Summary
이 의정서는 세포 계측법, 다중 분광 영상의 흐름에 의해 정색 적혈구 모세포를 탈핵 적혈구 모세포의 핵의 제거 프로세스의 시각화를 제공하는 인구를 식별하는 새로운 방법을 설명합니다.
Abstract
포유류의 적혈구는 망상 적혈구 형성에 결과 적출의 극적인 과정을 마칩니다. 안구 적출술의 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 현미경으로 탈핵의 적혈구 모세포 내 주요 단백질 구조의 지역화를 연구 할 때 발생하는 일반적인 문제는 안구 적출술을받은 세포의 충분한 수를 관찰하는 어려움이있다. 우리는 흐름의 다중 매개 고속 세포 이미징 (멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법), 효율적으로 탈핵 이벤트의 상당 수를 파악하기 위해, 유동 세포 계측법과 면역 형광 현미경을 결합하는 방법을 사용하여 새로운 분석 프로토콜을 개발, 그것은 할 수 있습니다 측정을 획득하고 통계 분석을 수행합니다.
우리는 먼저 여기 뮤린 적혈구 모세포를 동기화 번째에서 적출 캡처 가능성을 증가시키기 위해 사용되는 두 개의 체외 적혈구의 배양 방법을 설명평가의 전자 시간. 다음, 우리는 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 적출 동안 세포 내 단백질이나 지질 뗏목의 현지화를 연구하기 위해 세부 사항에 고정 및 permeabilization 후 적혈구 모세포의 염색에 대해 설명합니다. 크기 및 정색 적혈구 모세포를 식별하는 데 사용되는 DNA/Ter119 염색법과 함께, 우리는 기다란 세포와 "델타 중심 XY Ter119/Draq5의 인식에 도움 시야 채널 내의 셀의 파라미터"종횡비 "를 활용 "그 Ter119 염색 (초기 망상)의 중심이 멀리 떨어져 DRAQ5 염색 (핵 겪고 압출)의 중심에서있는 세포 사건의 식별 따라서 명백히하다에 대한 셀을 표시 할 수 있습니다. 높은 델타의 중심과 낮은 화면 비율 정색 적혈구 모세포 인구의 일부는 매우 세포를 탈핵에 충실.
Introduction
포유류의 적혈구 계보 내의 터미널 차별화 정색 적혈구 모세포는 망상 2를 생성, 그 막 쌌다 핵 (pyrenocyte)를 1 추방 통해 적출의 극적인 과정으로칩니다. 또한 성공의 속도 - 제한 단계가이 프로세스의 실기구는, 대규모는 체외에서 적혈구의 생산은 아직 완전히 해명되지 않는다. 탈핵의 적혈구 모세포 내 주요 단백질 구조의 지역화는 형광과 전자 현미경 3-5의 사용에 의존한다. 이 지루한 과정은 일반적으로 안구 적출술 이벤트의 제한된 수의 확인 결과 항상 의미있는 통계 분석을 허용하지 않습니다. 맥그래스 등. (6)에 의해 이전에 설명 적혈구 모세포 식별하는 방법에 확장, 우리는 멀티 스펙트럼 이마에 의해 적출 이벤트를 확인하고 연구의 새로운 접근 방식을 개발했습니다측정 값을 구하는 통계 분석을 수행하는 관측 충분한 수를 제공 할 수 ging를 유동 세포 계측법 (유체의 다 항목의 고속 이미징 셀, 유동 세포 계측법, 형광 현미경으로 결합 법) 07.
여기서, 우리는 적혈구 모세포를 동기화하고 평가시에 적출 캡처 가능성을 증가시키기 위해 사용되는 우선이 시험 관내 적혈구 조혈의 배양 방법을 설명한다. 그 다음 우리는 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 적출 동안 세포 내 단백질이나 지질 뗏목의 현지화를 연구하기 위해 세부 사항에 고정 및 permeabilization 후 적혈구 모세포의 염색에 대해 설명합니다.
샘플은 사이토 촬상 흐름에서 실행하고 수집 된 세포는 적혈구 모세포 정색 6 식별 적절 게이팅된다. IMA 시야에서 측정 한 정색 적혈구 모세포이어서 그들의 애스펙트 비에 기초 분석ging를 각각 Ter119 및 DNA 스테인드 영역의 중심 간의 거리로 정의되는 파라미터 델타 중심 XY Ter119-DNA, 그들의 값 대. 낮은 화면 비율과 델타의 중심 XY Ter119/DNA와 세포의 인구는 고도의 세포를 탈핵에 충실. / - - 또는 결합 RAC2 - / - 야생형 (WT)를 사용하여 RAC2에 RAC1의 MX-크레 매개 조건부 삭제와 적혈구 모세포 대 적혈구 모세포; Rac3 - / - 유전 적 배경 및 다중 분광 영상의 흐름이 소설 분석 프로토콜은 세포 계측법, 우리는 최근 적출 비대칭 세포질 분열을 닮아 라 세미 GTPases에 의해 부분적으로 규제 actomyosin 링의 형성이 탈핵의 진행 7 중요하다는 것을 보여 주었다.
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Protocol
체외 적혈구 문화 1. 장기 (예 생체 내 적혈구 분화 문화 프로토콜 Giarratana로 등. 8, 수정 및 마우스 세포에 대한 적응)
이 체외 적혈구 프로토콜의 3 단계 장기입니다. 우선 스텝 (일 0-4)은 2 × 105 세포 / ml의 줄기 세포 인자 (SCF), 인터루킨 -3 (IL-3), 및 에리트로 포이 에틴 (EPO)이 보충 된 적혈구 모세포 성장 배지에 배치된다. 두 번째 단계 (5-6 일)에서, 세포 × 10 2에서 재현 탁하는 5 세포 / 만 에뽀 보충 신선한 적혈구 모세포 성장 매체에 부착 기질 세포 (MS5)에 ML와 공동 배양 하였다. 세 번째 단계 (7-9 일)에, 세포는 최대 적출에 사이토 카인 (그림 1A)없이 신선한 적혈구 모세포 성장 매체에서 MS-5 세포의 층에 배양.
모든 동물 프로토콜의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다신시내티 아동 병원 의료 센터.
- 뼈와 저밀도 골수 세포의 분리의 수확
- 2 ML 15 ML 원뿔 튜브에 2 % 소 태아 혈청 (FBS)를 포함하는 멸균 IMDM을 추가하고 얼음에 보관.
- (자궁 경부 전위 다음에 예를 들면 CO 2 흡입,) 기관 승인 프로토콜 다음 (또는 그 유전자 타겟 마우스없이 함께) 2-6 개월 된 야생형 C57/BL6 마우스를 안락사.
- , 집게와 메스를 사용하여 골반 뼈, 대퇴골, 두 다리의 경골을 분리 IMDM 2 %의 FBS가 들어있는 튜브에 추가하고 얼음에 보관.
- (25-G의 X 몇 번 부드럽게 뼈를 통해 5 / 8 "바늘. 세척 IMDM 2 %의 FBS와 집게 및 투베르쿨린 주사기를 사용하여 멸균 유동 세포 계측법 튜브와 플러시 뼈에 1 ㎖ IMDM 2 %의 FBS 추가 세포 현탁액에서 ~ 500 μl를 흡입하고) 뼈를 통해 다시 세척하고, 유동 cytometr으로 골수 세포를 수집 바이Y 관. 뼈가 흰색으로 나타날 때 세척이 완료됩니다.
- 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 40 μm의 셀 스트레이너 세트를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. IMDM 2 %의 FBS와 같은 매체가 5 ML에 세포 현탁액의 최종 볼륨을 조절 이용하여 셀 스트레이너를 씻으십시오.
- 밀도 구배 원심 분리하여 저밀도 골수 세포 (LDBM)를 준비 :주의 깊게 매체 1.083 ㎍ / ㎖ 750 XG에 15 ML 튜브와 스핀에서 25 밀도 구배 세포 분리의 5 ML에 세포 현탁액의 5 ML 레이어 분없이 브레이크 / 낮은 가속 실온 (RT)에서.
- 뜨는 전송 (모든 것을 최대 15 ML 튜브의 2-ML 마크 버피 코트를 얻기 위해 약) 새로운 15 ML 튜브에 5 분에서 525 XG에 IMDM 2 %의 FBS와 한 번 더 세척을 수행 RT.
- 기음 뜨는 RT에서 5 분 3 ML RBC의 용해 버퍼에 펠렛을 일시 중단하여 남아있는 적혈구 (RBC)를 용해. 적혈구 모세포의 큰 순도는 경우(생화학 적 연구에 대한 예) 최종 단계에서 필요한, 자기 분리에 의해 린 NEG 세포에이 단계에서 더 LDBM 세포를 정화.
- LDBM 또는 린 NEG 세포에서 시작 생체 적혈구 분화 배양 프로토콜 (그림 1A)
- 추가 7 ㎖의 IMDM 2 %의 FBS, 5 RT에서 분 및 구성된 2 ㎖ 적혈구 모세포 성장 매체 (EGM)에서 펠렛 세포를 재현 탁 525 XG에 스핀 :
. 함유 StemPro-34 배지,
나. 2.6 % StemPro-34 중간 보충,
C. 20 % BIT-9500,
D. 900 NG / ML 황산 철,
전자. 90 NG / ML 질산 철,
바. 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민
g. 10 -6 M 하이드로 코티손
아. 갓 사이토 카인을 추가 :
I) 100 NG / ML SCF,
ⅱ) 5 NG / ml의 IL-3,
ⅲ) 3 IU / ml의 에뽀. - 단을 사용하여 자동화 된 세포 계수기를 사용하여 수동으로 또는 현미경에서 세포를 세는ocytometer.
- / 잘 EGM 2.5 ㎖ (2 × 10 5 LDBM의 세포 / ml)의 최종 부피를 37 ° C에서 배양 5 × 10 5 세포의 농도로 6 - 웰 세포 배양 접시 접시 (이 고려된다 문화의 날 # 0)입니다.
- 상층 액 1.5 ㎖를 흡입 RT에서 5 분 525 XG에 회전, 3 사이토 카인을 포함하고 일 # 2에 다시 우물에 매일 추가 새로운 배지 1.5 ㎖에 재현 탁하여 매체를 변경, 3, 4, 최적화 증식기. 3 일째에, 모든 세포를 제거 세고 ~ 2 × 105 세포 / ml의 웰 세포 농도를 유지하기 위해 웰 적절한 개수로 분할. 37 ° C / 5 % CO 2에서 문화를 유지한다.
- 4 일에, 새로운 세포 배양 6 - 웰 플레이트의 우물 판 MS5 세포 (쥐 기질 세포 라인). MS5 세포 배양 배지는 20 % FBS를 함유하는, 100 단위 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 2 mM L-글루타민을 α-MEM된다.
- 5 일에서 수를 계산자동 세포 계수기 또는 수동으로 혈구를 사용하여 현미경에서를 사용하여 원래 배양 플레이트의 각 웰에 세포 (지금은 크게 적혈구 모세포 농축).
- 각 우물에서 모든 셀을 들어 올려 15 ML 원뿔 튜브로 전송, RT, 기음 상층 액에서 5 분 525 XG에 스핀 다운 및 2 × 10의 농도로 만 에뽀 (3 IU / ㎖)를 포함하는 신선한 EGM 펠릿을 용해 5 세포 / ㎖.
- MS-5 세포는 전날 (공동 문화의 시간이 70 ~ 80 % 년 자랄를 대상으로) 도금 만 에뽀를 포함 EGM에있는이 우물의 적혈구 세포를 추가 한 우물에서 대기음 뜨는 (안 자신의 매체이지만 선택은, MS-5 세포는) 몇 일 동안 EGM에서 잘 남아있다.
- 하루 # 6에 신선한 EPO를 추가 매체 변경합니다.
- 더 추가 사이토 카인과 EGM를 사용하여, 하루 # 7 매체를 변경합니다. 일에서 9까지의 7, 세포 계측법 매일 안티 Ter119 및 SYTO-16로 염색 및 P 후 흐름을 적출에 대한 테스트 샘플멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법 (3 절에 설명 된대로)에 대한 샘플을 염색에 roceed.
참고 :. 하루에 2, 4, 6, 문화의 7에 도금하기 전에, 세포 계측법 크기 (FSC) 대 표면 마커 CD44와 Ter119을 평가하여 흐름과 적혈구 모세포 농축과 분화 배양 세포를 모니터 9 또는 CD71, Ter119 및 FSC 도 10, 11을 사용할 수있다.
- 추가 7 ㎖의 IMDM 2 %의 FBS, 5 RT에서 분 및 구성된 2 ㎖ 적혈구 모세포 성장 매체 (EGM)에서 펠렛 세포를 재현 탁 525 XG에 스핀 :
2. 빠른 탈핵 분석, 요시다 등에 의해 기술 된 프로토콜에 따라. 수정 12 (그림 1B)
- 체외 적혈구 문화에 대한 스트레스 적혈구 유도와 기질 세포의 준비
- IACUC의 지침에 따라 2-6 개월 된 야생형 C57/BL6 마우스 (예 : 이소 플루 란 솔루션을) 마취. 마우스가 충분히 부드러운 뒷발 핀치에 반사 반응의 부재과 확인하여 마취되었는지 확인절차를 수행하는 동안 정기적으로 호흡. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 안과 연고를 사용합니다.
- 500 μL의 최종 볼륨에 출혈이 꼬리를 통해 스트레스 적혈구 생성을 유도한다. 인슐린 주사기를 사용하여 복강 동물의 유체 인공 호흡 (주입하기 전에 Trendelenburg 위치에 동물을 보유하고 내부 장기를 손상하지 않도록 낮은 복부에 주입) 보장하기 위해 생리 식염수 같은 양을 주입.
- 새장을 이동하기 시작하고 떨어지지 않고 서서 걸을 수있는 동물로 표시된대로 모터 컨트롤을 회복 할 때까지 무인 마우스를 방치하지 마십시오. phlebotomized 마우스는 다른 마우스없이 케이지에 배치됩니다.
- 이일 후, 24 웰 세포 배양 플레이트의 우물에서 MS-5 세포를 접시. MS5 세포 배지에서 37 ° C / 5 % CO 2에서 MS-5 세포를 품어 (-MEM 20 % FBS를 포함, 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM의 L-글루타민)을 목표로 70 ~ 80이어야합니다 %의 합류 전48 시간 후 N 판 우물.
- 비장과 비장 세포의 처리의 수확
- 네 일 (96 시간) 스트레스 적혈구 유도 한 후, 이전에 IACUC 승인 프로토콜 (자궁 경부 전위 다음에 예를 들면 CO 2 흡입)을 통해 마우스를 출혈 안락사.
- 수확 비장과 IMDM 2 % FBS를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 넣어 얼음에 보관.
- 위로 실험실, 멸균 조건하에 조직 배양 후드에서, 50 ㎖의 튜브 위에 설정된 40 μm의 셀 스트레이너에 비장 함유 관을 반전. 5 ㎖의 플라스틱 주사기의 플런저를 사용하여 비장을 분쇄.
- IMDM 2 %의 FBS와 셀 스트레이너를 세척하고 같은 매체를 이용하여, 5 ml의 세포 현탁액의 최종 볼륨을 조정합니다.
- 조심스럽게 5 ㎖의 밀도 구배 세포 분리에 5 ㎖의 비장 세포 현탁액 레이어 매체없이 브레이크 / 낮은 가속 RT에서 25 분 750 XG에 15 ML 튜브와 스핀에서 1.083 ㎍ / ㎖.
- 이전새로운 15 ML 튜브 및 RT에서 5 분 525 XG에 IMDM 2 %의 FBS와 한 번 더 세척을 수행 상층 액 (버피 코트를 얻기 위해 15 ML 튜브의 2-ML 마크에 대한 아래로 용액) .
- RT에서 5 분 3 ML RBC의 용해 버퍼에 펠렛을 일시 중단하여 기음 뜨는를 Lyse 적혈구.
- 세포를 세척하고 희석하고 4 ℃에서 5 분 525 XG에서 RBC의 용해 버퍼와 스핀을 중화 7 ML의 IMDM에게 2 %의 FBS 추가
- 기음 뜨는 적혈구 모세포 성장 매체 (EGM) 2 ㎖에 펠렛 세포를 일시 중지합니다.
- 플라스틱에 적혈구 모세포 농축 분리 된 저밀도 비장,, (빨리 체외 적혈구 문화의 첫 번째 단계)의 문화
- 자동 세포 계수기 또는 수동 혈구에 의해 세포를 계산합니다. 이 단계에서 비장 당 고립 된 세포의 수는 평소 ~ 15 × 10 6입니다.
- F에 (사이토 카인을 포함하는 더 EGM에있는 세포를 일시 중지원고 판 농도) : SCF 50 겨 / ㎖, IL-5 NG / ML 및 에뽀 2 U / ㎖.
- / 24 - 웰 세포 배양 접시에 1 ㎖ / 웰 (물론 세포의 총 수에 따라 당 세포의 같은 수의)의 최종 부피에서 37 ° C에서 O / N을 배양 플레이트 1-5 X 10 6 세포 5 % CO 2.
- MS5 세포에 적혈구 모세포 (빠른 체외 적혈구 문화의 두 번째 단계의 문화
- 대기음 아니라 플라스틱 뜨는 아니라 각 얼음에 5 분 동안 PBS에서 차가운 10 mM의 EDTA 2 ㎖를 추가하여 (높은 적혈구 모세포 풍부한) 세포를 올립니다.
- (사이토 카인없이) EGM에 한 번 세탁하고 동일한에 재현 탁, 신선한 튜브에 세포를 넣고.
- 에 1 ~ 2 ㎖의 볼륨 접시 5 × 5 -1 X 10 6 세포 각 MS5 셀 코팅 된 24 웰 플레이트의 잘. 약리 억제제가 실험에 사용되는 경우, 현재 적절한 농도를 추가.
- 인도를 6 ~ 8 시간 (시간을 품다치료 WT 샘플의 약 30 % -40 %의 안구 적출술)의 현미경 관찰. MS-5 세포에 적혈구 모세포의 바인딩은 자신의 핵의 제거를 가속화합니다.
- 얼음에 5 분 동안 차가운 PBS + 10 mM의 EDTA 2 ㎖를 추가하여 각 우물에서 세포를 올립니다. 적혈구 모세포와 함께, MS-5 세포는 또한 수집하지만이 나중에 쉽게 FSC 하이 Ter119으로 유세포 분석에서 제외 할 수 있습니다 - 세포.
- 이 단계에서 세포는 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 분석을 위해 고정 및 염색 할 수 있습니다.
3. 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 핵의 제거시 세포 내 단백질이나 지질 뗏목의 지역화를위한 적혈구 모세포의 염색
- , PBS로 세포를 씻어 5 RT에서 분 대기음 뜨는 525 XG에 스핀.
- (고정 시간이 항에 따라 다를 수 있습니다 15 분 동안 PBS 3.7 %의 포름 알데히드 500 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하여 세포를 수정세대 프로빙) 부드럽게 피펫 팅된다.
- 1.5 ㎖의 플라스틱 원심 분리기 튜브로 전송하고 실온에서 15 분 동안 품어.
- 20 초, 대기음 뜨는 부드럽게 각 튜브 및 피펫 500 μL PBS를 추가하여 하나의 세척을 수행하기위한 벤치 마이크로 원심 2,000 XG에 스핀.
- 20 초, 기음 뜨는에 대한 벤치 마이크로 원심 2,000 XG에 스핀 적어도 15 분 동안 얼음에 튜브를 유지. Permeablization는 3.6-3.9 신속하고 효율적으로 수행되어야하고, RT에서 회전 / 포부 다음, 세포 펠렛은 바로 세포가 더 나은 자신의 무결성을 유지하기 위해서는, 얼음에 다시 넣어해야합니다 단계를 반복합니다.
- -20 ° C 냉동고에서 아세톤 솔루션을 꺼내 얼음에 넣어. 부드럽게 500 μL 얼음처럼 차가운 50 % 아세톤 DH (2 O 1:1)과 피펫에서 첫 번째 셀 펠렛을 재현 탁하여 세포를 투과.
- 벤치의 microcentrifuge에 스핀 500 μL에 20 초, 기음 뜨는에 resuspend 세포 펠렛 2,000 XG60; 부드럽게 피펫 팅하여 얼음처럼 차가운 100 % 아세톤.
- 벤치의 microcentrifuge에 스핀 부드럽게 피펫 500 μL 얼음처럼 차가운 50 % 아세톤에 한 번 20 초, 기음 뜨는에 resuspend 세포 펠렛 2,000 XG.
- 벤치의 microcentrifuge에 스핀 2,000 20 초 XG, 대기음 뜨는 부드럽게 피펫 팅에 의해 차가운 FACS 버퍼 (PBS + 0.5 % BSA)에 한 번 세포를 씻으십시오.
- 그 분자에 대한 항체 마커 라벨 칵테일을 준비 적혈구 세포 얼룩에 대한 F-액틴 염색 1 μl/100 μL Ter119-PECy7 0.1 U/100 μL의 AF488-phalloidin도 있습니다. 대체 또는 추가 염색은 (1시 50분), AF-594-복합 콜레라 독소 서브 유닛 B 지질 뗏목에 라벨 (1:200), 안티 pMRLC (Ser19) AF-488-항-β-tubulin에 항체를 사용하여 수행 할 수 있습니다 인산화 된 마이 오신 규제 라이트 안티 - 토끼 AF-488 - 복합 이차 항체 (1:400) 다음 체인 (1시 50분), 및 안티-γ-부르 돈 관에 대한 일차 항체린 차 토끼 항체 (1:100)는 안티 - 토끼 AF-555 - 복합 이차 항체 (1:300) 하였다.
- 상층 액을 흡인 후, 부드럽게 마커 칵테일, 피펫 100 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 핵 얼룩 DRAQ5의 2.5 μM을 포함하는 FACS 버퍼를 준비합니다.
- 벤치의 microcentrifuge에 DRAQ5를 포함하는 60 ㎕의 FACS 버퍼에 20 초, 기음 뜨는에 resuspend 2,000 XG에 스핀 다운, FACS 버퍼에 세포를 씻으십시오.
- 촬상 실행할 샘플 촬상 특정 분석 소프트웨어의 유동 세포 계측기를 사용하여, 실험 당 적어도 10,000 이벤트를 수집 이전에 출판 (13)으로 원시 데이터 파일을 보정하고,도 2에 도시 된 바와 같이 결과를 분석하는 유동 세포 계측기.
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Representative Results
첫째, 세포는 자신의 브라이트 화면 비율 (자신의 장축 대 자신의 미성년자의 길이의 비율)와 자신의 명 시야 영역 (자신의 크기를 나타내는)를 기반으로 분석된다. 명 시야 영역 값 (20)보다 낮은 200보다 높은과 이벤트는 각각 주로 파편과 세포 집계하고, 분석 (그림 2A)에서 제외됩니다. 하나의 셀 (게이트 "R1")는 다음 이미지의 선명도를 나타내는 그라데이션 RMS 매개 변수에 대한 자신의 값을 기준으로 분석됩니다. 게이트 "R2"는 초점 (그림 2B)에서 잘 촬영 한 이미지를 선택하기 위해 50 번째 백분위 수 이상 기온 RMS 값을 포함하는 셀을 만들어집니다. 세포는 그들의 명 시야 영역에 의해 측정 된 자신의 크기에 따라 게이트 및 Ter119 형광 얼룩 평균 픽셀 매개 변수에 의해 측정 된 적혈구 마커 Ter119에 대한 자신의 양성 (게이트 "Ter119 긍정적"그림 2C)된다. Ter119 매우 낮거나 매우 높은 세포는 각각 비 erythroids 또는 남아있는 세포 집합체, 하나, 그리고 분석에서 제외됩니다. 다음 단계에서, 세포는 그들의 DRAQ5 종횡비 강도 (그 핵의 장축 강도 대 마이너의 비율) 및 DRAQ5 (도 2d)의 강도에 기초하여 선택된다. DRAQ5 부정적인 세포 (주로 적출 같은 망상 적혈구와 적혈구 등 세포), 그리고 낮은 DRAQ5 화면 비율 (대부분 이중선)와 세포는 분석에서 제외됩니다. DRAQ5 양성 세포 (게이트 "DNA 긍정적"대부분이 시점에서 적혈구 모세포)는 다음을 나타냅니다 셀의 크기, 자신의 Ter119 평균 픽셀 / 지역 (Ter119 표현의 밀도)를 나타냅니다 자신의 Ter119 지역에 기반 분석 Ter119 염색의 밝기. 정색 적혈구 모세포 (게이트 "OrthoE")는 작은, Ter119 하이 세포 (그림 2E)으로 인식하고 있습니다. 마지막으로, orthochro의 모집단매틱 높게 세포 탈핵 농축 적혈구 모세포는 M01, 높은 델타 무게 중심 XY Ter119함에 브라이트 채널 셀 화상의 단경 / 장경의 비에 의해 계산 된 셀 신도 측정이며 낮은 명 시야 종횡비, 특징적인 초기 Ter119 +-망상 및 DRAQ5 +-핵 (도 2F의 게이트 "탈핵 셀")의 중심 사이의 거리에 의해 정의된다 / DRAQ5.
Ter119에 대한 항체 및 DNA 얼룩 DRAQ5과 함께, 세포는 적혈구 모세포 적출 7시 F-액틴의 현지화를 평가하는 형광 phalloidin도 함께 사상 액틴 (F-액틴) 스테인드되었습니다. 참고로, 적출의 진행은 감소 종횡비 (즉, 점점 더 연장 된) 세포와 같이, 고정 된 세포에서 시각화 될 수 있고 증가 델타 중심 XY Ter119/Draq5가 관찰된다 (도우레 3). F-액틴을 적출하는 동안 분열 밭고랑에 집중 한 다음 핵이 돌출되면 방출이 관찰된다. 또한, 초기 망상과 핵 사이의 분열 밭고랑에서 액틴과 미오신의 공동 현지화 세포 계측법 pMRLC (인산화 된 마이 오신 규제 경쇄) 및 F-액틴 7 WT의 적혈구 모세포의 공동 염색 후 다중 분광 영상의 흐름에 의해 설명 될 수있다.
다른 단백질과 그 구조는 적출하는 동안 자신의 역할의 이미징 연구를 할 수 있도록 적절한 항체 형광 마커로 염색 할 수 있습니다. 극화 된 미세 소관 형성 이전에 안구 적출술에 있지만 콜히친 (그림 4A)으로 처리 적혈구 모세포의 WT 정색 적혈구 모세포에 볼 수 있습니다. CEN 사이의 매개 변수 델타의 중심 XY BF/Draq5 측정에 의해 증명으로 콜히친에 의한 튜 불린 중합 반응의 억제는 세포 분극을 감소브라이트 채널 DRAQ5 (도 4b)로 달성 핵 염색의 중심에서 본 전지 본체의 타.
WT 또는 세미 결핍 (유전 약리학 조작 후)를 활용하여 안구 적출술에있는 세미 GTPases의 역할을 보여 허용 이미징 연구 세포 계측법 다중 분광 영상의 흐름에 적혈구 모세포. 세미 GTPases은 적어도 부분적으로 actomyosin 링의 형성뿐만 아니라 초기 망상과 pyrenocyte 7 사이의 고랑에서 지질 뗏목의 합류를 조절한다.
그림 1. 연구를위한 탈핵 적혈구 모세포를 생산하기 위해 사용되는 적혈구 체외 프로토콜의 개략도 데모. A. 체외 적혈구 문화 장기간으로 시작할LDBM 또는 린에서 ED -.. 매우 정맥 절개에 의한 생체 내에서 스트레스 적혈구 유도 후 적혈구 모세포 풍부한 비장 세포에 의해 시작된 세포 B. 빠른 안구 적출술 분석 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그 인구의 그림 2. 데이터 사이토 이미징 흐름에 특정 분석 소프트웨어를 이용하여 분석. 연속 게이트는 패널의 AF에 표시됩니다. 괄호 안의 숫자는이 실험에서, 대응하는 부모 인구의 대략적인 퍼센트를 나타낸다. R1 인구 A. 초기 게이팅 세포 집합체를 제거및 세포 파편. R1 중 B. 게이트 R2 (R2 중). C. Ter119 양성 세포 초점 세포 밖으로 제외 명확하게 이미지화 된 세포를 포함는 Ter119에 대한 부정적인 하나 또는 수 있습니다 셀을 제외하고, 선택 너무 강렬하게 스테인드 때문에 집계에 자신의 존재의. (Ter119 양성 세포 중) D. DNA 양성 세포는 핵 얼룩의 강도에 비해 화면 비율 강도 플로팅 후, 선택 (여기 채널에서 읽을 DRAQ5 5). E. DNA 및 Ter119 양성 세포가 Ter119 지역 대 Ter119 평균 픽셀에서의 위치에 따라 염기성, polychromatophilic 및 정색 적혈구 모세포에 문이있다 (여기에 채널 읽기 3), 맥그래스 등 (5)에 의해 이전과 같이. F. 탈핵 세포는 낮은 화면 비율 (셀 elongat의 측정이 정색 적혈구 모세포, 밖으로 그 세포입니다시야 (BF) 채널)과 높은 델타 무게 중심 XY Ter119/Draq5 Ter119 + - 망상 및 핵의 중심을 형성하는 중심 사이 (거리)에있는 이온. 이 연구는 원래 혈액에 출판되었다 : KONSTANTINIDIS DG, Pushkaran S, 외 신호와 적혈구 모세포 적출 혈액에있는 세포 골격의 요구 사항을... 2012;. 혈액의 미국 사회 119 (25) :6118-6127 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 점진적으로 Ter119-PECy7, phalloidin도-AF488, 및 D로 염색 델타 무게 중심 XY Ter119/Draq5. WT 마우스 정색 적혈구 모세포를 증가 적혈구 모세포를 탈핵의 대표 이미지raq5, 자신의 화면 비율과 델타 중심 XY Ter119/Draq5 당 문이 있습니다. 세포 (오른쪽에 이미지가있는 셀의 위치를 표시하는 노란색 게이트에서 그린 크로스) 화면 비율을 감소시키고 델타의 중심 XY Ter119/Draq5 증가에 대응하는 진행과, 안구 적출술의 다른 연속적인 단계에서 고정 표시됩니다. 위에서 아래로 셀의 이미지에서, F-액틴은 분열 밭고랑에 집중하고 (셀 # 4782에서와 같이 낮은 이미지에서) 핵이 돌출되면 다음 방출하는 핵의 제거 동안 관찰 할 수 있습니다. 를 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전.
유니 폴라 미세 소관의 조립 및 orthochroma의 편광 그림 4. 형성TIC 적혈구 모세포는 핵의 제거 앞에옵니다. B-튜 불린이 확산 6 시간 동안 콜히친 (5 μM)와 함께 배양 적혈구 모세포에 염색되는 반면 A. 편광 미세 소관 형성, (항-B-튜 블린 - AlexaFluor-488 핵 얼룩 DRAQ5로 염색) 제어 WT의 적혈구 모세포에 볼 수 있습니다 빠른 체외 적출 분석에서. B. 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법은 전지 본체의 중심 간의 거리를 측정 파라미터 델타 무게 중심 XY BF/Draq5의 분포의 분석에 의해 셀 분극의 정량적 평가를 제공 할 수있다 시야와 DRAQ5 (삽입의 개략도) 달성 핵 염색의 중심에서 볼 수있는 것처럼. 콜히친 처리 WT 정색 적혈구 모세포의 델타 무게 중심 BF/Draq5 값은 통계적으로 제어 델타 무게 중심 BF/Draq5 값 (P <0.001)보다 상당히 다릅니다. 이 연구는 원래 Bloo에 발표 된D :.. KONSTANTINIDIS DG, Pushkaran S, 외 신호와 적혈구 모세포 적출술의 골격 요구 사항 혈액. 2012;. 혈액의 미국 사회 119 (25) :6118-6127 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 적혈구 생체 성공적, 대규모 생산을 달성하기 위해 효율적으로 재현하기 가장 어려운 시험 관내 적혈구 조혈 배양 단계이기 때문에 최근에는 적혈구 모세포 적출술의 연구는 운동량을 증가를 얻고있다. 최근까지, 적혈구 모세포 안구 적출술의 연구는 주로 형광 현미경을 이용하고 세포 계측법 방법을 흐른다. 형광 현미경 방법은, 참여 분자를 식별하는 데 도움이라도 특정 시점에 고정 수백 개의 셀 내에 적출술을 시행 정색 적혈구 모세포의 수가 적은 식별 현미경 관찰의 일을 필요로한다. 방법 유동 세포 계측법, 반면에, 문화 적출술의 속도뿐만 아니라,이 과정에서 특정 분자의 약물 또는 유전자 조작의 효과를 평가하는데 매우 유용하지만, intracellul에 어떤 데이터를 제공하지 않는다이러한 분자의 AR 현지화.
그것이 유세포 세포 수천의 형태 학적 데이터 모두의 신속한 취득 할 수 있으므로 멀티 스펙트럼 영상 유동 세포 계측법 유세포 면역 형광 현미경의 장점을 결합한다. 이는 적혈구 모세포의 분화의 여러 단계 이후 (proerythroblasts, 염기성, polychromatophilic 및 정색) 형태 학적 기준 6을 사용하여 정의 된, 적혈구의 연구에서 세포 계측법 고전적인 흐름에 비해 상당한 장점이다. 그러나, 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법은 오히려 인구 수에 상대 정량 비교보다 세포 구조의 시각화를위한 최적입니다. 이러한 비교를 위해, 세포 내 구조의 면역에 필요한 permeabilization 단계를 필요로하지 않는 일상적인 유동 세포 계측법은 더 나은 성능을 제공합니다. 예를 들어 BasoE의 상대적 비율 : PolyE 그림 2E에 OrthoE
촬상 데이터는 게이트 내의 특정 형태 학적 특성을 지닌 세포의 수집을 허용 사이토 촬상 흐름에 특정 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 계측법 흐름과 연관하여 처리 될 수있다. 약 백 탈핵 세포가 더 의미있는 관찰과 통계적인 평가를 허용하는, 빠르고 효율적인 방식으로 7 위에 설명 된 분석 방법 10,000 적혈구 모세포의 인구 내에서 확인할 수 있습니다.
또한, 화상 처리는 델타 무게 중심 XY 같은 특성의 정량적 분석에 핵의 상대 위치 EG 공부 있도록 사이토 촬상 흐름에 특정 분석 소프트웨어로 용이편광의 척도로서 이용 될 수 세포질.
프로토콜 및 문제 해결 내에서 중요한 단계
이곳은에도 부드러운 피펫은 망상과 pyrenocyte (12)의 분리가 발생할 수 있습니다 것으로 알려져있다. 이것은 심각한 묘화 적출 이벤트의 수를 제한 할 가능성이있다. 문화 MS5 세포에 바인딩 적혈구 모세포를 들어 올릴 때 그 결과, 치료는주의해야합니다.
포름 알데히드 용액으로 고정 바인딩 및 / 또는 증가가 아닌 특정 항체 결합 감소 특정 항체의 결과로 표면 마커의 세포 외 영역에 변화를 일으킬 수 있습니다. 촬상 유동의 장점은 사이토 그 표면 염색이 가시화되어 있으며, 따라서 그 품질을 평가할 수있다. 점선 대신 유니폼 등 Ter119 등 풍부한 표면 마커에 대한 염색 overfixation을 나타내며 낮은 formalde의 혼합을 통해 해결해야한다하이드의 농도와 고정 기간 단축.
고정 후, 적어도 15 분 동안 얼음에 세포를 유지 인해 온도차에 permeabilization 과정 중에 과량의 세포 파괴를 방지하기 위해 필수적이다. 아세톤 permeabilization 세제 매개 permeabilization보다 더 깨지기 쉬운 말 erythroids을 유지하지만, 100 % 아세톤이 필요한 단계는 세포의 눈에 띄지 만, 손상하지 않는, 손실이 발생할 것입니다. 끝에, 차가운 FACS 완충액으로 세척 한 후, 세포를 항체 인큐베이션 단계 실온에서 허용된다.
촬상 유동 세포 계수기 (레이트 배율이 증가함에 따라 감소한다) 사용 렌즈에 따라 흐름의 집합 레이트를 (세포 / 초)를 갖는다. 측정 전 마지막 세척 후, 그것은 세포 펠렛 샘플의 처리를 가속화하기 위해, 소량 (50 ~ 60 μL)에 재현 탁하는 것이 좋습니다. 재 샘플들의 다수의(30 분 이상) 실행의 긴 기간을 첩, 샘플은 얼음에 보관해야합니다.
장기 적출 분석은 면역 블롯 같은 생화학 적 평가를 위해 적출 단계에서 수집 및 풀다운을 충분히 할 수있는 세포를 생산하기 위해 확장 된 적혈구 세포 생산의 이점을 제공한다. 마우스 4 일 전에 실험에 phlebotomized 할 필요가 있지만, 빠른 안구 적출술 분석을 수행하기 위해 이틀 만 요구하는 시간의 혜택을 제공합니다. 우리는 두 방법 적출 효율에 큰 차이가 관찰되지 않았다. 7 이전에 설명 된대로 참고로, 세포 내 구조의 면역에 필요한 permeabilization 단계를 필요로하지 않는, 평가, 유동 세포 계측법, 핵의 제거 효율의 정량적 평가에 가장 적합합니다.
기술의 한계
방법은 여기에 요로 감염 설명lizes는 적혈구 인구를 증폭하고 안구 적출술의 단계를 동기화하기 위해 체외에서 하이드로 코르티손을 포함하는 배지에서 생체와 문화에 스트레스 적혈구 생성을 유도. 이러한 조건은 모두 가능성이 스트레스 적혈구 모세포 - 안구 적출술을 모방. 또한, 하이드로 크게 적혈구의 수율과 생존을 증가시킨다. 하이드로 코티손 (따라서 피 동기화)없이 정상 상태의 적혈구 조혈 배양와 야생형 생쥐에서 파생 된 골수 세포에서 핵의 제거 이벤트와 유사한 수율을 얻으려면, 우리는 여러 쥐에서 배양 세포에 필요하고 실행하고 멀티를 통해 더 많은 이벤트를 처리 할 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법. 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법 60 배까지 배율 렌즈를 사용하여 대단히 면역 형광 현미경에 비해 형태의 데이터 수집을 촉진하지만, 영상에서 얻어진 관측의 비교, 클래식, Z-스택 흐름 cytometer100 배와 Z-스택의 이미지가 동일한에서 사이토 이미징 흐름에 의해 달성 할 수없는 구조의 3 차원 느낌을주는까지 현미경의 대물 렌즈 배율을 제공 할 수 있기 때문에 및 공 초점 현미경 이미지는, 더 세부 사항을 얻을 가치가있다 세포. 실험 계측법 다중 분광 영상의 흐름에 수집 유사한 세포의 상대적으로 높은 수는 임의의 방향에서 부분적으로 다른 뷰 지점에서 관측을 허용하는이 제한을 보상한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 전문적인 기술 지원을 Amnis 공사 (EMD Milllipore의 일부)에서 신시내티 아동 병원 연구 재단과 리처드 마르코, Sherree 친구, 스콧 모르드개의 연구 유동 세포 계측법 코어 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다 K08HL088126 및 R01HL116352 (TAK)를 부여하고 P30의 DK090971 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
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