpinne. Minimaliseringe all bevegelse av organer og muskulaturen hvis mulig.
- Injisere 20 ul volum celle løsning inn i prostatakjertelen, minimere lekkasje og sikre en liten boble er observert.
- Bytt blære og lukke muskelen laget ved hjelp av 4,0 absorberbare Vicryl monofilament suturene i en enkel avbrutt mønster.
- Lukk hudlaget med sterile 9 mm stifter.
- Fjern dyr fra isoflurananestesi og overvåke inntil våken og beveger seg normalt. Plasser på varmepute under utvinning perioden.
- Hvis flere operasjoner blir utført, mellom operasjoner, rene alle verktøy med 70% etanol, og sterilisere med et glass perle sterilisator. Tillate verktøy for å kjøle fullt før neste dyr. Ikke bruk sting, bomull baller, eller sterile kompresser.
Tre. Overvåking Dyr
- Administrere smertestillende medisiner basert på animalsk anleggets instruksjoner. 4 timer post-kirurgi for administrering av en dose av subkutan Meloxicam ved 1 mg / kg kroppsvekt using 30 ½ G nål festet til en 1 ml sprøyte er foreslått, etterfulgt av en ytterligere dose hver 12 til 24 timer for den neste 48 timer.
- Staples kan fjernes fra dyrene 7-10 dager etter kirurgi etter at såret er grodd.
- Monitor dyrets vekt, matinntak, og palpere mus for svulster to ganger i uken frem til avslutning av forsøket. Øk frekvens opp til annenhver dag når svulster bli synlig for å se etter dyr under betydelig tumormasser eller tvang. For tidlig død av denne modellen er på grunn av det store primærtumorbyrde, som primære tumorer kan blokkere urinstrøm, slik at eventuelle dyr med et tap på mer enn 15% av kroppsvekten eller en primær tumor nådde en diameter på 1,5 cm bør obdusert umiddelbart forebygge urinveisobstruksjon og dyr død.
- Skjerm etter behov for ytterligere anrikning av dyret miljø. Stresset av kirurgi øker dyr stridigheter. Tilføyelsen av to plasthytter per bur i stedet for en og ytterligere opptredenal berikelse kan redusere disse hendelsene. Diskuter med veterinær ansatte alternativer tilgjengelig på anlegget dyrene er plassert på. Gitt mangelen på øyevipper på denne stamme av mus, er hytter og berikelse av papir anbefales ikke som de kan irritere øynene.
4. Obduksjons Prosedyrer
- Etter 4-6 uker, svulster er fullt tydelig og dyr begynner å gå ned i vekt på grunn av økt tumormasser. Svulster kan typisk være palperes og / eller er visuelt synlig. Obduksjon skal utføres på dette punktet. Utfør en intraperitoneal injeksjon av Nembutal ved 260 mg / kg kroppsvekt ved bruk av en 30 ½ gauge nål festet til en 1 ml sprøyte, og tillater dyrene å bli helt bevisstløs, uten tå reflex eller muskeltonen er tilstede.
- Når dyret er bedøvet, ved hjelp av sterile kirurgiske saks eller en skalpell, kuttet horisontalt over torso av dyret direkte under brystkassen, og deretter vertikalt til armhulen langs siden av dyret, Blottlegge hjertet. Utfør en terminal hjertepunktur ved hjelp av en 30 ½ G nål festet til en 1 ml sprøyte spylt med 4% natrium-citrat i DPBS for å hindre koagulering, å skaffe så meget blod som mulig fra dyret.
- Fjern lungene fra dyret ved å kutte luftrøret med kirurgisk saks eller en skalpell og umiddelbart plassere inn i en vev kultur kassett og inn i 10% formalin.
- Fjern det primære prostatatumor fra dyret ved individuelt å kutte noen blodkar som er knyttet til tumoren, og sikrer ingen ytterligere organer som vas deferens eller sædblærene er festet.
- Noter vekt og størrelsen på svulsten. Måle vekten av svulsten i gram i laboratoriemålestokk. Ved hjelp av målepunkter, å måle lengden av den lengste diameter av tumoren i cm, og tilsvarende vinkelrette akse. Multipliser disse verdiene for å få tumorstørrelse. Avhengig av tiltenkt bruk, straks feste fryse i flytende nitrogen, og / eller plass itil en vev kassett i 10% formalin.
- Expose hofte-og kneledd med kirurgisk saks eller en skalpell, og koble beinet leddene, er forsiktig med å holde femur intakt. Fjern lårben fra dyret og fyll i sterilt saltvann.
- Skaffe adgang til andre organer eller materiale av interesse, og kast dyr i henhold til instituttets instruksjoner. Spesielt regionale lymfeknuter tendens til å ha metastasering, har en tendens til å bli utvidet dersom husing dem, og kan høstes. Imidlertid bør man være forsiktig, da dette kan bli påvirket av endringer i hydrostatiske trykket forårsaket av den kirurgiske prosedyren.
5. Bearbeiding og Immunostaining av lungevev Samples
- Innen 24-48 timer for å plassere vevet inn 10% formalin i PBS, legge ned lungene til parafin.
- Seksjon lungene ved 45 mikrometer trinn seksjoner, tar 2-3 tilstøtende fire mikrometer lunge vev seksjoner.
- Hvis GFP-positive celler ble brukt (anbefales), utføre fargingfor GFP. Hvis ikke, utføre standard hematoxylin og eosin (H & E) flekker.
MERK: Dako Envision + Kit kombinert med GFP antistoff fra Invitrogen har vært brukt med hell i henhold til produsentens instruksjoner, men dette kan endres til enhver immunhistokjemi prosedyre.
- Resultat metastasering i en blindet måte. Hvis GFP-positive, vil kreftceller flekker brun i tillegg til å ha store og særegne kjerner. Når første scoring metastasering, ta kontakt med en patolog for å sikre korrekt scoring, og bruke H & E beiset lungevev å bekrefte tilstedeværelse av kreftceller, og ikke infiltrere immunceller.
6. Identifisering av sirkulerende tumorceller fra blod og benmarg
- Legg alt blod oppsamlet fra obduksjon til et 1,5 ml sentrifugerør. Sentrifuger i 5 min ved 800 x g.
- Ta av plasma og tilsett 1 ml ACK Lysis Buffer (154,95 mM salmiakk, 9,99 mm Kalium BicarboNate, 0,0995 mM EDTA,). Tillater blodet å sitte ved værelsetemperatur i 3-5 min.
- Sentrifuger i 5 min ved 800 x g.
- Fjern supernatanten og tilsett 1 ml av cellekulturmedier inneholdende antibiotika. Til cellene til en T75 kolbe inneholdende 9 ml av cellekulturmedier.
- Kultur-celler ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO 2 i 10 dager, se etter tilstedeværelsen av CTCs hver 2-3 dager.
- For benmarg, fjerne all muskelvev fra lårben ved hjelp av en saks, et barberblad eller skalpell. Fjern ende av benet, så nær endene som mulig.
- Ved hjelp av en 23 ¾ G nål, forsiktig løse ut benmarg fra femur i en 1,5 ml sentrifugerør.
- Legg til en ml av cellekulturmedier og forsiktig pipette godt å blande.
- Til cellene til en T75 kolbe inneholdende 9 ml av cellekulturmedier.
7. Molekylær karakterisering av svulster
- For polymerase kjedereaksjon (PCR)-analyses, er tumorprøver som var snap frosset i flytende nitrogen først pulveriseres på tørris og deretter homogenisert ved hjelp av en vev-homogenisator i 3-5 min med 1 ml TRIzol. TRIzol utvinning er utført i henhold til produsentens instruksjoner. Rense RNA bruker RNeasy RNA isolering kit i henhold til produsentens instruksjoner. Utføre cDNA syntese og kvantitativ real-time PCR (QRT / PCR) med TaqMan reagenser i henhold til produsentens instruksjoner er anbefalt, men kan endres for alle PCR-metoden for tiden ansatt.
- For Western blot-analyser, homogenisere vevet ved hjelp av en vev-homogenisator i 3 til 5 minutter med 1 ml lyseringsbuffer: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na fosfat, 2,7 mM KCl), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, 2,5 mM natrium-pyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat, med tilsetning av protease inhibitor cocktail, fosfat inhibitor cocktail 2 og 3, 10 mM natriumfluorid, og 1 mM natrium-orthovanadate. Den cellelysat blandingen er plassert i et 1,5 ml sentrifugerør.
- Centrifuge cellelysat blandingen i 10 min ved 13 000 x g.
- Fjern supernatant og legges i et nytt 1,5 ml sentrifugerør og sentrifugert på nytt i 10 min ved 13 000 x g. Hvis celleavfall er fortsatt til stede, kan en ytterligere sentrifugeringstrinn utføres.
- Fjern supernatanten og utføre en Western blot som per normale laboratorieforhold.
Representative Results
For dette forsøket, viser vi en representativ gruppe av mus som oppnås i løpet av disse operasjoner. Fem mus ble implantert med GFP-positive PC3-M celler som inneholder en kontrollvektor. Svulster ble tillatt å vokse i seks uker og deretter flere parametere ble vurdert. På figurene 1A og 1B, kan vi vise endring i kroppsvekt og matinntak hos mus, respektivt. Det er et lite fall i kroppsvekt og matforbruk rundt tidspunktet for kirurgi på grunn av anestesi. I løpet av forsøket, kroppsvekt langsomt øker etter kirurgi, og begynner å avta mot slutten av forsøket som tumorbelastning når et kritisk nivå da. Dette er avstemt med matforbruket i disse musene.
I figurene 2A og 2B, er representative tumorstørrelser som oppnås er vist. Enkelte kreft størrelser varierer, men i gjennomsnitt oppnår vi svulster av ca 1 gram, mednormal avviket mellom 0,5-1,5 g, og en tumorstørrelse på 1 cm 2, med en normal variasjon av 0,5-1,5 cm 2. Selv om størrelsen på svulster varierer, disse ikke korrelerer med antall resulterende metastasering, vist både i denne artikkelen og våre tidligere publiserte arbeider 10. Imidlertid, i denne modellen, kan man bestemme effekten av medikamentbehandling eller molekylære endringer i tumorvekt og størrelse. En viktig faktor i denne modellen er når den aktuelle endepunktet for eksperimentet er. I figurene 2C og 2D viser vi endringer i tumorvekt og tumorstørrelse i en bestemt PC3-M cellelinje stabilt transfektert med GFP og en kontrollvektor etter 4 uker og 6 uker etter. I løpet av de siste to ukene, økte den gjennomsnittlige tumorvekt 2,7 ganger, og tumorstørrelse 1,9 fold. Dette viser at tilsetning av 1-2 ekstra uker på eksperimentet kan dramatisk påvirke resultatene. Som et mangfold av faktorer som kan endre veksten av tumorer, inkludertalder og størrelse på mus, antall passeringer av cellene, etc. vi ikke anbefaler å avslutte eksperimenter før synlige svulster er observert i de fleste musene.
I figurene 3A-3C, er antallet av metastaser kvantifisert tre forskjellige måter. I figur 3A, er representert det totale antall GFP-positive humane celler PCA. I Figur 3B, antall celle loci, eller steder der metastatisk innskudd er til stede, blir vist. Til slutt, i figur 3C, antallet distinkte metastasering, som definert av et klart bundet gruppe av celler som viser fem eller flere GFP-positive humane PCA-celler, er vist. Representative bilder av disse forskjellige betingelser er vist i figur 4A-4D. I figur 4A, er en individuell celle ved 40x magnitude markert med en pil. Legg merke til den brune flekker og store tydelige kjerner. En tilstøtende lunge delen farget med H & E flekkerer vist i figur 4B, noe som bekrefter at uten GFP, er påvisning av kreftceller fortsatt lett oppnåelig. Dette bildet er tatt på 40x magnitude og cellen er markert med en pil. I figur 4C, er flere loci av varierende celle nummer på 10x magnitude vises og hvert locus uthevet med en pil. . Til slutt, i figur 4D, er et metastatisk deponering av 10 celler er vist. Hvordan disse metoder påvirker dataene er vist ved forskjeller i mus 1 mus og tre. Mus 1 har et lavere antall av totale celler i lungen, med et gjennomsnitt på 21,5 celler per lunge seksjonen, sammenlignet med mus 3 som har et gjennomsnitt på 700 celler per lunge-delen. Imidlertid har Mouse tre færre loci, eller steder der celler er til stede enn Mouse en. Mus 3 har relativt få områder av metastaser, men antall celler pr området er meget høy på 82 celler pr loci på grunn av flere meget store celletallmetastaser. I kontrast til mus 1 har flere unike loci, men betydelig fEwer celler per plassering på bare et gjennomsnitt på to celler per sted. Disse ulike parametere kan belyse kinetikken av celler trafficking til lungene og deres evne til å begynne å vokse og spre seg.
I tillegg, i figur 3D, viser vi forandringer i totalt metastatiske celler per lunge hos mus obduksjon ved fire versus seks uker. Som beskrevet i figurene 2C og 2D, er signifikante endringer ble observert i tumorvekt og størrelse i de siste to ukene av et eksperiment. Dette er recapitulated i figur 3D. Mus obduksjon ved fire uker, viste ingen metastatisk utvikling, mens mus ved 6 uker viste metastatiske celler i alle evaluerte mus. Dette viser videre viktigheten av å sikre muse necropsies utføres på et sent stadium endepunktet for å sikre dannelsen av metastasering har oppstått.
En tilleggsmåling i denne modellen er molekylære endringer som forekommer inne i primærtumor. I figurene 5A-5C viser tre eksempler vi QRT / PCR-eksperimenter som måler tre gener som er av interesse i metastatisk progresjon, matriksmetalloproteinase type 2 (MMP-2), matriksmetalloproteinase typen 9 (MMP-9), og varmesjokkprotein 27 (HSP27) respektivt. Enhver genet av interesse målt via QRT / PCR kan oppdages ved hjelp av denne teknikken. I tillegg kan proteinnivåer kvantifiseres ved hjelp av Western-blot-fremgangsmåten.
Figur 1. Observert kroppsvekt og matforbruket i dyr. AB) Kroppsvekt i gram, eller gjennomsnittlig matforbruk per mus per dag i gram, registreres gjennom hele forsøket og vist i A) og henholdsvis B).
fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg "/>
Figur 2. Tumorstørrelse og tumorvekten i individuelle og grupper av mus. AB) Tumorvekt i gram og tumorstørrelse i cm kvadrat av fem representative kontroll-mus og gjennomsnittet av de fem musene ved slutten av seks uker, er vist i A) og B), respektivt. CD) En sammenligning av tumorvekten i gram, og tumorstørrelse i centimeter kvadrat mellom grupper av mus obduksjon ved fire og seks uker. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Metastatisk spredning i individuelle og grupper av mus. AC) Den gjennomsnittlige metastatisk spredd,d per lunge-delen i fem individuelle mus og gjennomsnittet av de fem musene ved slutten av seks uker representert som enten totale antall celler (A), plassering av metastatiske celler (B), eller distinkte metastase som definert ved 5 +-celler i en klart definert klynge (C). D) En sammenligning av gjennomsnittlig antall metastatiske celler per lunge seksjon per mus mellom mus obduksjon ved fire og seks uker. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Representative bilder av lungemetastaser. A) En person GFP positive lunge celle på 40X objektiv er merket med en pil. B) En tilstøtende lungeavsnitt fra A), som viser den samme cellen under H & E flekker. C) En lunge delen på 10X objektiv med sju individuelle loci inneholder varierende antall celler. D) En tydelig metastasering på 10X objektiv som inneholder 10 kreftceller klart definert som en gruppe.
Figur 5. PCR analyse av tre metastatisk gener av interesse. QRT / PCR ble utført på individuelle tumorprøver innsamlet fra mus på seks uker. Relative mRNA-transkript nivåer av MMP-2 (A), er MMP-9 (B), og HSP27 (C) måles, normalisert til GAPDH. for å vise større figur .
Discussion
I denne artikkelen gir vi en roman murine modell av menneskelig PCA metastasering. I denne modellen, er den menneskelige PCA cellelinjer PC3-M orthotopically implantert direkte i prostata av Balb / c atymiske mus og svulster får utvikle seg i 4-6 uker. I den representative resultater delen, viser vi eksempler på data som kan samles, inkludert musevekt og matforbruk, tumorstørrelse og vekt, molekylære egenskaper av svulsten, og dannelse av metastaser distinkt til lungen. I tillegg kan en rekke ytterligere utganger bli studert, avhengig av spesielle forskningsinteresse. Et eksempel er tilstedeværelsen av CTCs til blod og benmarg. Som CTCs er en relativt sjelden hendelse (vi observerer CTCs i ca 5-20% av kontrolldyrene), var vi ikke overrasket over at ingen av de fem mus i disse forsøkene utviklet CTCs. Vårt laboratorium har også brukt denne modellen til å oppfatte endringer i cellulær adhesjon ved å måle kjernefysisk cellemorfologi iprostatavevet 10. Vi har også brukt denne modellen til å vurdere primærtumor spredning og apoptose status ved hjelp av Ki67 og TUNEL farging av prostata svulst 14.
I tillegg til det store utvalg av datautganger som kan oppnås, kan denne modellen kan brukes til å bestemme virkningen av begge forandringer i protein ekspresjon, så vel som små molekyl terapeutika. Sammenlignet med mange spontane og induserte modeller av human PCA metastasering, er det en høyere behandlingstid på bare 4-6 uker. Andre modeller med en høy behandlingstid, slik som halevenen eller intercardiac injeksjon modeller, har begrensninger av noen primære svulsten, og dermed ikke fullt rekapitulere klinikken metastatisk kaskade. I vår modell, må kreftceller unnslippe det primære stedet for opprinnelse, inn og overleve sirkulasjonssystemet, og implantat inn i en sekundær stedet. Dette gir ekstra trinn på som en terapeutisk intervensjon eller endring i protein uttrykk kunne levere en effekt. Addinalt, bør nærvær av den primære tumor tillater enkel anvendelse av denne modell for nye avbildningsteknologier slik som luciferase-baserte IVIS 16-17.
Til tross for det store utvalget av fordelene med denne modellen, er det også flere begrensninger for å vurdere. Et økende antall studier viser betydningen av immunsystemet i tumoren mikromiljøet, og utvikling av metastasering 18.. I denne modellen, som følge av bruken av en atymisk gnagere, er det ikke mulig evne til å vurdere virkningene av immunsystemet. En annen begrensning er mangelen på androgen respons i PC3-M celler. Ved første diagnose av PCA, pasienter ofte vil gjennomgå androgen terapi som en førstelinjebehandling. Imidlertid vil pasientene til slutt bli androgen-resistente svulster og vil begynne å vokse igjen. Som PC3-M celler mangler androgen reseptoren, denne modellen kun måler effekten av medikamentell behandling eller protein modulering på post-androgen motstandsdyktig cancer. Selv om dette er en begrensning, er androgen-responsive PCA tiden godt håndterlig, og har en rekke effektive behandlingstilbud, og dermed androgen-resistente kreft har blitt mer fremtredende studert. Denne modellen har også spesifikt bruker en innavlet stamme av mus, noe som minimerer mus til mus variabilitet. Imidlertid kan denne belastningen være spesielt lydhør overfor spesielle proteiner eller små molekyler, og dermed omsorg bør tas når ekstrapolere disse dataene til klinikken.
Selv om denne modellen gir en effektiv måling av legemidlets effekt i en hurtig behandlingstid på 4-6 uker, kan det ikke ta hensyn til langtidsmedikamentdoserings effekter. Etter lengre tids eksponering for mange tilgjengelige behandlinger, kan pasientene tilbake med mange år etter behandling resistente kreftformer. Den raske snuoperasjon av denne teknikken ikke tillater effektiv modellering av muligheten for en svulst å bli resistente mot en behandling. Men med modulering av denne exForsøket kan behandlingsresistente humane prostatakreftceller implanteres, og effektiviteten av et andregenerasjons terapeutisk for å hindre PCA tumorvekst og metastasering kan modelleres. I tillegg, hvis en gruppe forsøkte å studere molekylære endringer i en primærtumor over tid, en mer langsiktig modell som TRAMP modellen vil sannsynligvis være mer effektive for disse studiene.
En annen begrensning av denne modellen er formidling av distinkte metastaser kun til lymfeknuter og lunger av dyrene. Begge disse områdene er hyppige og klinisk relevante områder av metastasering, som demonstrert av menneskelig varme obduksjon studier 19. Imidlertid utgjør klinisk bein metastase et fremtredende trekk ved menneske PCA, og dermed modellene rekapitulere dette er av interesse. Dessverre er dette vanskelig å rekapitulere i en musemodell, med svært få modeller som viser beinmetastaser uten hale vene, intercardial injeksjon, eller direkte implantasjon itil beinet 20. Således hvis målretting til benet er av sentral betydning eksperimentelt, kan en annen modell være mer effektive. Men denne modellen gir en viss grad av trafikk til benet i form av benmarg sirkulerende tumorceller.
Til tross for disse begrensninger, er denne teknikken en kraftig modell av human PCA. Evnen til å måle virkningene av både den primære tumor og metastatisk formasjonen i en kort behandlingstid gir et bredt spekter av anvendelser. I denne modellen, må celler unnslippe det primære organet, inn og overleve i blodet, og implantat i en sekundær side, rekapitulere prosessen hos mennesker. Den ytterligere måling av molekyl egenskapene av den primære tumor, endringer i cellemorfologi, og tilstedeværelse av sirkulerende tumorceller gir et bredt pust av informasjon fra en modell. Denne fremgangsmåten kan anvendes både i forbindelse med medisiner, samt til å studere forandringer i tumorbiologi.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) til RCB, CA122985 og prostata SPORE CA90386, og til JMP, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery Opplæring i Age-Related Disorders", og ved Walter S. Og Lucienne Driskill Graduate Program i miljø-og biovitenskap ved Northwestern University. Vi vil også gjerne takke Mouse fenotyping og Histologi Laboratory og patologi Kjerne Facility ved Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| 23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
| 30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
| Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
| Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
| Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
| Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
| Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
| Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4") | VWR | 95039-192 | |
| Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
| Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
| Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
| Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2") | VWR | 94000-000 | |
| Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
| PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27" | Ethicon | Z304H | |
| VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
| VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
| VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2") | VWR | 82027-440 | |
| Reagents | |||
| Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
| Buprenex | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
| Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
| Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
| Formalin | VWR | 95042-908 | |
| GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
| Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
| Nembutal | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
| Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
| Trizol | Invitrogen | 10296 | |
References
- Jemal, A., et al.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64, 2270-2305 (2004).
- Rangarajan, A., Weinberg, R. A. Opinion: Comparative biology of mouse versus human cells: modelling human cancer in mice. Nat. Rev. Cancer. 3, 952-959 (2003).
- Pollard, M. Lobund-Wistar rat model of prostate cancer in man. Prostate. 37, 1-4 (1998).
- Gingrich, J. R., et al. Androgen-independent prostate cancer progression in the TRAMP model. Cancer Res. 57, 4687-4691 (1997).
- Gingrich, J. R., et al. Metastatic prostate cancer in a transgenic mouse. Cancer Res. 56, 4096-4102 (1996).
- Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, 781-786 (1999).
- Wu, T. T., et al. Establishing human prostate cancer cell xenografts in bone: induction of osteoblastic reaction by prostate-specific antigen-producing tumors in athymic and SCID/bg mice using LNCaP and lineage-derived metastatic sublines. Int. J. Cancer. 77, 887-894 (1998).
- Dolman, C. S., et al. Suppression of human prostate carcinoma metastases in severe combined immunodeficient mice by interleukin 2 immunocytokine therapy. Clin. Cancer Res. 4, 2551-2557 (1998).
- Lakshman, M., et al. Dietary genistein inhibits metastasis of human prostate cancer in mice. Cancer Res. 68, 2024-2032 (2008).
- Messina, M. J., Persky, V., Setchell, K. D., Barnes, S. Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data. Nutr. Cancer. 21, 113-131 (1080).
- Adlercreutz, H., Markkanen, H., Watanabe, S. Plasma concentrations of phyto-oestrogens in Japanese men. Lancet. 342, 1209-1210 (1993).
- Xu, L., et al. MEK4 function, genistein treatment, and invasion of human prostate cancer cells. J. Natl. Cancer Inst. 101, 1141-1155 (2009).
- Lakshman, M., et al. Endoglin suppresses human prostate cancer metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 28, 39-53 (2011).
- Craft, C. S., Romero, D., Vary, C. P., Bergan, R. C. Endoglin inhibits prostate cancer motility via activation of the ALK2-Smad1 pathway. Oncogene. 26, 7240-7250 (2007).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , e1210 (2009).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. J. Vis. Exp. , e2125 (2010).
- Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Osteotropic cancers: from primary tumor to bone. Cancer Lett. 273, 177-193 (2009).
- Rubin, M. A., et al. Rapid ("warm") autopsy study for procurement of metastatic prostate cancer. Clin. Cancer Res. 6, 1038-1045 (2000).
- Singh, A. S., Figg, W. D. In vivo models of prostate cancer metastasis to bone. J. Urol. 174, 820-826 (2005).
