Summary
O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos.
Abstract
Eritropoiese em mamíferos conclui com o processo dramático da enucleação, que resulta na formação de reticulócitos. O mecanismo de enucleação ainda não foi totalmente elucidado. Um problema comum encontrado quando se estuda a localização de proteínas-chave e estruturas dentro eritroblastos enucleação por microscopia é a dificuldade de observar um número suficiente de células em enucleação. Desenvolvemos um novo protocolo de análise de imagem usando multiparamétrica de alta velocidade em células de fluxo (multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo), um método que combina a microscopia de imunofluorescência com citometria de fluxo, de modo a identificar de forma eficiente um número significativo de eventos de enucleação, que permite obter medidas e realizar análises estatísticas.
Primeiro, descrever aqui dois in vitro da eritropoiese métodos de cultura utilizados para sincronizar eritroblastos murino e aumentar a probabilidade de captura de enucleação no the tempo de avaliação. Em seguida, descrevem em detalhe a coloração de eritroblastos após fixação e permeabilização, a fim de estudar a localização de proteínas intracelulares ou jangadas lipídicas durante enucleação por citometria de fluxo de imagem multi-espectral. Juntamente com o tamanho e coloração DNA/Ter119 que são usados para identificar os eritroblastos ortocromaticos, que utilizam os parâmetros "relação de aspecto" de uma célula no canal de campo brilhante que ajuda no reconhecimento de células alongadas e "delta centróide XY Ter119/Draq5 "que permite a identificação de eventos celulares em que o centro de coloração Ter119 (reticulócitos nascente) é muito distante do centro de coloração DRAQ5 (núcleo passando por extrusão), indicando, assim, uma célula prestes a enuclear. O subconjunto da população eritroblasto ortocromático com alta centroid delta e baixa relação de aspecto é altamente enriquecido em enuclear células.
Introduction
Diferenciação terminal na linhagem eritróide em mamíferos conclui com o processo dramático da enucleação, através do qual o eritroblastos ortocromático expele o seu núcleo envolto por uma membrana (pyrenocyte) 1, gerando um reticulócito 2. O mecanismo exacto deste processo, o qual também é o passo limitante da taxa de sucesso de, em larga escala, a produção de células vermelhas do sangue in vitro, ainda não está completamente elucidado. A localização de proteínas-chave e estruturas dentro eritroblastos enucleação depende da utilização de lâmpadas fluorescentes e microscopia eletrônica 3-5. Este processo tedioso resulta tipicamente na identificação de um número limitado de eventos de enucleação e nem sempre permitem uma análise estatística significativa. Expandindo um método de identificação eritroblasto descrito anteriormente por McGrath et al. 6, desenvolvemos uma nova abordagem de identificar e estudar os eventos de enucleação por Multi-espectral Imalagem Citometria de Fluxo (multiparamï imagens de células de alta velocidade do fluxo, um método que combina a microscopia de fluorescência, citometria de fluxo) 7, que pode proporcionar um número suficiente de observações para obter medições e análise estatística.
Aqui, nós descrevemos dois primeiros métodos in vitro da eritropoiese cultura utilizadas, a fim de sincronizar os eritroblastos e aumentar a probabilidade de captura de enucleação, no momento da avaliação. Em seguida, descrevem em detalhe a coloração de eritroblastos após fixação e permeabilização, a fim de estudar a localização de proteínas intracelulares ou jangadas lipídicas durante enucleação por citometria de fluxo de imagem multi-espectral.
As amostras são executados em um fluxo de imagens citômetro e as células coletadas são fechadas de forma adequada para identificar eritroblastos ortocromáticos 6. Eritroblastos ortocromático são então analisados com base em sua relação de aspecto, como medido em campo claro imalagem, contra o seu valor para o parâmetro do delta centróide XY Ter119-ADN, a qual é definida como a distância entre os centros das áreas manchadas para Ter119 e de ADN, respectivamente. A população de células com baixa relação de aspecto alta e centróide delta XY Ter119/DNA é altamente enriquecida em enuclear células. Usando o tipo selvagem (WT) eritroblastos contra eritroblastos com deleção Mx-Cre mediada condicional de Rac1 em Rac2 - / - ou Rac2 combinado - / -; RAC3 - / - base genética e este protocolo nova análise de fluxo de imagem multi-espectral citometria, demonstramos recentemente que se assemelha a enucleação citocinese assimétrico e que a formação de um anel de actomiosina regulada em parte por Rac GTPases é importante para a progressão da enucleação 7.
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Protocol
1. Longo prazo o cultivo in vitro eritropoiese (Ex vivo Erythroid Diferenciação Cultura Protocolo por Giarratana et al. 8, modificados e adaptados para rato Células)
Este é um longo prazo de 3 etapas no protocolo eritropoiese vitro. Na primeira etapa (dias 0-4) 2 x 10 5 células / ml, são colocados em meio de crescimento de eritroblastos suplementado com factor de células estaminais (SCF), a interleucina-3 (IL-3), e a eritropoietina (Epo). Na segunda etapa (dias 5-6), as células são suspensas de novo a 2 x 10 5 células / ml e co-cultivadas com células aderentes do estroma (MS5) em meio de crescimento de eritroblastos fresco suplementado apenas com Epo. No terceiro passo (7-9 dias), as células são cultivadas sobre uma camada de MS-5 células em meio de crescimento de eritroblastos fresco sem citocinas até enucleação (Figura 1A).
Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) deHospital Centro Médico Infantil de Cincinnati.
- Colheita de ossos e isolamento de células de medula óssea de baixa densidade
- Adicionar 2 ml de IMDM estéril contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) em um tubo cónico de 15 ml e guardar em gelo.
- Eutanásia um 2-6 meses de idade do tipo selvagem C57/BL6 rato (junto com ou sem rato geneticamente alvo de interesse) seguindo o protocolo aprovado pela instituição (por exemplo, inalação de CO 2, seguido por deslocamento cervical).
- Isolar ossos pélvicos, fêmures e tíbias de ambas as pernas com a pinça e bisturi, adicioná-los ao tubo contendo IMDM 2% FBS e manter em gelo.
- Adicionar 1 ml de IMDM 2% de FBS num tubo de citometria de fluxo estéril e lavar ossos usando uma pinça e uma seringa de tuberculina com uma 25-L x 5/8 "agulha. Lave IMDM 2% de FBS, através dos ossos, algumas vezes suavemente ( aspirando ~ 500 ul da suspensão de células e enxaguando-o de novo através do osso), e recolher as células da medula óssea para o fluxo cytometrtubo y. Flushing é completa quando os ossos aparecem em branco.
- Filtrar célula-suspensão através de um conjunto de 40 mícrons coador de células na parte superior de um tubo cónico de 50 ml. Lavar filtro celular com IMDM 2% de FBS e utilizando o mesmo meio de ajustar o volume final da suspensão de células para 5 ml.
- Prepare células da medula óssea de baixa densidade (ldbm) por centrifugação em gradiente de densidade: camada cuidadosamente os 5 ml de células-suspensão em 5 ml de separação celular gradiente de densidade média 1,083 g / ml em um tubo de 15 ml e rotação a 750 xg por 25 min à temperatura ambiente (RT) com nenhuma aceleração freio / baixo.
- Transferência do sobrenadante (tudo até cerca da marca de 2 ml de o tubo de 15 ml, a fim de adquirir buffy coat) para um novo tubo de 15 ml e um desempenho mais uma lavagem com IMDM 2% de FBS a 525 xg durante 5 min a RT.
- Sobrenadante aspirado e lisar quaisquer restantes glóbulos vermelhos (RBC) com a suspensão do sedimento em 3 ml de tampão de lise de RBC, durante 5 min à TA. Se uma maior pureza de eritroblastos érequerido na etapa final (por exemplo, para estudos bioquímicos), purificar células ldbm ainda neste passo para células neg Lin por separação magnética.
- Ex vivo eritróide protocolo de cultura de diferenciação a partir de células ou LDBM neg Lin (Figura 1A)
- Adicionar 7 ml de IMDM 2% de FBS, centrifugação a 525 xg durante 5 min à temperatura ambiente e ressuspender as células peletizadas em 2 ml de meio de crescimento de eritroblastos (AGE), que consiste em:
a. Médio StemPro-34, contendo
b. 2,6% StemPro-34 suplemento médio,
c. 20% de BIT-9500,
d. Sulfato ferroso de 900 ng / ml,
e. Nitrato férrico de 90 ng / ml,
f. 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina
g. 10 -6 M de hidrocortisona
h. e citocinas recém-adicionado:
i) 100 ng / ml SCF,
ii) 5 ng / ml de IL-3, e
iii) 3 UI / ml de Epo. - Contar as células usando um contador de células automatizado ou manual em um microscópio usando uma bainhaocytometer.
- Placa numa placa de 6 poços de cultura de células a uma concentração de 5 x 10 5 células / poço para um volume final de 2,5 ml em EGM (2 x 10 5 ldbm células / ml) e incubar a 37 ° C (isto é considerado como o dia # 0 da cultura).
- Mudança de meio por aspiração de 1,5 ml do sobrenadante, girando a 525 xg durante 5 min à temperatura ambiente, ressuspensão em 1,5 ml de meio fresco, contendo todos os três citocinas e voltar a adicionar aos poços cada dia em dias # 2, 3, 4, para optimizar fase proliferativa. No dia três, remover todas as células, e contagem dividido em número adequado de poços de forma a manter as concentrações de células assim de 2 x 10 ~ 5 células / ml. Manter a cultura a 37 ° C / 5% de CO 2 °.
- No dia 4, as células placa MS5 (linha de células de estroma murino) para poços de uma nova cultura de células de 6 poços da placa. O meio de cultura de células é MS5 α-MEM contendo 20% FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina.
- No dia 5, contar o número decélulas (agora enriquecido significativamente em eritroblastos) em cada poço da placa de cultura original, usando um contador de células automático ou manualmente em um microscópio usando um hemocitómetro.
- Levantar todas as células de cada poço e transferidos para tubos cónicos de 15 ml, girar a 525 xg durante 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e dissolvem-se peletes com EGM fresco contendo apenas Epo (3 UI / ml) para uma concentração de 2 x 10 5 células / ml.
- Aspirar o sobrenadante dos poços em que o MS-5 células foram plaqueadas no dia anterior (alvejado a 70-80% de confluência no momento da co-cultura) e adicionar as células eritróides nestes poços em EGM contendo apenas Epo (embora não o seu meio de escolha, MS-5 células sobreviver bem em EGM durante vários dias).
- Mude médio acrescentando fresco EPO no dia # 6.
- Mude médio no dia # 7, utilizando AGE sem citocinas adicionais. Nos dias 7 a 9, as amostras de teste para enucleação com citometria de fluxo após coloração com anti-Ter119 e Syto-16 diariamente e proceed a coloração de amostras para Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo (conforme detalhado na seção 3).
Nota:. Antes do plaqueamento e no dia 2, 4, 6, e 7 de cultura, as células cultivadas para monitorizar o enriquecimento de eritroblastos e diferenciação com citometria de fluxo por meio da avaliação de marcadores de superfície CD44 e Ter119 vs tamanho (FSC) 9 Alternativamente CD71, Ter119, e FSC Também pode ser utilizado 10, 11.
- Adicionar 7 ml de IMDM 2% de FBS, centrifugação a 525 xg durante 5 min à temperatura ambiente e ressuspender as células peletizadas em 2 ml de meio de crescimento de eritroblastos (AGE), que consiste em:
2. Rápida enucleação Ensaio, de acordo com o protocolo descrito por Yoshida et al. 12 com modificações (Figura 1B)
- Indução da eritropoiese Stress e estroma preparação de células para o cultivo in vitro eritropoiese
- Anestesiar a 2-6 meses de idade rato C57/BL6 tipo selvagem por diretrizes IACUC (por exemplo, com a solução de isoflurano). Certifique-se de que o rato foi anestesiado adequadamente, verificando a ausência de respostas reflexas a uma delicada pitada hind-pata e pararespirações regulares durante o procedimento. Use veterinário pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
- Induzir o estresse eritropoiese via cauda sangrando até a um volume final de 500 mL. Usando uma seringa de insulina, injetam igual volume de soro fisiológico por via intraperitoneal para garantir reposição volêmica do animal (segure animal em posição de Trendelenburg antes de injetar e injetar no abdome inferior, de modo a não danificar os órgãos internos).
- Não deixe o mouse autônoma até que ele recuperou o controle motor, como indicado pelo animal começando a se mover ao redor da gaiola e ser capaz de ficar em pé e andar sem cair. O mouse Phlebotomized é colocado em uma gaiola sem outros ratos.
- Após 2 dias, a placa de MS-5 células em cavidades de uma placa de 24 poços de cultura de células. Incubar MS-5 células a 37 ° C / 5% de CO 2 em meio de células MS5 (a-MEM contendo 20% FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina) com o objectivo de ser 70-80 % confluentes ipoços n placa após 48 horas.
- Colheita de baço e processamento de esplenócitos
- Quatro dias (96 horas) após a indução do estresse eritropoiese, eutanásia anteriormente sangrou mouse através de protocolo IACUC-aprovado (por exemplo, inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical).
- Baço Colheita e colocá-lo em um tubo cônico de 15 ml contendo IMDM 2% FBS e manter em gelo.
- De volta ao laboratório, em cultura de tecidos sob as condições de cobertura estéreis, inverter tubo contendo baço sobre um filtro de células de 40 mícrons situado no topo de um tubo de 50 ml. Esmagar baço usando o êmbolo de uma seringa de plástico de 5 ml.
- Lavar filtro celular com IMDM 2% de FBS e utilizando o mesmo meio, ajustar o volume final da suspensão de células para 5 ml.
- Camada cuidadosamente a suspensão de esplenócitos em 5 ml de 5 ml de separação de células por gradiente de densidade média 1,083 g / ml num tubo de 15 mL e centrifugação a 750 xg durante 25 min à temperatura ambiente com ausência de aceleração freio / baixo.
- Transferênciasobrenadante (solução para baixo para sobre a marca de 2 ml de o tubo de 15 ml, a fim de adquirir buffy coat) para um novo tubo de 15 ml e um desempenho mais uma lavagem com IMDM 2% de FBS a 525 xg durante 5 min à TA .
- Sobrenadante aspirado e as células vermelhas do sangue lisar por suspensão do sedimento em 3 ml de tampão de lise de RBC, durante 5 min à TA.
- Adicionar 7 ml de IMDM 2% FBS para lavar as células e para diluir e neutralizar o tampão de lise dos glóbulos vermelhos e centrifugação a 525 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante e suspender as células precipitadas em 2 ml de meio de crescimento de eritroblastos (AGE).
- Cultura dos esplenócitos isolados de baixa densidade, enriquecidos em eritroblastos, em plástico (primeira fase de rápido cultura in vitro eritropoiese)
- Contagem de células em um contador de células automatizado ou manualmente por um hemocitômetro. Número habitual de células isoladas por baço nesta fase é de aproximadamente 15 x 10 6.
- Suspender as células ainda em EGM contendo as citocinas (em fconcentrações inal): SCF 50 ng / ml, IL-3, 5 ng / ml, e Epo 2 U / ml.
- Placa de 1-5 x 10 6 células, num volume final de 1 ml / poço (o mesmo número de células por poço, dependendo do número total de células) de uma placa de cultura celular de 24 poços e incubam O / N a 37 ° C / 5% de CO 2.
- Cultura de eritroblastos em células MS5 (segunda fase de rápido cultura in vitro eritropoiese
- Aspirar o sobrenadante do poço de plástico e levantar as células (altamente enriquecidos em eritroblastos) por adição de 2 ml de frio EDTA 10 mM em PBS durante 5 min, em gelo a cada poço.
- Colocar as células em tubos frescos, lavar uma vez em EGM (sem citocinas) e ressuspender na mesma.
- Placa de 5 x 10 5 x 10 -1 6 células num volume de 1-2 ml a cada MS5 poço de uma placa de 24 poços revestidas com células. Se os inibidores farmacológicos estão sendo utilizados na experiência, adicioná-las em concentrações adequadas agora.
- Incubar durante 6 a 8 horas (tempo guiado pelaobservação microscópica de aproximadamente 30% -40% de enucleação na amostra não tratada WT). A ligação de eritroblastos para MS-5 células acelera sua enucleação.
- Elevador células de cada poço pela adição de 2 ml de PBS frio + EDTA 10 mM, durante 5 minutos, em gelo. Junto com os eritroblastos, MS-5 células também serão coletados, mas isso mais tarde pode ser facilmente excluídos durante a análise por citometria de fluxo como FSC oi Ter119 - células.
- Nesta fase, as células podem ser fixadas e coradas para a análise por multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo.
3. Coloração de Erythroblasts para localização de proteínas intracelulares ou lipídicas Balsas Durante enucleação por Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo
- Lavar as células com PBS, girar 525 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante.
- Fixar as células por ressuspensão sedimentos celulares em 500 ul de 3,7% de formaldeído em PBS, durante 15 minutos (tempo de fixação pode variar, dependendo do antigen sendo sondado) e pipetar suavemente.
- Transferir 1,5 ml de tubos de centrífuga de plástico e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
- Rotação sobre um banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, aspirar o sobrenadante e realizar uma lavagem através da adição de 500 ul de PBS a cada tubo e pipetando suavemente.
- Gire em um banco microcentrifuge 2.000 xg por 20 segundos, o sobrenadante aspirado e manter os tubos no gelo por pelo menos 15 min. Permeablization passos 3,6-3,9 deve ser feito de forma rápida e eficiente, e seguindo fiação / aspiração à temperatura ambiente, pelotas de células deve ser imediatamente colocada de volta no gelo, a fim de que as células para melhor conservar a sua integridade.
- Tomar as soluções de acetona para fora do freezer -20 ° C e colocar no gelo. Permeabilizar as células por ressuspensão sedimentos celulares em primeiro lugar 500 mL de gelo frio de 50% de acetona (1:1 com dH 2 O) e de pipetagem suave.
- Giro no banco microcentrifuge 2.000 xg por 20 segundos, o sobrenadante aspirado e células ressuspender pelotas em 500 mL60; gelada 100% de acetona com cuidado pipetando.
- Giro no banco microcentrifuge 2.000 xg por 20 segundos, o sobrenadante aspirado e células ressuspender pelotas mais uma vez em 500 mL gelada 50% de acetona com cuidado pipetando.
- Rotação no banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, aspirar o sobrenadante e lava-se as células uma vez em tampão frio de FACS (PBS + 0,5% BSA), pipetando suavemente.
- Prepare rotulagem cocktail com anticorpos ou marcadores para as moléculas de interesse: 0,1 mL U/100 AF488-phalloidin para coloração F-actina e 1 μl/100 mL Ter119-PECy7 para coloração de células eritróides. Coloração alternativa ou adicional, também pode ser feita utilizando AF-488-anti-β-tubulina de anticorpos (1:50), o AF-594 conjugado com a toxina da cólera subunidade B para rotular jangadas lipídicas (1:200), anti-pMRLC (Ser19) anticorpo primário para a cadeia leve da miosina reguladora fosforilada (1:50), seguido de anti-coelho de AF-488 conjugado com anticorpo secundário (1:400), e anti-γ-tubulin anticorpo primário de coelho (1:100), seguido por anticorpo anti-coelho secundário de AF-555-conjugado (1:300).
- Após a aspiração do sobrenadante, os sedimentos celulares ressuspender em 100 ul de o marcador de cocktail, pipeta gentilmente e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Preparar tampão de SCAF que continha 2,5 pM de DRAQ5 corante nuclear.
- Lave as células em tampão FACS, girar no banco microcentrifuge 2.000 xg por 20 s, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 60 mL de tampão FACS contendo DRAQ5.
- As amostras são executados sobre o citómetro de fluxo de imagem para recolher, pelo menos, 10.000 acontecimentos por experiência, compensar os ficheiros de dados brutos, tal como publicado anteriormente 13, e analisar os resultados, como mostrado na Figura 2, utilizando o software de análise de imagem específico para a citometria de fluxo.
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Representative Results
Em primeiro lugar, as células são analisadas quanto a sua Brightfield Aspect Ratio (a razão entre o comprimento da sua menor contra o seu eixo maior) e os seus arredores Brightfield (indicativo do seu tamanho). Eventos com um valor Brightfield Área inferiores a 20 e superiores a 200 são na maior parte dos restos celulares e agregados, respectivamente, e são excluídos da análise (Figura 2A). Células individuais (gate "R1") são analisados de acordo com o seu valor para o parâmetro Gradient RMS, o que indica a nitidez da imagem. Gate "R2" é criado contendo células com Gradient RMS valor mais do que o percentil 50, a fim de selecionar as imagens bem tiradas em foco (Figura 2B). As células são, então, fechado com base no seu tamanho, conforme medido pela sua Área Brightfield, e a sua positividade para a Ter119 marcador eritróides como medido pelo fluorescente parâmetro Ter119 mancha-média do pixel (gate "Ter119 positivo", Figura 2C). Células muito baixas ou muito altas para Ter119, ou são não-erythroids ou agregados de células remanescentes, respectivamente, e são excluídas da análise. No passo seguinte, as células são seleccionadas com base na sua DRAQ5 Aspect Ratio Intensidade (a razão entre a menor contra a maior intensidade do eixo do seu núcleo) e a intensidade de DRAQ5 (Figura 2D). DRAQ5 células negativas (células principalmente enucleados, como reticulócitos e hemácias), e células com baixa relação de aspecto DRAQ5 (principalmente parelhas) são excluídos da análise. DRAQ5 (células positivas porta "de DNA positivo", principalmente eritroblastos neste ponto) são então analisadas quanto a sua Área Ter119, o que indica o tamanho da célula, e a sua média Ter119 pixel / Área (densidade de expressão Ter119), que indica o brilho da coloração Ter119. Eritroblastos ortocromático (gate "OrthoE") são reconhecidos como, Ter119 células hi pequenas (Figura 2E). Finalmente, uma sub-população de orthochromatic eritroblastos altamente enriquecida em células enuclear é caracterizada por uma baixa relação de aspecto de campo claro, que é uma medida do alongamento das células, calculados pela relação de eixo menor / eixo maior da imagem da célula no canal Brightfield M01, e por uma elevada Delta Centróide XY Ter119 / DRAQ5, que é definido pela distância entre o centro da incipiente Ter119 +-reticulócitos e o centro do DRAQ5 +-núcleo (gate "células" enucleação da Figura 2F).
Juntamente com um anticorpo contra Ter119 e o ADN-DRAQ5 mancha, as células também foram coradas para a actina filamentosa (F-actina) com faloidina fluorescente para avaliar a localização de F-actina durante a enucleação eritroblastos 7. De nota, uma progressão de enucleação pode ser visualizado nas células fixas, como as células com uma relação de aspecto de diminuição (isto é, cada vez mais alongada) e aumentando centróide delta XY Ter119/Draq5 são observados (Fig.ra 3). F-actina é observado para concentrar no sulco de clivagem durante a enucleação e depois dissipar-se uma vez que o núcleo é extrudido. Além disso, a co-localização de actina e miosina no sulco de clivagem entre reticulócitos incipiente e do núcleo pode ser demonstrada por meio de fluxo de imagem multi-espectral citometria após a co-coloração de eritroblastos WT para pMRLC (miosina de cadeia leve reguladora fosforilada) e F-actina 7.
Outras proteínas e estruturas de interesse também podem ser marcadas com anticorpos apropriados ou marcadores fluorescentes para permitir estudos de imagem do seu papel durante a enucleação. A formação de microtúbulos é visível polarizada em eritroblastos ortocromaticos WT antes da enucleação, mas não em eritroblastos tratadas com colchicina (Figura 4A). A inibição da polimerização da tubulina pelo colchicina diminui a polarização celular, como demonstrado pela medição da centróide parâmetro delta XY BF/Draq5 entre o center do corpo celular visto no canal de campo claro e o centro da coloração nuclear alcançado com DRAQ5 (figura 4B).
Utilizando WT ou Rac-deficiente (após manipulação genética ou farmacológico) eritroblastos no fluxo de imagem multi-espectral citometria de estudos de imagem permitiu que demonstram o papel de Rac GTPases em enucleação. GTPases Rac regular, pelo menos em parte, a formação de um anel de actomiosina, bem como a confluência de jangadas lipídicas do sulco entre reticulócitos incipiente e pyrenocyte 7.
Figura 1. Demonstração esquemática da eritropoiese in vitro protocolos utilizados a fim de produzir os eritroblastos enucleação para estudos. A. longo prazo na cultura eritropoiese vitro deram inícioed de LDBM ou Lin -.. células B. ensaio enucleação rápido iniciado por esplenócitos altamente enriquecido em eritroblastos após a indução do estresse eritropoiese in vivo por flebotomia Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise dos dados utilizando o software de análise específica para o fluxo de imagens citómetro. Gating sucessiva das populações de interesse é apresentado em painéis AF. O número entre parênteses indica a percentagem aproximada da população pai correspondente, nesta experiência. A. propagação inicial de população R1 remove agregados celularese os restos celulares. B. R2 Portão de R1 inclui as células que foram fotografadas claramente, com excepção das células de foco. C. células Ter119-positivas (de R 2) são seleccionados, excluindo as células que são ou negativa para Ter119 ou sejam muito intensamente manchado por causa de sua presença em agregados. D. células DNA positivos (de células Ter119-positivos) são selecionados, depois de conspirar para Aspect Ratio Intensidade contra intensidade da mancha nuclear (aqui DRAQ5 ler no canal 5). E. células de DNA e Ter119 positivos são fechadas em basófilos, polychromatophilic e eritroblastos ortocromáticos com base em sua localização no Ter119 média Pixel contra Ter119 Área (leia aqui no canal 3), conforme demonstrado anteriormente por McGrath et al 5. F. As células enucleação são as células fora dos eritroblastos ortocromáticos, que têm baixo Aspect Ratio (uma medida de elongat celularion em campo claro (BF) do canal) e alta Delta Centroid XY Ter119/Draq5 (distância entre o centro de formação de Ter119 +-reticulócitos e centro de núcleo). Esta pesquisa foi publicada originalmente em Sangue: Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al Sinalização e requisitos do citoesqueleto na enucleação eritroblasto Sangue... 2012;. 119 (25) :6118-6127 pela Sociedade Americana de Hematologia Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens representativas de enuclear eritroblastos em escala crescente no Delta Centroid XY Ter119/Draq5. WT rato eritroblastos ortocromáticos, manchado com Ter119-PECy7, phalloidin-AF488, e Draq5, são fechadas por sua relação de aspecto e delta centroid XY Ter119/Draq5. As células são mostrados fixos em diferentes fases sucessivas, de enucleação, com uma progressão que corresponde à diminuição da razão de aspecto e aumentando delta centróide XY Ter119/Draq5 (cross-verde dentro do portão amarelo mostra a posição da célula trabalhada à direita). Nas imagens de células de cima para baixo, F-actina pode ser observado durante a enucleação de se concentrar no sulco de clivagem e em seguida dissipar uma vez o núcleo é expulso (como mostrado no celular # 4782 para a imagem inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Formação de uma associação de microtúbulos unipolar e polarização de orthochromaeritroblastos tic precede enucleação. A. Polarized a formação de microtúbulos é visível em eritroblastos de controlo WT (corados com anti-b-tubulina-AlexaFluor-488 e do DRAQ5 corante nuclear), ao passo que b-tubulina é difusamente manchado nos eritroblastos incubadas com colchicina (5 mM), durante 6 h no no ensaio in vitro rápido enucleação. B. multi-espectral de imagem de citometria de fluxo pode oferecer uma avaliação quantitativa de polarização celular por análise da distribuição do parâmetro do delta Centróide XY BF/Draq5, o qual mede a distância entre o centro do corpo da célula como pode ser visto na imagem de campo brilhante e o centro da coloração nuclear alcançado com DRAQ5 (representação esquemática da inserção). Valores Delta Centroid BF/Draq5 de WT eritroblastos ortocromáticos tratados com colchicina são estatisticamente significativamente diferente do controle de valores Delta Centroid BF/Draq5 (p <0,001). Esta pesquisa foi publicada originalmente em Blood:.. Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al Sinalização e requisitos do citoesqueleto na enucleação eritroblasto Sangue. 2012;. 119 (25) :6118-6127 pela Sociedade Americana de Hematologia Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nos últimos anos, no estudo de enucleação eritroblastos ganhou força crescente, uma vez que é o passo em culturas in vitro da eritropoiese que é mais difícil de reproduzir de forma eficiente, a fim de alcançar, a produção em larga escala bem sucedida de células vermelhas do sangue ex vivo. Até recentemente, o estudo de enucleação eritroblasto utilizada microscopia de fluorescência, principalmente, e citometria de fluxo métodos. Métodos de microscopia de fluorescência, embora útil na identificação de moléculas participantes, requerem dias de observação microscópica para identificar um pequeno número de eritroblastos ortocromáticos submetidos a enucleação dentro de centenas de células fixas em um determinado ponto no tempo. A citometria de fluxo métodos, por outro lado, são muito úteis para avaliar a taxa de enucleação em cultura, bem como os efeitos farmacológicos de manipulação genética ou de moléculas específicas deste processo, mas não oferecem quaisquer dados sobre o intracellular localização destas moléculas.
Fluxo de imagem multi-espectral citometria combina os benefícios da citometria de fluxo e microscopia de imunofluorescência, uma vez que permite uma aquisição rápida de ambos os dados de citometria de fluxo e morfologia em vários milhares de células. Esta é uma vantagem significativa em relação fluxo clássico citometria em estudos da eritropoiese, já que os diferentes estágios de diferenciação de eritroblastos (proeritroblastos, basófilos, polychromatophilic e ortocromático) foram definidos com base em critérios morfológicos 6. No entanto, multi-espectral de imagem de citometria de fluxo é o ideal para a visualização de estruturas celulares, em vez de comparações quantificação relativa em números populacionais. Para tais comparações, rotina citometria de fluxo, que não requerem a permeabilização passo necessário para imunofluorescência de estruturas intracelulares tem melhor desempenho. Por exemplo, a percentagem relativa de BasoE: polye: OrthoE na Figura 2E
Os dados de imagem podem ser processadas em associação com a citometria de fluxo de dados usando o software de análise específica para o fluxo de imagens citómetro, permitindo a recolha de células com determinadas características morfológicas dentro de portas. Cerca de cem células enucleação podem ser identificados dentro de uma população de 10.000 eritroblastos com o método descrito acima de um modo rápido e eficiente 7, permitindo observações mais significativas e de avaliação estatística.
Além disso, o processamento de imagem é facilitada com o software de análise específica para o fluxo de imagens citómetro permitindo a análise quantitativa de características, tais como o delta Centróide XY para estudar por exemplo, a posição relativa do núcleo parano citoplasma que pode ser usado como uma medida de polarização.
As etapas críticas no âmbito do protocolo e solução de problemas
É bem conhecido que, mesmo pipetagem suave pode resultar na separação de reticulócitos e pyrenocyte 12. Este tem o potencial para limitar severamente o número de eventos de enucleação fotografada. Como um resultado disso, deve ser tomado cuidado, particularmente quando se levanta eritroblastos ligados a células MS5 em cultura.
A fixação com uma solução de formaldeído pode causar alterações de regiões extracelulares de marcadores de superfície, resultando em diminuição da ligação do anticorpo específico e / ou aumento da ligação não específica de anticorpos. Uma vantagem de o fluxo de imagens citómetro é que a coloração da superfície é visualizado e a sua qualidade pode assim ser avaliada. Pontilhada, em vez de uniforme, coloração para marcadores de superfície abundantes, como Ter119 indica com excessiva e deve ser combatida através de uma combinação de menor formaldeídohyde concentração e menor duração de fixação.
Após a fixação, mantendo as células em gelo durante pelo menos 15 minutos é essencial, a fim de evitar o excesso de quebra de células durante o processo de permeabilização, devido a diferenças de temperatura. Embora acetona permeabilização mantém as erythroids frágeis final melhor do que a permeabilização mediada por detergente, o passo em que é requerida de 100% de acetona vai resultar numa perceptível, mas não prejudicial, a perda de células. No final, depois de uma lavagem com tampão FACS frio, as células são permitidos à temperatura ambiente durante os passos de incubação de anticorpos.
O fluxo de imagem tem uma taxa definida citômetro de fluxo (células / s), dependendo da lente utilizada (taxa é reduzida ao aumentar o zoom). Após a lavagem final, antes da medição, recomenda-se que os aglomerados de células são ressuspensas num pequeno volume (50-60 mL), a fim de acelerar o processamento da amostra. Para um grande número de amostras que require longa duração do prazo (mais de 30 min), as amostras devem ser mantidos no gelo.
O ensaio enucleação de longo prazo oferece a vantagem de uma produção eritróide expandido a fim de produzir células suficientes que podem ser recolhidos na fase enucleação para avaliação bioquímica como immunoblotting e pull-downs. O ensaio de enucleação rápido dá a vantagem de tempo que requer apenas 2 dias a executar, embora um rato precisa ser Phlebotomized quatro dias antes da experiência. Nós não observamos uma diferença significativa na eficiência enucleação entre os dois métodos. De nota, a citometria de fluxo de avaliação, o qual não requer o passo permeabilização necessário para imunofluorescência de estruturas intracelulares, tal como descrito antes 7, é mais apropriado para a avaliação quantitativa da eficiência enucleação.
Limitações da técnica
O método descrito aqui utilizes estresse induzido eritropoiese in vivo e da cultura em meio contendo hidrocortisona in vitro, a fim de ampliar as populações eritróides e sincronizá-los na fase de enucleação. Ambas as condições prováveis imitar eritroblasto-enucleação sob estresse. Além disso, a hidrocortisona aumenta significativamente o rendimento eritróide e sobrevivência. Para obter rendimento similar de eventos de enucleação de células da medula óssea derivadas de camundongos selvagens com eritropoiese estado estacionário e cultivados sem hidrocortisona (evitando assim a sincronização), teríamos de células de cultura de vários mouses e executar e processar muito mais eventos através de múltiplos -espectral de imagem de Citometria de Fluxo. Embora o fluxo de imagem multi-espectral citometria acelera recolha de dados morfológicos imensamente em comparação com a microscopia de imunofluorescência usando lente de ampliação até 60x, a comparação das observações obtidas por imagiologia citómetro de fluxo com clássico, Z-pilha,e as imagens de microscopia confocal é valiosa para obter a melhor detalhe, uma vez que a lente da objectiva de um microscópio podem proporcionar ampliação até 100x e imagens Z-stack dar uma impressão 3-dimensional das estruturas, o que não é atingível por imagiologia citómetro de fluxo na mesma célula. O elevado número relativo de células semelhantes recolhidos em um fluxo de imagem multi-espectral citometria de experiência, em uma orientação aleatória, compensa parcialmente essa limitação permitindo observações de um ponto de vista diferente.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem o fluxo Citometria de Pesquisa Núcleo da Fundação do Cincinnati Children Research Hospital e Richard Demarco, Sherree amigo, e Scott Mordecai do Amnis Corporation (parte da EMD Milllipore) para suporte técnico especializado. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede K08HL088126 e R01HL116352 (TAK) e DK090971 P30 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
