Summary
Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti.
Abstract
Eritropoiesi nei mammiferi si conclude con il drammatico processo di enucleazione che si traduce nella formazione dei reticolociti. Il meccanismo di enucleazione non è stato ancora completamente chiarito. Un problema comune riscontrato quando si studia la localizzazione delle proteine chiave e strutture all'interno erythroblasts enucleare mediante microscopia è la difficoltà di osservare un numero sufficiente di cellule in fase di enucleazione. Abbiamo sviluppato un protocollo di analisi romanzo utilizzando multiparameter imaging cellulare ad alta velocità del flusso (Multi-Spectral Imaging citometria a flusso), un metodo che combina microscopia a immunofluorescenza con citometria a flusso, al fine di individuare in modo efficiente un numero significativo di eventi enucleare, che permette di ottenere misure ed eseguire analisi statistiche.
Per prima cosa descriviamo qui due vitro l'eritropoiesi metodi di coltura in utilizzati per sincronizzare erythroblasts murini e aumentare la probabilità di catturare l'enucleazione al secoloe momento della valutazione. Poi, si descrive in dettaglio la colorazione degli eritroblasti dopo la fissazione e permeabilizzazione per studiare la localizzazione delle proteine intracellulari o raft lipidici durante l'enucleazione dal flusso di imaging multispettrale citometria. Insieme con dimensioni e DNA/Ter119 colorazione che vengono utilizzati per identificare gli eritroblasti ortocromatiche, utilizziamo i parametri "rapporto" di una cella nel canale in campo chiaro che aiuta nel riconoscimento delle cellule allungate e "delta baricentro XY Ter119/Draq5 "che permette l'identificazione di eventi cellulari in cui è molto distanti dal centro di DRAQ5 colorazione (nucleo fase di estrusione) al centro di Ter119 colorazione (reticolociti nascente), indicando così una cella per enucleate. Il sottoinsieme della popolazione ortocromatica eritroblasto con l'alta baricentro delta e basso rapporto d'aspetto è altamente arricchito in enucleare cellule.
Introduction
Differenziazione terminale all'interno della linea eritroide nei mammiferi si conclude con il drammatico processo di enucleazione, attraverso il quale il eritroblasti ortocromatica espelle suo nucleo membrana-incassato (pyrenocyte) 1, generando un reticolociti 2. L'esatto meccanismo di questo processo, che è anche il fattore limitante di successo, su larga scala, la produzione di globuli rossi in vitro, non è ancora completamente chiarito. La localizzazione di proteine chiave e strutture all'interno eritroblasti enucleare si basa sull'utilizzo di microscopia a fluorescenza ed elettronica 3-5. Questo processo noioso provoca tipicamente l'identificazione di un numero limitato di eventi enucleazione e non sempre consente l'analisi statistica significativa. Espansione su un metodo di identificazione eritroblasto descritto in precedenza da McGrath et al. 6, abbiamo sviluppato un nuovo approccio per identificare e studiare gli eventi enucleazione da Ima Multi-Spectralging Citometria a Flusso (imaging multiparametrico ad alta velocità cella in flusso, un metodo che combina microscopia a fluorescenza con citometria a flusso) 7, che può fornire un numero sufficiente di osservazioni per ottenere misure ed effettuare analisi statistiche.
Qui, descriviamo primi due vitro eritropoiesi metodi di coltura in utilizzati per sincronizzare eritroblasti e aumentare la probabilità di catturare enucleazione al momento della valutazione. Poi descriviamo in dettaglio la colorazione degli eritroblasti dopo fissazione e permeabilizzazione per studiare la localizzazione delle proteine intracellulari o raft lipidici durante l'enucleazione dal flusso di imaging multispettrale citometria.
I campioni vengono eseguiti su un flusso di immagini citometro e le cellule raccolte sono gated appropriato per identificare eritroblasti ortocromatiche 6. Eritroblasti ortocromatiche vengono poi analizzati in base al loro rapporto di aspetto, come misurato in campo chiaro imaging, contro il loro valore per il parametro delta centroide XY Ter119-DNA, che è definita come la distanza tra i centri delle aree colorate per Ter119 e DNA, rispettivamente. La popolazione di cellule con basso rapporto di aspetto e di alta baricentro delta XY Ter119/DNA è altamente arricchito in enucleare cellule. Utilizzando wild-type (WT) eritroblasti contro eritroblasti con delezione Mx-Cre mediata condizionale di Rac1 on Rac2 - / - o combinati Rac2 - / -; Rac3 - / - background genetico e questo protocollo di analisi romanzo di flusso di imaging multispettrale citometria, abbiamo recentemente dimostrato che enucleazione assomiglia citochinesi asimmetrico e che la formazione di un anello actomyosin regolata in parte da Rac GTPasi è importante per la progressione enucleazione 7.
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Protocol
1. Lungo termine in vitro Cultura eritropoiesi (ex vivo differenziamento eritroide Cultura protocollo da Giarratana et al. 8, modificato e adattato per cellule di topo)
Si tratta di una prospettiva a lungo termine in 3 step nel protocollo eritropoiesi vitro. Nella prima fase (0-4 giorni) 2 x 10 5 cellule / ml vengono posti in un terreno di crescita eritroblasti supplementato con fattore delle cellule staminali (SCF), interleuchina-3 (IL-3), e l'eritropoietina (EPO). Nella seconda fase (5-6 giorni), le cellule sono risospese in 2 x 10 5 cellule / ml e co-coltivati su cellule stromali aderenti (MS5) in terreno di crescita fresco eritroblasti, completata solo con Epo. Nella terza fase (7-9 giorni), le cellule sono coltivate su uno strato di MS-5 cellule nel mezzo di crescita fresco eritroblasti senza citochine massimo di enucleazione (Figura 1A).
Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC) diHospital Medical Center Pediatrico di Cincinnati.
- Raccolta di ossa e isolamento delle cellule del midollo osseo a bassa densità
- Aggiungere 2 ml IMDM sterile contenente siero bovino fetale 2% (FBS) in una provetta conica da 15 ml e tenere in ghiaccio.
- Euthanize un 2-6 mesi di tipo selvatico topo C57/BL6 (con o senza il mouse geneticamente mirata di interesse) seguendo il protocollo istituto approvato (ad esempio CO 2 inalazione, seguita da dislocazione cervicale).
- Isolare ossa del bacino, femore e tibia di entrambe le gambe con pinze e bisturi, aggiungerli alla provetta contenente IMDM +2% FBS e tenere in ghiaccio.
- Aggiungere 1 ml di IMDM +2% FBS in una provetta sterile citometria a flusso e ossa a filo con pinze e una siringa tubercolina con un 25-G x 5/8 "ago. IMDM Flush +2% FBS attraverso le ossa un paio di volte delicatamente ( aspirando ~ 500 microlitri della sospensione cellulare e lavando nuovamente attraverso l'osso), e raccogliere le cellule del midollo osseo nel flusso-cytometrtubo y. Flushing è completa quando le ossa appaiono bianche.
- Filtro cellula-sospensione attraverso un insieme filtro cella 40 micron sulla cima di una provetta conica da 50 ml. Lavare filtro cella con IMDM +2% FBS e usando lo stesso mezzo regolare il volume finale della sospensione cellulare a 5 ml.
- Preparazione delle cellule del midollo osseo a bassa densità (LDBM) dal gradiente di densità centrifugazione: strato attentamente i 5 ml di sospensione cellulare in 5 ml di separazione cellulare pendenza media densità 1.083 g / ml in un tubo da 15 ml e centrifugare a 750 xg per 25 min a temperatura ambiente (RT) senza accelerazione freno / bassa.
- Trasferire il surnatante (tutto fino a circa il marchio 2 ml di tubo da 15 ml per acquisire buffy coat) in un tubo da 15 ml ed eseguire un altro lavaggio con IMDM +2% FBS a 525 xg per 5 min a RT.
- Aspirare il surnatante e lisare tutte le rimanenti globuli rossi (RBC) sospendendo il pellet in 3 ml di tampone di lisi RBC per 5 minuti a temperatura ambiente. Se una maggiore purezza di erythroblasts èrichiesta alla fase finale (ad esempio per studi biochimici), purificare le cellule LDBM ulteriormente in questa fase alle cellule neg Lin da separazione magnetica.
- Ex vivo differenziamento eritroide protocollo cultura partendo da LDBM o cellule neg Lin (Figura 1A)
- Aggiungere 7 ml IMDM +2% FBS, centrifugare a 525 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e sospendere nuovamente le cellule pellet in 2 ml di mezzo di crescita eritroblasto (EGM), composto da:
un. StemPro-34 medio, contenente
b. 2,6% StemPro-34 medio supplemento,
c. 20% BIT-9500,
d. Solfato 900 ng / ml ferrosi,
e. 90 / ml di nitrato ferrico ng,
f. 100 unità / ml di penicillina / streptomicina, 2 mM L-glutammina
g. 10 -6 M idrocortisone
h. e citochine appena ha aggiunto:
i) 100 ng / ml SCF,
ii) 5 ng / ml di IL-3, e
iii) 3 UI / ml Epo. - Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatico o manualmente in un microscopio con un orloocytometer.
- Piastra in una piastra di coltura cellulare da 6 pozzetti ad una concentrazione di 5 x 10 5 cellule / pozzetto a un volume finale di 2,5 ml in EGM (2 x 10 5 cellule / ml LDBM) e incubare a 37 ° C (questo è considerato come il giorno # 0 della cultura).
- Cambiare mezzo aspirando 1.5 ml del surnatante, filatura a 525 xg per 5 min a temperatura ambiente, risospendere in 1,5 ml di mezzo fresco contenente tutti i 3 citochine e aggiungendo indietro ai pozzetti ogni giorno nei giorni # 2, 3, 4, per ottimizzare fase proliferativa. Il giorno 3, rimuovere tutte le cellule, contare e dividere in congruo numero di pozzetti al fine di sostenere le concentrazioni di cellule e di ~ 2 x 10 5 cellule / ml. Mantenere la cultura a 37 C / 5% di CO 2 °.
- Il giorno 4, le cellule piastra MS5 (murino linee di cellule stromali) nei pozzetti di una nuova coltura cellulare 6-pozzetti. Il mezzo di coltura cellulare è MS5 α-MEM contenente 20% FBS, 100 unità / ml di penicillina / streptomicina, e 2 mM L-glutammina.
- Il giorno 5, contare il numero dicellule (ora notevolmente arricchito in eritroblasti) in ciascun pozzetto della piastra di coltura originale usando un contatore automatico di cellule o manualmente in un microscopio con un emocitometro.
- Sollevare tutte le cellule di ogni pozzetto e trasferimento provette coniche da 15 ml, centrifugare a 525 xg per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e sciogliere pellet con EGM fresco contenente solo Epo (3 UI / ml) ad una concentrazione di 2 x 10 5 cellule / ml.
- Aspirare il surnatante dai pozzi dove MS-5 cellule sono state piastrate il giorno precedente (mirato al 70-80% di confluenza al momento della co-cultura) e aggiungere le cellule eritroidi in questi pozzi in EGM contiene solo Epo (anche se non è il loro mezzo di scelta, MS-5 cellule sopravvivono bene in EGM per diversi giorni).
- Cambiare medio aggiungendo fresco EPO giorno # 6.
- Cambiare mezzo il giorno # 7, con EGM senza citochine aggiunti. Nei giorni 7 e 9, i campioni di prova per enucleazione con citometria a flusso dopo colorazione con anti-Ter119 e Syto-16 tutti i giorni e proceed di colorazione campioni per Multi-Spectral Imaging Citometria a Flusso (come indicato nella sezione 3).
Nota:. Prima di placcatura e il giorno 2, 4, 6 e 7 della cultura, monitorare le cellule in coltura di arricchimento eritroblasto e la differenziazione con la citometria a flusso, valutando marcatori di superficie CD44 e Ter119 vs dimensione (FSC) 9 alternativa CD71, Ter119, e FSC può anche essere usato 10, 11.
- Aggiungere 7 ml IMDM +2% FBS, centrifugare a 525 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e sospendere nuovamente le cellule pellet in 2 ml di mezzo di crescita eritroblasto (EGM), composto da:
2. Rapido enucleazione Assay, secondo il protocollo descritto da Yoshida et al. 12 con modifiche (Figura 1B)
- Induzione eritropoiesi Stress e stroma preparazione delle cellule per la cultura eritropoiesi in vitro
- Anestetizzare un 2-6 mesi wild type C57/BL6 del mouse secondo le linee guida IACUC (ad esempio con la soluzione isoflurano). Assicurarsi che il mouse è stato adeguatamente anestetizzato verificando l'assenza di risposte riflessivi ad un delicato posteriore-zampa pinch e perrespirazioni regolari durante la procedura. Utilizzare veterinario pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Indurre stress eritropoiesi via coda sanguinante per un volume finale di 500 microlitri. Utilizzando una siringa da insulina, iniettare un volume uguale di soluzione fisiologica per via intraperitoneale per assicurare rianimazione fluido dell'animale (tenere animale in posizione di Trendelenburg prima dell'iniezione e iniettare nell'addome inferiore in modo da non danneggiare gli organi interni).
- Non lasciare incustodito il mouse fino a quando non ha ripreso il controllo del motore come indicato dal animale iniziando a muoversi intorno alla gabbia ed essere in grado di alzarsi e camminare senza cadere. Il mouse Phlebotomized è posto in una gabbia senza altri topi.
- Dopo 2 giorni, piastra MS-5 cellule in pozzetti di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti. Incubare MS-5 cellule a 37 ° C / 5% di CO 2 in terreno cellule MS5 (a-MEM contenente 20% FBS, 100 unità / ml di penicillina / streptomicina, e 2 mM L-glutammina), con l'obiettivo di essere 70-80 % confluenti ipozzetti della piastra n dopo 48 ore.
- Raccolta di milza e lavorazione di splenociti
- Quattro giorni (96 ore) dopo l'induzione dello stress eritropoiesi, eutanasia già dissanguati mouse attraverso il protocollo IACUC approvato (ad esempio CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale).
- Harvest milza e metterlo in un tubo da 15 ml contenente IMDM 2% FBS e tenere in ghiaccio.
- Di nuovo in laboratorio, nella cappa coltura tissutale in condizioni sterili, invertire tubo-milza contenente un filtro cella 40 micron sulla cima di un tubo da 50 ml. Schiacciare milza usando lo stantuffo di una siringa di plastica 5 ml.
- Lavare filtro cella con IMDM +2% FBS e usando lo stesso mezzo, regolare il volume finale della sospensione cellulare a 5 ml.
- Strato con cautela la sospensione splenocyte 5 ml sulla separazione delle cellule 5 ml gradiente di densità medio 1.083 g / ml in una provetta da 15 ml e centrifugare a 750 xg per 25 minuti a temperatura ambiente, senza accelerazione freno / bassa.
- Trasferimentosurnatante (soluzione fino a circa il marchio 2 ml del tubo 15 ml al fine di acquisire buffy coat) in un tubo da 15 ml ed eseguire un altro lavaggio con IMDM +2% FBS a 525 xg per 5 min a RT .
- Aspirare il surnatante e globuli rossi lisare sospendendo il pellet in 3 ml di tampone di lisi RBC per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 7 ml IMDM +2% FBS per lavare le cellule e per diluire e neutralizzare il tampone di lisi RBC e centrifugare a 525 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante e sospendere le cellule in pellet in 2 ml di mezzo di crescita eritroblasti (EGM).
- Cultura isolate splenociti a bassa densità, arricchito in eritroblasti, in plastica (primo stadio di fast cultura eritropoiesi in vitro)
- Contare le cellule su un contatore di cellule automatico o manualmente da un emocitometro. Solito numero di cellule isolate per la milza in questa fase è ~ 15 x 10 6.
- Sospendere le cellule ulteriormente in EGM contenenti le citochine (afconcentrazioni inali): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, e Epo 2 U / ml.
- Piastre 1-5 x 10 6 cellule in un volume finale di 1 ml / pozzetto (stesso numero di cellule per pozzetto a seconda del numero totale di cellule) di una piastra di coltura cellulare da 24 pozzetti ed incubare O / N a 37 ° C / 5% di CO 2.
- Cultura della eritroblasti sulle cellule MS5 (seconda fase del digiuno cultura eritropoiesi in vitro
- Aspirare il surnatante dalla plastica bene e sollevare le cellule (altamente arricchito in eritroblasti) con l'aggiunta di 2 ml di freddo EDTA 10 mM in PBS per 5 min, su ghiaccio in ciascun pozzetto.
- Mettere le cellule in tubi fresche, si lava una volta in EGM (senza citochine) e risospendere nella stessa.
- Tavola 5 x 10 5 -1 x 10 6 cellule in un volume di 1-2 ml per ogni cella MS5 rivestite pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Se inibitori farmacologici vengono utilizzati nell'esperimento, aggiungerli a concentrazioni appropriate momento.
- Incubare per 6-8 ore (tempo guidata daosservazione microscopica di circa il 30% -40% enucleazione nel campione non trattato WT). Il legame di eritroblasti per MS-5 celle accelera la loro enucleazione.
- Sollevare cellule di ogni pozzetto aggiungendo 2 ml di PBS freddo EDTA + 10 mM, per 5 minuti, su ghiaccio. Insieme con i eritroblasti, MS-5 celle saranno raccolti, ma questi possono poi essere facilmente esclusi durante il flusso citometria come FSC hi Ter119 - cellule.
- In questa fase, le cellule possono essere fissate e colorate per l'analisi mediante Multi-Spectral Imaging citometria a flusso.
3. Colorazione di eritroblasti per la localizzazione delle proteine intracellulari o lipidi Zattere Durante enucleazione da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso
- Lavare le cellule in PBS, centrifugare 525 xg per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante.
- Fix cellule da risospendere pellet cellulari in 500 ml di 3,7% di formaldeide in PBS per 15 minuti (tempo di fissazione variare a seconda antigen essere sondato) e pipettaggio delicatamente.
- Trasferimento a tubi da centrifuga da 1,5 ml di plastica e incubare per 15 minuti a RT.
- Spin su una panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 secondi, aspirare il surnatante ed effettuare un lavaggio con l'aggiunta di 500 microlitri di PBS in ogni provetta e pipettaggio delicatamente.
- Gira su una panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 secondi, aspirare il surnatante e mantenere i tubi in ghiaccio per almeno 15 minuti. Permeablization passaggi 3,6-3,9 dovrebbe essere fatto in modo rapido ed efficiente, e in seguito spinning / aspirazione a RT, pellet cellulari deve essere immediatamente rimesso sul ghiaccio, in modo che le cellule di conservare meglio la loro integrità.
- Prendere soluzioni acetone fuori da -20 ° C freezer e messo in ghiaccio. Permeabilize cellule risospendendo prima pellet cellulari in 500 microlitri ghiacciata del 50% acetone (1:1 con dH 2 O) e pipettare delicatamente.
- Spin sulla panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 sec, aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 500 microlitri60; ghiacciata al 100% acetone pipettando delicatamente.
- Spin sulla panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 sec, aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule ancora una volta in 500 microlitri ghiacciata del 50% acetone pipettando delicatamente.
- Spin sulla panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 secondi, aspirare il surnatante e lavare le cellule una volta freddo tampone di FACS (PBS + 0,5% BSA) pipettando delicatamente.
- Preparare etichettatura cocktail con anticorpi o marcatori per le molecole di interesse: 0.1 U/100 microlitri AF488-phalloidin per la colorazione F-actina e 1 μl/100 microlitri Ter119-PECy7 per la colorazione delle cellule eritroide. Colorazione alternativo o aggiuntivo può essere fatto anche con AF-488-anti-β-tubulina anticorpo (1:50), AF-594-coniugato tossina colerica subunità B etichettare raft lipidici (1:200), anti-pMRLC (Ser19) anticorpo primario per la miosina fosforilata catena leggera normativo (1:50), seguito da anti-coniglio AF-488-coniugato anticorpo secondario (1:400), e anti-γ-tubulin anticorpo primario di coniglio (1:100), seguito da anti-coniglio AF-555-coniugato anticorpo secondario (1:300).
- A seguito di aspirazione surnatante, risospendere pellet cellulari in 100 ml di marcatore cocktail, pipetta delicatamente e incubare per 30 minuti a RT.
- Preparare tampone FACS contenente 2,5 mM di macchia DRAQ5 nucleare.
- Lavare le cellule in tampone FACS, spin down sul banco microcentrifuga 2.000 xg per 20 secondi, aspirare il surnatante e risospendere in 60 microlitri di buffer FACS contenente DRAQ5.
- Campioni corrono sulla rappresentazione citofluorimetro raccogliere almeno 10.000 eventi per esperimento, compensare i file di dati grezzi come precedentemente pubblicata 13, e analizzare i risultati come mostrato in Figura 2, utilizzando il software di analisi specifico per imaging citofluorimetro.
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Representative Results
In primo luogo, le cellule vengono analizzate in base alla loro Brightfield Aspect Ratio (il rapporto tra la lunghezza della loro minore rispetto al loro asse maggiore) e la loro area Brightfield (indicativo della loro dimensione). Eventi di valore Brightfield Area inferiore a 20 e superiore a 200 sono per lo più detriti cellulari e aggregati, rispettivamente, e sono esclusi dall'analisi (Figura 2A). Singole cellule (gate "R1") sono poi analizzati in base al loro valore per il parametro Gradient RMS, che indica la nitidezza dell'immagine. Gate "R2" viene creato cellule contenenti con il valore gradiente RMS oltre il 50 ° percentile, al fine di selezionare le immagini scattate bene a fuoco (Figura 2B). Le cellule sono poi gated base alle loro dimensioni come misurato dalla loro area Brightfield, e la loro positività per il Ter119 marcatore eritroide misurata dal parametro macchia-media Pixel Ter119 fluorescente (cancello "Ter119 positivo", Figura 2C). Le cellule molto basse o molto alte per Ter119, sono o non-erythroids o aggregati di cellule rimanenti, rispettivamente, e sono esclusi dall'analisi. Nella fase successiva, le cellule vengono selezionate in base alla DRAQ5 Proporzioni Intensity (il rapporto del minore rispetto all'intensità asse maggiore della loro nucleo) e l'intensità della DRAQ5 (Figura 2D). DRAQ5 cellule negative (cellule enucleate in gran parte, come reticolociti e globuli rossi), e cellule con un basso rapporto d'aspetto DRAQ5 (per lo più doppiette) sono esclusi dall'analisi. DRAQ5 cellule positive (cancello "DNA positivo", eritroblasti principalmente a questo punto) vengono quindi analizzati in base alla loro Area Ter119, che indica la dimensione della cella, e la loro Ter119 media Pixel / area (densità di espressione Ter119), che indica l' luminosità Ter119 colorazione. Eritroblasti ortocromatiche (gate "OrthoE") sono riconosciuti come piccoli, Ter119 celle hi (Figura 2E). Infine, una sottopopolazione di orthochromatic eritroblasti altamente arricchito in enucleare cellule è caratterizzato da bassa Proporzioni Brightfield, che è una misura di allungamento cellulare, calcolato dal rapporto tra asse minore / asse maggiore dell'immagine cella nel canale Brightfield M01, e da una elevata Delta Centroid XY Ter119 / DRAQ5, che è definita dalla distanza tra il centro della incipiente Ter119 +-reticolociti e il centro del DRAQ5 +-nucleo (gate "enucleare cellule" in Figura 2F).
Insieme con anticorpo contro Ter119 e il DRAQ5 DNA-macchia, le cellule sono anche stati macchiati per actina filamentosa (F-actina) con phalloidin fluorescente per valutare la localizzazione di F-actina durante enucleazione eritroblasti 7. Di nota, una progressione di enucleazione può essere visualizzato nelle celle fisse, come cellule con proporzione decrescente (cioè sempre allungata) e aumentando delta centroide XY Ter119/Draq5 sono osservate (Figure 3). F-actina è osservato per concentrare al solco clivaggio durante enucleazione e poi dissipare una volta che il nucleo viene estrusa. Inoltre, co-localizzazione di actina e miosina al solco scissione tra reticolociti incipiente e il nucleo può essere dimostrata dal flusso di imaging multi-spettrale citometria dopo la co-colorazione di eritroblasti WT per pMRLC (miosina fosforilata catena leggera di regolamentazione) e F-actina 7.
Altre proteine e strutture di interesse possono anche essere colorate con anticorpi appropriati o marcatori fluorescenti per consentire studi di imaging del loro ruolo durante l'enucleazione. La formazione dei microtubuli polarizzata è visibile in WT eritroblasti ortocromatiche prima enucleazione, ma non in eritroblasti trattati con colchicina (Figura 4A). L'inibizione della polimerizzazione della tubulina da colchicina diminuisce polarizzazione delle cellule, come dimostrato misurando il centroide parametro delta XY BF/Draq5 tra il center del corpo cellulare visto nel canale Brightfield e il centro della colorazione nucleare ottenuta con DRAQ5 (Figura 4B).
Utilizzando WT o Rac-deficienti (dopo manipolazione genetica o farmacologica) eritroblasti nel flusso di imaging multi-spettrale citometria studi di imaging autorizzati che dimostrano il ruolo di Rac GTPasi in enucleazione. GTPasi Rac regolano almeno in parte la formazione di un anello actomyosin nonché la confluenza di zattere lipidiche nel solco tra reticolociti incipiente e pyrenocyte 7.
Figura 1. Dimostrazione schematica dei protocolli eritropoiesi in vitro utilizzati per produrre eritroblasti enucleare per Studi. A. a lungo termine nella cultura eritropoiesi vitro initiated da LDBM o Lin -.. cellule B. saggio enucleazione veloce avviato da splenociti altamente arricchito in eritroblasti dopo l'induzione dello stress eritropoiesi in vivo da salasso Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Analisi dei dati utilizzando il software di analisi specifica al flusso di imaging citometro. Gating successive delle popolazioni di interesse è mostrato in pannelli AF. Il numero in parentesi indicano la percentuale approssimativa della popolazione principale corrispondente, in questo esperimento. A. gating iniziale della popolazione R1 rimuove aggregati cellularie detriti cellulari. B. Porta R2 su R1 comprende le cellule che sono stati impressi chiaramente, esclusi su cellule fuoco. cellule di C. Ter119-positivi (su R2) sono selezionate, escluse le cellule che sono o negativo per Ter119 o sono troppo intensamente macchiato a causa della loro presenza negli aggregati. vengono selezionati D. cellule DNA-positivi (su cellule Ter119-positivi), dopo aver tracciato per Aspect Ratio intensità rispetto intensità della colorazione nucleare (qui DRAQ5 leggere canale 5). E. cellule DNA e Ter119 positivi sono gated in basofili, polychromatophilic e eritroblasti ortocromatiche in base alla loro posizione nel Ter119 media Pixel contro Ter119 Area (qui leggono canale 3), come mostrato in precedenza da McGrath et al 5. F. Le cellule enucleare sono quelle cellule di eritroblasti ortocromatiche, che hanno un basso Aspect Ratio (una misura di elongat cellulareione in campo chiaro (BF) Canale) e ad alta Delta Centroid XY Ter119/Draq5 (distanza tra il centro di formazione di Ter119 +-reticolociti e il centro del nucleo). Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Blood: DG Konstantinidis, Pushkaran S, et al segnalazione e le esigenze del citoscheletro in enucleazione eritroblasto Sangue... 2012;. 119 (25) :6118-6127 dalla American Society of Hematology Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagini rappresentative della enucleare eritroblasti con progressivamente crescente Delta Centroid XY Ter119/Draq5. WT del mouse erythroblasts ortocromatiche, colorati con Ter119-PECy7, phalloidin-AF488, e Draq5, sono gated per il loro rapporto di aspetto e delta baricentro XY Ter119/Draq5. Le cellule sono mostrati fissato a diverse fasi successive di enucleazione, con una progressione che corrisponde alla diminuzione proporzioni e aumentando delta centroide XY Ter119/Draq5 (verde-cross all'interno del cancello giallo indica la posizione della cella ripreso a destra). Nelle immagini cella dall'alto verso il basso, F-actina può essere osservato durante enucleazione di concentrare al solco scissione e poi dissipare una volta che il nucleo viene estrusa (come mostrato nella cella # 4782 presso l'immagine in basso). Cliccare qui per visualizzare un grande versione di questa figura.
Figura 4. Formazione di un assemblaggio dei microtubuli unipolare e polarizzazione di orthochromaeritroblasti tic precede enucleazione. A. polarizzata la formazione dei microtubuli è visibile in eritroblasti WT di controllo (colorati con anti-b-tubulina-AlexaFluor-488 e la macchia DRAQ5 nucleare), mentre b-tubulina è diffuso macchiato negli eritroblasti incubati con colchicina (5 micron) per 6 ore nel veloce vitro enucleazione in. B. multispettrale immagini citometria a flusso può offrire una valutazione quantitativa di polarizzazione cellulare mediante analisi della distribuzione del parametro Delta Centroid XY BF/Draq5, che misura la distanza tra il centro del corpo cellulare come si è visto in campo chiaro e il centro della colorazione nucleare ottenuta con DRAQ5 (rappresentazione schematica nel riquadro). I valori Delta Centroid BF/Draq5 di WT erythroblasts ortocromatiche colchicina trattati sono differenze statisticamente significative rispetto al controllo dei valori Delta Centroid BF/Draq5 (p <0.001). Questa ricerca è stata originariamente pubblicata nel Blood:.. DG Konstantinidis, Pushkaran S, et al segnalazione e le esigenze del citoscheletro in enucleazione eritroblasto Sangue. 2012;. 119 (25) :6118-6127 dalla American Society of Hematology Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Negli ultimi anni lo studio di enucleazione eritroblasti ha guadagnato crescente slancio poiché è il passo in vitro culture eritropoiesi in che è più difficile da riprodurre in modo efficiente per ottenere successo, la produzione su larga scala di globuli rossi ex vivo. Fino a poco tempo, lo studio di enucleazione eritroblasti utilizzato principalmente microscopia a fluorescenza e citofluorimetria metodi. Metodi di microscopia a fluorescenza, sebbene utili per identificare molecole partecipanti, richiedono giorni di osservazione microscopica per identificare un piccolo numero di eritroblasti ortocromatiche sottoposti a enucleazione entro centinaia di cellule fissate in un determinato punto nel tempo. Citofluorimetria metodi, d'altra parte, sono molto utili per valutare il tasso di enucleazione in una cultura, nonché gli effetti della manipolazione genetica o farmacologica di particolari molecole su questo processo, ma non forniscono alcun dato sulla intracellular localizzazione di queste molecole.
Flusso di imaging multi-spettrale combina citometria i vantaggi della citometria a flusso e microscopia a immunofluorescenza, in quanto permette una rapida acquisizione sia di citometria a flusso di dati e morfologiche sulle diverse migliaia di cellule. Questo è un vantaggio significativo rispetto al flusso classico citometria a studi eritropoiesi, dal momento che le diverse fasi di differenziazione eritroblasto (proerythroblasts, basofili, polychromatophilic e ortocromatica) sono stati definiti sulla base di criteri morfologici 6. Tuttavia, multi-spettrale flusso di immagini citometria è ottimale per la visualizzazione di strutture cellulari, piuttosto che il confronto di quantificazione relativi a numeri della popolazione. Per tali confronti, citometria a flusso di routine che non richiede la fase di permeabilizzazione necessario per immunofluorescenza di strutture intracellulari si comporta meglio. Ad esempio, la percentuale relativa di BasoE: PolyE: OrthoE in Figura 2E
I dati di immagini possono essere trattati in associazione con la citometria a flusso di dati utilizzando il software di analisi specifica al flusso di imaging citometro, permettendo la raccolta di cellule con determinate caratteristiche morfologiche all'interno cancelli. Circa cento cellule enucleare si identificano in una popolazione di 10.000 eritroblasti con il metodo di analisi sopra descritta in modo rapido ed efficiente 7, permettendo osservazioni più significative e valutazione statistica.
Inoltre, l'elaborazione delle immagini è facilitata con il software di analisi specifica per il flusso di imaging citometro permettendo analisi quantitativa di tali caratteristiche il Delta Centroid XY per studiare ad esempio la posizione relativa del nucleo dicitoplasma che può essere usato come una misura di polarizzazione.
Fasi critiche all'interno del protocollo e risoluzione dei problemi
E 'noto che anche pipettaggio dolce può causare il distacco di reticolociti e pyrenocyte 12. Questo ha il potenziale per limitare fortemente il numero di eventi enucleazione impressionate. Di conseguenza, è necessario prestare attenzione, soprattutto quando si solleva eritroblasti legati alle cellule MS5 in coltura.
Fissazione con formaldeide in soluzione può causare alterazioni regioni extracellulari di marcatori di superficie con conseguente anticorpo specifico legame inferiore e / o legame di anticorpi non specifico maggiore. Un vantaggio del flusso imaging è citometro che colorazione della superficie viene visualizzata e la sua qualità può quindi essere valutato. Punteggiato, invece di uniforme, colorazione per abbondanti marcatori di superficie come Ter119 indica overfixation e dovrebbe essere affrontata attraverso un mix di bassa formaldeideconcentrazione hyde e minore durata della fissazione.
Seguendo fissazione, mantenendo le cellule in ghiaccio per almeno 15 min è indispensabile per evitare la rottura delle cellule in eccesso durante il processo di permeabilizzazione causa di differenze di temperatura. Sebbene acetone permeabilizzazione mantiene la fine erythroids fragili meglio di permeabilizzazione detergente-mediata, il passaggio in cui è richiesto il 100% di acetone si tradurrà in un notevole, ma non nocivo, perdita di cellule. Alla fine, dopo un lavaggio con tampone FACS freddo, le cellule sono ammessi a temperatura ambiente per le fasi di incubazione.
Il flusso di imaging ha citometro a un tasso di flusso (cellule / sec) a seconda dell'obiettivo utilizzato (tasso è diminuito l'ingrandimento aumenta). Seguendo lavaggio finale prima della misurazione, si raccomanda pellet cellulari sono risospese in un piccolo volume (50-60 ml), al fine di accelerare l'elaborazione del campione. Per un gran numero di campioni che riquaderno lunga durata del periodo (oltre 30 minuti), i campioni devono essere conservati in ghiaccio.
Il saggio enucleazione a lungo termine offre il vantaggio di una produzione di cellule eritroide ampliato al fine di produrre abbastanza cellule che possono essere raccolti nella fase di enucleazione per la valutazione biochimica come immunoblotting e pull-down. Il saggio enucleazione veloce offre il vantaggio di tempo che richiede solo 2 giorni per eseguire, anche se un mouse deve essere Phlebotomized 4 giorni prima dell'esperimento. Non abbiamo osservato una differenza significativa in efficienza enucleazione tra i due metodi. Di nota, citometria a flusso valutazione, che non richiede il passo permeabilizzazione necessaria per immunofluorescenza di strutture intracellulari, come descritto prima 7, è più adatto per la valutazione quantitativa dell'efficienza enucleazione.
Limiti della tecnica
Il metodo descritto qui utilizes stress indotto eritropoiesi in vivo e coltura in terreno contenente idrocortisone in vitro per amplificare popolazioni eritroidi e sincronizzarli in fase di enucleazione. Entrambe queste condizioni possono imitare eritroblasto-enucleazione sotto stress. Inoltre, idrocortisone aumenta notevolmente la resa eritroide e sopravvivenza. Per ottenere analogo rendimento degli eventi enucleazione di cellule di midollo osseo derivate da topi wild type con eritropoiesi steady-state e colto senza idrocortisone (evitando così di sincronizzazione), avremmo bisogno di cellule in coltura da più topi ed eseguire ed elaborare molto di più eventi attraverso il Multi -Spectral Imaging Citometria a Flusso. Anche se il flusso di imaging multi-spettrale accelera citometria raccolta di dati morfologici immensamente rispetto alla microscopia di immunofluorescenza con lente di ingrandimento fino a 60x, il confronto delle osservazioni ottenute da immagini citofluorimetro con il classico, Z-stack,e microscopia confocale è prezioso avere maggiore dettaglio, poiché la lente obiettivo in un microscopio può fornire ingrandimento fino a 100x e immagini Z-stack dare un'impressione 3-dimensionale delle strutture, che non è raggiungibile dal flusso di imaging citometro nella stessa cella. L'elevato numero relativo di cellule simili raccolti in un flusso di imaging multispettrale citometria esperimento, a un orientamento casuale, parzialmente compensa questa limitazione consentendo osservazioni da un diverso punto di vista.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il flusso di Ricerca Citometria Nucleo presso l'Ospedale Pediatrico di Cincinnati Fondazione di Ricerca e Richard Demarco, Sherree amico, e Scott Mordecai dal Amnis Corporation (parte di EMD Milllipore) per il supporto tecnico di esperti. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede K08HL088126 e R01HL116352 (TAK) e P30 DK090971 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
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