In Vivo Two-foton mikroskopi av enstaka nervändar i huden

Summary

Protokollet för dynamisk longitudinell avbildning och selektiv laser skada i nervändar i reporter transgena möss presenteras.

Abstract

Nervändar i huden är involverade i fysiologiska processer såsom att avkänna ^en liksom i patologiska processer, såsom neuropatisk smärta ^2. Deras nära ytan positionering underlättar mikroskopisk avbildning av hudens nervändar i levande intakta djur. Med hjälp av multifoton mikroskopi, är det möjligt att få fina bilder övervinna problemet med starka ljusspridning i hudvävnaden. Reporter transgena möss som uttrycker EYFP under kontroll av Thy-1 promotor i neuroner (inklusive periferin sensoriska neuroner) är väl lämpade för longitudinella studier av enskilda nervändar över längre tidsperioder upp till flera månader eller till och med livslång. Dessutom använder samma femtosecond laser för avbildning, är det möjligt att producera mycket selektiva lesioner av nervfibrer för studier av omstruktureringen nervfiber. Här presenterar vi en enkel och tillförlitlig protokoll för longitudinell multifoton in vivo imaging ochlaserbaserade mikrokirurgi på mus hud nervändar.

Introduction

Kutan nervändar genomgår dynamiska förändringar under olika patofysiologiska tillstånd. Nervtrådarna kan gå igenom processen för degeneration och regeneration eller omstrukturering under sådana sjukdomar som perifer neuropati ² eller Mortons neurom ^3. Efter traumatisk skada, är en viktig del av nervändar dynamik i huden reinnervation av det skadade området. Men den gemensamt tillvägagångssätt för undersökning av nervändar ex vivo histologisk snitt som saknar realtidsinformation om de pågående processerna ^4. Med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande markörer, är det möjligt att spåra nervändarna i huden på levande djur och på så sätt få rika och betydligt mer relevant information om de strukturella förändringarna. Undersökningen av kutana nervändar som är möjligt med konventionell fluorescensmikroskopi dock det starka ljusspridning i hudvävnaden gräver starkt kvalitetenav de uppgifter som förvärvat ^5. Multifoton mikroskopi medger förvärv av högupplösta bilder i starkt spridande vävnader på grund av den icke-linjära summering av energin i excitation ljus fotoner som resulterar i utsläpp av fluorescens bara ur fokus för målet. Denna effekt leder till en robust ökning i penetrationsdjup och förbättring av signal-till-brusförhållandet för mätningen i hudvävnader ^6. Med samma laser som för avbildning, är det möjligt att framställa selektiva dissektion av nervfibrer ^7. I följande protokoll visar vi metoden för longitudinella avbildning av kutana nervändar i vivo i reporter transgena möss i kombination med selektiv laserskada med hjälp av kommersiellt tillgängliga multifotonmikroskopsystem.

Protocol

Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av National Animal Experiment Styrelsen, Finland.

1 Animal Förberedelse för Imaging

1. Bedöva en mus med intraperitional (IP) injektion av ketamin (0.08 mg per kroppsvikt) och xylazin (0,01 mg per kroppsvikt). Kontrollera anestesi med den bakre tå nypa reflex.
2. Doppa djurets ögon i ögondroppar (Viscotears) för att skydda ögonen från uttorkning.
3. Placera musen på en värmedyna (Supertech) vid 37 ° C för att förhindra hypotermi.
4. Rengör foten pad utsetts för avbildning med 70% etanol.
5. Lägg en droppe vatten på huden av foten pad för nedsänkning koppling mellan huden och täckglas.
6. Sätt plastförpackningar material under baktassen som är placerad under en metallring med lock klass.
7. Justera tjockleken av plastförpackningsmaterialet för att platta huden.
8. Sätt en droppe vatten på locket glass för nedsänkning mellan täckglas och målet.

2 Metal fixator ring Förberedelse

1. För stabilisering av huden utnyttjar metall fixator. Vi använder Community Design skyddade två wing fixator med en metallring (artighet av Neurotar Ltd, Finland). Fyll sprutan med superlim, sätta liten droppe superlim genom nålen på ringen och försiktigt sprida lim för jämn täckning av ringytan. Det är kritiskt att sätta den minimala mängden av lim som behövs endast för en enhetlig täckning, eftersom överdriven mängd lim kan minska området av vyn och hindra efterföljande avbildning.
   ANMÄRKNING: Alternativt kombinationen av en metallstång (underifrån) och standardmikroskopobjektglas (som ett lock) skulle kunna användas för att platta till huden och för att säkerställa korrekt optisk koppling av aggregatet ^14. Två gem skulle kunna användas för att fixera tass mellan glas och metall bar yta (fig 4
2. Täck ringen med mikroskop locket (5 mm diameter, elektronmikroskopi Science).
3. Skruva på ringen fixa på styvt metallstången som montaged på motoriserade mikroskop scenen.

3 Imaging Förfarande

1. Om du använder thy1-YFP-H möss, välj den blå delen av fluorescenslampa spektra att visualisera nervfibrer. Hitta nerven intresset för epifluorescens läget och fokusera på det.
2. Skriv ner koordinaterna för en plats för longitudinell avbildning. Använd ett framknä dyna som referenspunkt. Under de följande avbildning sessioner, upptäcka först Carpal dynan och sedan hitta samma uppströms stora nervfibrer och gå tillbaka genom att använda sparade koordinaterna. Det är viktigt att placera trampdynan i samma riktning vinkelrätt mot metallstången för att hålla samma system av referens.
3. Slå på två-foton-läget. För thy1-YFP-H-möss, är det lämpligt att använda 950 nm våglängd av laserstrålningatt visualisera nervfibrer.
4. Välj laser våglängd och utsläppskanaler (450-480 nm för andra övertonen generationens upptäckt, 520-550 nm för avbildning av YFP-märkta nerver och 580-630 nm för detektion av YFP fluorescens och autofluorescens av håret), börja med låg lasereffekt (3-5%) för att förhindra fotoskador och blekning. Den typiska spänningen på fotomultiplikatorrören är 600-700 V för denna typ av avbildning.
5. Ställ in önskad upplösning (512 x 512 eller 640 x 640 för snabba händelser mätningar, 800 x 800 eller 1024 x 1024 för morfologisk avbildning), axiell steg (1-3 um), tjockleken på provet och tidsintervallen (1-10 min). Exponeringstiden är i storleksordningen 1 ms per en pixel.
6. Först markerar övre och undre gränserna för bildvolymen i programvaran.
7. Skaffa referensbilden stacken för referens innan skadan. Vid behov är det möjligt att spela in baslinjen under flera minuter.
8. Efter avbildning rena kudden med en vävnad och sätta musen i en återhämtning låda vid 36 ° C tills den är helt vaken.
   OBS: Vanligtvis varaktigheten för en bildsession i kombination med laser inducerad skada (se nedan) inte överstiger 1 timme. Vi rekommenderar att kontrollera att djuret är djupt nedsövd varje 10-15 min; Detta bör inte påverka avbildning sig men bör övervägas när experimentella ingrepp planeras. Varaktigheten av effekten av en enda ketamin / xylazyne dos är cirka 30 till 40 minuter, alltså rekommenderar vi att tillämpa ytterligare ¼ till ½ dos efter 25-30 min.
   OBS: Det bör också övervägas när experiment planerar att frekvensen av avbildning sessioner för ett enskilt djur inte bör överstiga 1 session per 2 dagar för att undvika negativa effekter av rerens anestesi.

4. Laser Lesion

1. Efter förvärvet av referensbildstapel, använd bleknings protokollet för att göra en mikro lesion.
2. Öka lasereffekten till 100%.
3. Öka exponeringstiden till 100-1000 ms per region av intresse (100-1,000x fler än vid standard imaging).
4. Outline området för lesionen.
5. Gör skadan genom att slå på blekning.
6. Byt tillbaka till den vanliga bildläge och fortsätta med time-lapse-inspelningar.

5. databehandling och analys

1. Fortsätt med unmixing använder Spectral unmixing plugin i ImageJ ⁸ (Joachim Walter, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Öppna bilden stacken och dela kanalerna.
3. Hitta område utan nerver och hår för bakgrundsmätningarna. Sätt en region of intresse i området.
4. Beskriv noga den del av håret där det är klart kan särskiljas från nerverna.
5. Outline nerven i den del av bilden där det är separat från håret.
6. Spara unmixing matris.
7. Applicera uppmätta unmixing matris för hela bunten.
8. Spara de nya förädlade bildstaplar i * .tif format.

Representative Results

Med användning av den beskrivna tekniken är det möjligt att spåra samma fiber efter lesionen och för att studera degraderingen av de skadade nervändar (Figur 1). Förvärv av stapeln med tjockleken 120-150 nm brukar lämplig för repetitiva avbildning under flera dagar för att hålla hela fibern i synfältet.

Lesionen typiskt kan produceras koncist när plastförpackningsmaterialet justeras för att platta ut huden, så de koUagenskikten visas med likformig intensitet på bilden (figur 2). De nervändar ovanför kollagenskikt är den mest lämpliga för att åstadkomma den exakta lesionen.

Om huden inte är tillplattad, kan bilden förekomma att vara suddig (Figur 3). Intensiteten i denna situation kan ändå vara lämpliga för morfologiska undersökningar av nervtrådarna, men lasern lesion förfarandet skulle hindras.

Figur 1 Tids reda på effekten av laser skada på nervfibrer presenteras som maximal projektionsbilder. De övre bilderna visar fibern före och direkt efter skadan, visar den nedre panelen samma fiber efter 30 min och 10 dagar (vänster och paneler till höger, på motsvarande). Det finns några YFP uttrycker strukturer inte neuronal karaktär som visas 10 dagar efter skada. Dessa strukturer är sannolikt keratinocyter som är kända för att uttrycka Thy1 gen gående i traumatiska tillstånd. Den YFP fluorescens av nervfibrer visas i gult. En pil markerar det område av lesionen. Scale bar 30 | im.

/ftp_upload/51045/51045fig2highres.jpg "src =" / filer / ftp_upload / 51045 / 51045fig2.jpg "/>
Figur 2 Största projektionsbild för nervändar i tillplattad hudområde. Den YFP fluorescens av nervfibrer visas i gult, är den andra övertonen generationen av kollagen som visas i blått. Scale bar 50 | im.

Figur 3 De nervändar i böjda hudområde erhålls som högst z-projektion för flera optiska sektioner. Den YFP fluorescens av nervfibrer och autofluorescens av håret visas i gult, är den andra övertonen generationen av kollagen som visas i blått. Scale bar 50 | im.

ftp_upload / 51045 / 51045fig4highres.jpg "src =" / filer / ftp_upload / 51045 / 51045fig4.jpg "/>
Figur 4 Tassen fixering proceduren med mikroskopglas som täckmantel. Bilden fästs på metallstången med hjälp av standard gem.

Discussion

I den här videon protokoll visar vi metoden för icke-invasiv longitudinell två-foton avbildning av enstaka nervändar.

Dynamiken i hud innervations påverkas vid sådana sjukdomar som psoriasis och perifer neuropati ^2, och i traumatiska skador ^9. Två-foton avbildning möjliggör detaljerad analys av nervfibrer strukturer i kollagenmatrisen. Användningen av transgena reporter möss hjälper till att undvika problemen med färgning av nervtrådar. Thy1-YFP-H-stammen verkar vara tillräckligt robust för morfologisk dataanalys ¹⁰ medan Thy1-mitoCFP möss kan ge en möjlighet för funktionella studier av mitokondriedynamik i nervtrådarna ^11. Den YFP-16 / ICR linje kan användas för observation av Meissner organ ^12. Det alternativa tillvägagångssättet kan vara den virala injektion i dorsala rotganglier för selektiv spårning av specifika neuronpopulationer13.

Det är värt att notera att produktionen av selektiv lesionen inom kollagenmatrisen är starkt hindrad i jämförelse med de övre lagren av huden. Det är därför ibland exponeringstider för dissektion av nervfibrer kan skilja sig så mycket som tiofaldigt medan intensiteten av fluorescensen för avbildnings skiljer på området av 10-20%. För att upprätthålla en god kvalitet på bilden konstant nedsänkning kopplingen måste hållas.

Upplösningen på bilden beror oftast på den önskvärda hastigheten för förvärvet. Typisk tid för produktion av en 30 frames- stack med upplösning 800 x 800 bildpunkter är 1 min, så man kan sänka upplösningen eller tjocklek avbildade området för att upptäcka snabba förändringar eller öka upplösningen för fina morfologiska egenskaper studier.

Fixering av fotsulan bör vara tillräckligt tät för att inte tillåta avdrift av bilden, men på samma gång är det inte bör påverka blodcirkulationen i than hud. För optimering av förfarandet, injektioner av blodkärl spårämnen (t.ex. märkt TexasRed 70 kDa dextran) är möjliga, vilket tillåter en att justera plastförpackningsmaterialet tryck via övervakning av blodflödet. Motion artefakter i beredningen beskrivs i detta protokoll är osannolika eftersom djuret är djupt nedsövd, är tassen sig ordentligt fäst vid fixeringsenheten, och eftersom hjärtslag och andningsrörelsen inte direkt överföras till tassen. Men små rörelser är möjliga, särskilt om hög förstoring bildbehandling utförs. I så fall kan vi rekommendera att använda ImageJ plugins för att kompensera rörelseartefakter.

Den repetitiva avbildning av samma område kan uppnås genom användning av sådana referenspunkter som carpal dynan ^14, eller i fall av injektion av vissa ämnen i trampdynan fläcken av injektion kan fungera som ett landmärke ^6. Den andra möjligheten är tatuering av huden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782