Introduction
وقد تم التحقيق بشكل مكثف الجسيمات الشحمية وبمثابة واحدة من نظم لتقديم الأدوية الطبية الحيوية الأكثر حيويا لتطبيقات سريرية 1،2. وهي تتألف أساسا من الدهون الفوسفاتية والكوليسترول، وكلاهما مركبات حيويا محاكاة أجزاء من أغشية الخلايا الطبيعية. في حين أن المواد المائية يمكن شرك في المناطق الداخلية مائي، يمكن إدراجها كلاء محبة للدهون داخل طبقة ثنائية فسفوليبيد liposomal 3. تغليف المواد داخل الداخلية مائي من الجسيمات الشحمية يمنح الحماية ضد تدهور في الجسم الحي، وكذلك يمنع النظام المضيف من التأثيرات السامة للأدوية السامة للخلايا المستخدمة في العلاج من الأمراض، لمبحث المعالجة الكيميائية المثال تهدف إلى تدمير الخلايا السرطانية. تعديل سطح liposomal مع البوليمرات مثل polyethylenglycol (من مضاد) يمتد مزيد من الوقت تداول liposomal الدم في الجسم الحي بسبب الاستقرار sterical 4. Moreovإيه، يمكن أن الجسيمات الشحمية بتنحية تركيزات عالية من العديد من المواد مثل البروتينات 5،6، 7،8 المواد المائية والإنزيمات 9. ولأنها تخدم الأدوات العلاجية والتشخيصية السريرية موثوق بها والتي تستحق موافقتهم على تسليم الأدوية السامة للخلايا مثل دوكسوروبيسين لعلاج السرطان 4. نظرا لمرونتها، الجسيمات الشحمية يمكن أيضا أن تكون محملة fluorochromes لأغراض الجراحية التشخيصية وموجهة الصورة.
يوفر التصوير مضان فعالة من حيث التكلفة وغير الغازية في أداة تشخيصية الجسم الحي والتي مع ذلك، يطالب بعض المتطلبات الأساسية. يمكن أن ثبت أن fluorochromes التي تتناسب بشكل افضل للتصوير في الجسم الحي يكون امتصاص مميزة والحدود القصوى للانبعاثات في النطاق حيث تشتت الضوء ونثر وكذلك تألق ذاتي الأنسجة القادمة من المياه والهيموغلوبين منخفضة. وهكذا، هذه المجسات لها من ماكسيما ABS / م بين 650 و 900 نانومتر (10). وبالاضافة الى هذا، واستقرار fluorochromes سواء في التجارب المختبرية والحية أمر بالغ الأهمية، كما طهاية والتخليص السريع يمكن أن تحد كثيرا تطبيقها لفي الجسم الحي التصوير 11. آثار أخرى مثل ضعف الاستقرار وانخفاض الحساسية أو آثار السامة للخلايا على الأعضاء المستهدفة كما رأينا مع الأخضر الإندوسيانين (ICG) 12-16، وغير المرغوب فيها ويجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم تحقيقات للتصوير في الجسم الحي. وقد أدت هذه الملاحظات إلى التنمية النشطة العديد من fluorochromes NIR قبل السريرية، الجسيمات النانوية وكذلك تقنيات جديدة للتصوير في الجسم الحي من عمليات التهابات والسرطان وللصورة موجهة جراحة 17-20. وعلى الرغم من استقرار معظم (مضان بالقرب من الأشعة تحت الحمراء) NIRF قبل السريرية الأصباغ في المختبر، نضح السريع والتخليص من خلال الكبد والكلى تعوق استخدامها في التصوير في الجسم الحي البصري للأمراض والعمليات الالتهابية.
ntent "> ونحن بالتالي تقديم بروتوكول للتغليف من fluorochromes مثل تتميز كذلك بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت DY-676-COOH، والمعروف عن ميلها إلى إخماد الذاتي بتركيزات عالية نسبيا 21 في الجسيمات الشحمية. بتركيزات عالية H- تشكيل ديمر و / أو التفاعلات بين الجزيئات fluorophore تقع ضمن فورستر نتيجة دائرة نصف قطرها بعضهم البعض في فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) بين جزيئات تألقي. وفي تركيز منخفض الفضاء بين زيادات جزيئات fluorophore، وبالتالي منع التفاعل التراص PI-التراص بي و -H ديمر تشكيل ومما أدى إلى انبعاث مضان عالية، والتبديل بين تركيز عال ومنخفض والتبريد مضان المرافق وتفعيل هي استراتيجية واعدة التي يمكن استغلالها للتصوير الضوئي (22). وفي هذا الصدد، التغليف من تركيزات عالية من الصبغة NIRF DY-676-COOH في المناطق الداخلية مائي من الجسيمات الشحمية هو أكثر كرة القدمvorable لفي الجسم الحي التصوير من الصبغة مجانا. التحدي المتمثل في طريقة يكمن أولا وقبل كل شيء في التغليف الصحيح وثانيا، في المصادقة على الفوائد الناتجة عن التغليف تركيزات عالية من الصبغة. وبمقارنة خصائص التصوير من الجسيمات الشحمية مروي مع أن من صبغ مجاني وأيضا مع صياغة غير مروي الحويصلية مع تركيزات منخفضة من الصبغة أمر لا غنى عنه. وتبين لنا من خلال ترطيب فيلم وقذف بروتوكول بسيط، ولكن فعالة للغاية جنبا إلى جنب مع بديلة تجميد والذوبان الدورات التي التغليف تركيزات التبريد من DY-676-COOH في الجسيمات الشحمية هو ممكن عمليا. أساليب أخرى تستخدم لإعداد الجسيمات الشحمية مثل الطور المعكوس طريقة التبخر 23 فضلا عن طريقة حقن الإيثانول 24 تمكن إعداد الحويصلية مع الكفاءة العالية التغليف لكثير من المواد المائية. ومع ذلك، فإن طبيعة المادة المراد مغلفة يمكن أن تؤثر على كفاءة التغليف. في الواقع،وترطيب الفيلم وقذف بروتوكول المقدمة هنا كشفت أعلى كفاءة لتغليف من DY-676-COOH. لتوضيح فوائد liposomal التغليف من DY-676-COOH، وهذا نموذج وذمة الناجم عن زيموزان، الذي يسمح دراسة عمليات التهابات في غضون ساعات قليلة، كانت تستخدم. هنا، ثبت أن الجسيمات الشحمية مع تركيزات عالية من مغلفة DY-676-COOH هي أكثر مناسبة للجسم كله في التصوير الضوئي الجسم الحي من العمليات الالتهابية من الصبغة مجانا أو صياغة غير مروي liposomal مع تركيزات صبغ منخفضة. وهكذا فإن البروتوكول الأساسي يوفر طريقة بسيطة وسريعة لإنتاج الجسيمات الشحمية الفلورسنت مروي والتحقق من التنشيط والتصوير إمكاناتهم سواء في التجارب المختبرية والحية.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الحيوان الإقليمية وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية بشأن استخدام الأخلاقي للحيوانات.
1. إعداد المواد والأدوات
- إعداد تشكلت عفويا تشتت الحويصلة (SFV)
- حل وإعداد حلول المخزون من الدهون الفوسفاتية التالية: 214 ملغ / مل فسفاتيديل البيض (EPC)، 134 ملغ / مل الكولسترول، 122 ملغ / مل 1،2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [ميثوكسي (البولي ايثيلين جليكول) -2000] (ملح النشادر) (MPEG 2000 -DSPE) و 2 ملغ / مل 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazol-4 -yl) (ملح النشادر) (NBD-مخدر) في الكلوروفورم وتخزينها في قارورة زجاجية.
- تقديم حوالي 3 مل الكلوروفورم في قاع القارورة المستديرة ونقل حجم مناسب من حل الأسهم فوسفورية في الجزء السفلي قارورة مستديرة لإعداد الجسيمات الشحمية مكونة من EPC: تشول: MPEG 2000 -DSPE في نسبة المولي 6.5: 3: 0.5. لوضع العلامات مضان مزدوج من الجسيمات الشحمية إضافة 0.3٪ مول دبي الوطني-مخدر إلى حل الدهون.
- تتبخر الكلوروفورم من الحل فسفوليبيد العضوية تحت ضغط منخفض (300 م بار) عند 55 درجة مئوية باستخدام المبخر الدوار.
- بعد تشكيل لفيلم فوسفورية متجانسة، والحد من الضغط إلى 10 م بار لمدة 1-2 ساعة لإزالة إيداع الكلوروفورم المتبقية.
- في حين أن الكلوروفورم تتبخر، ويحل DY-676-COOH (6.181 ميكرومتر) في 10 ملي تريس العازلة الرقم الهيدروجيني 7.4 وملء وعاء ديوار مع النيتروجين السائل. التبديل على حمام بالموجات فوق الصوتية وضعت في 50 ° C.
- نقل حجم مناسب (0.5-1 مل) من DY-676-COOH (6.181 ميكرومتر) حل لأسفل القارورة المستديرة لترطيب الفيلم فوسفورية الجاف ودوامة بقوة حتى حويصلة تشكلت عفويا (SFV) أشكال التشتت. تأكد من أن كل من الدهون الفوسفاتية وفرقت لتجنب فقدان الدهون.
- هيئة تنظيم الاتصالات بعنايةnsfer أسفل القارورة المستديرة التي تحتوي على تشتت SFV في النيتروجين السائل وتجميد تشتت لمدة 3-5 دقيقة. ضع أسفل القارورة المستديرة في حمام بالموجات فوق الصوتية عند 50 درجة مئوية لذوبان الجليد تشتت ثم دوامة تشتت بقوة لمدة 1-2 دقيقة. كرر هذا الإجراء ست مرات، مما يجعل ما مجموعه سبعة تجميد والذوبان دورات.
- قذف SFV لتشكيل الحويصلات الحويصلية متجانسة
- نقل تشتت SFV إلى 1 مل حقنة (حقنة-أ) وقذف تشتت عبر غشاء البولي 100 نانومتر باستخدام الطارد-LiposoFast الأساسية إلى حقنة-ب.
- قذف تشتت من حقنة-ب، والعودة إلى حقنة واحد، ثم كرر دورة عشر مرات. بسبب قذف، والحل في التغييرات حقنة من مظهر ضبابي إلى تشتت واضح مع الوقت. بعد عشر دورات (عشرون الخطوات قذف واحدة) إزالة حقنة-ب من الجهاز وقذف تشتت للمرة الأخيرة من حقنة واحد مباشرة في عقيمة1.5 مل أنبوب رد فعل.
- تنقية liposomal مغلفة DY-676-COOH من الصبغة مجانا
- إعداد عمود هلام اللوني باستخدام الخرز G25 غارقة في 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 (العمود طول 28 سم، وقطره 0.8 سم).
- نقل 0.5 مل من مقذوف حويصلة التشتت على السرير جل والسماح للعينة هجرة في مصفوفة هلام.
- أزل الليبوزومات مع 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 (الشكل 1A) ويغسل العمود حتى المصارف صبغة خالية تماما من العمود. إذا لزم الأمر، جمع وإعادة تدوير الصبغة المجاني من تحلية والجفاف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تركيز الجسيمات الشحمية مزال من قبل تنبيذ فائق (200،000 x ج، 2 ساعة على 8 ° C) ثم انطلاقها فى حجم كاف من معقمة 10 ملي تريس درجة الحموضة العازلة، 7.4.
- الكمي لتركيز مغلفة DY-676-COOH
- إعداد منحنى المعايرة عن طريق إذابة DY-676-COOH (0، 82، 124،247، 494، 988 نانومتر) في 10 ملي تريس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4 تحتوي على 0.1٪ تريتون X100.
- حل 2 ميكرولتر (100 نانومول الدهون النهائي من 50 مليمول / لتر الأسهم) من الجسيمات الشحمية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 100 ميكرولتر تريس العازلة التي تحتوي على 1٪ تريتون X100 لتدمير الحويصلات والافراج عن صبغ مغلفة. ثم تمييع العينات مع 10 ملي تريس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4 إلى تركيز تريتون-X100 النهائي من 0.1٪ (ت / ت) مما يجعل إجمالي حجم 1 مل. إعداد جميع العينات في مكررة.
- قياس امتصاص وانبعاث جميع العينات (مجانا DY-676-COOH وتريتون-X100 تعامل الجسيمات الشحمية) في الإثارة λ = 645 نانومتر، وانبعاث λ = 700 نانومتر. إنشاء واستخدام منحنى معايرة الصبغة حرية تحديد تركيز الصبغة مغلفة.
- توصيف الحويصلية
- تحديد الأحجام وزيتا إمكانات الجسيمات الشحمية التي تشتت الضوء الديناميكي. تمييع عينات liposomal مع فلتر المعقمة (0.2 ميكرون) 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 إلى ميلانoncentration 100-300 ميكرومتر (الدهن). نقل العينات المخفف إلى انخفاض حجم كوفيت القابل للتصرف وقياس العينة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- توصيف الجسيمات الشحمية بواسطة المجهر الإلكتروني لإثبات حجم والنزاهة وتجانس الحويصلات liposomal وفقا لبروتوكولات القياسية.
2. التحقق من الإسفار، التبريد وتفعيل الليبوزومات محضرة
- تحليل فيزيائية للتبريد مضان وتفعيل
- إعداد اثنين من 1.5 مل أنابيب لالشفاه-Q و 2 أنابيب للالمجاني DY-676-COOH. نقل 100 نانومول الدهون الكلية (2.38 ميكرولتر من محلول المخزون / L الشفاه-Q 42 مليمول، التي تحتوي على 138 ميكروغرام / مل من مغلفة DY-676-COOH) في أنابيب المقابلة. انتقال حر DY-676-COOH ما يعادل محتوى صبغ الشفاه-Q (0.38 ميكروغرام مما يؤدي على سبيل المثال من 138 ميكروغرام / ميكرولتر 1،000 X 2.38 ميكرولتر الشفاه-Q المستخدمة). احتضان حوض واحد(ه) من كل مسبار في 4 درجات مئوية، وتجميد الأنبوب الثاني في -80 درجة مئوية خلال الليل (16 ساعة).
- تسخين كتلة التدفئة إلى 30 درجة مئوية. ملء مربع التبريد مع الثلج المجروش وتتوازن قسامة من 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 إلى درجة حرارة الغرفة.
- إزالة تحقيقات من 4 ° C وتتوازن في درجة حرارة الغرفة (ملفوفة في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء) وبسرعة ذوبان الجليد تحقيقات من -80 ° C إلى 30 ° C لمدة 5 دقائق. هدئ تحقيقات إذابة على الجليد لمدة 1 دقيقة قبل نقلهم إلى درجة حرارة الغرفة (ملفوفة أيضا في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء).
- إضافة 10 ملي تريس العازلة (درجة الحموضة 7.4) إلى كل من تحقيقات إلى 100 الحجم النهائي ميكرولتر وتتوازن جميع تحقيقات في RT لمدة 10 دقيقة.
- ماصة 80 ميكرولتر من كل مسبار في كوب انخفاض حجم كفيت وقياس امتصاص كل مسبار 400-900 نانومتر على مطياف. إعادة التحقيق لأنابيب يناظرها.
- نقل 80 ميكرولتر من كل مسبار إلى كوفيت الزجاج مناسبةوقياس الانبعاثات مضان على الطيفي بواسطة مثيرة تحقيقات في 674 نانومتر وقياس مضان 694-800 نانومتر.
- امتصاص الخلايا وتنشيط مضان
- الحصول على وثقافة خطوط الخلايا التالية في وسائل الإعلام ثقافة المقابلة وفقا لظروف قياسية (37 ° C، 5٪ CO 2 والجو مرطب 95٪). هنا، استخدم J774A.1 الفئران البلاعم خط الخلية (Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر تستكمل مع 10٪ (ت / ت) مصل العجل الجنين)، وورم أرومي دبقي خط الخلية البشرية، U-118MG (MEM تحتوي على الفيتامينات الأساسية و 10٪ (ت / ت) مصل الجنين العجل) ويفية خط الخلية البشرية، HT-1080 (RPMI مع 5٪ FCS).
- معطف 8 جيدا الشرائح غرفة مع بولي-L-ليسين (إضافة 100 ميكرولتر 0.001٪ بولي-L-ليسين إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. حل نضح والسماح للالشرائح غرفة لتجف لمدة 4 على الأقل ساعة على RT على طاولة العمل العقيمة. شطف الشرائح غرفة 3مرات مع محلول ملحي مخزنة 200 ميكرولتر هانك ثم ختم لهم البارافين ورقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 ° C حتى الحاجة.
- في حين أن الشرائح غرفة تجف، فلتر تعقيم الجسيمات الشحمية ومحلول الصبغة وتخزينها في 4 ° C حتى الحاجة.
- لتحليل التحقيق مع امتصاص الجسم كله في الجسم الحي NIR نظام التصوير مضان، وإعداد 5 قوارير الثقافة صغيرة لكل من خطوط الخلايا 3 اختبار (15 قوارير في المجموع). البذور 2 × 10 6 J774A.1، U-118MG والخلايا-HT 1080 في قارورة الثقافة مع 5 مل من مستنبت المعني (في quintuples) وتنمو ل16-24 ساعة. موازية لقوارير الثقافة والبذور 30،000 خلايا كل خلية خط (J774A.1 وHT-1080) أو 20،000 الخلايا (U-118MG) إلى 2 الآبار من الشريحة الغرفة على التوالي وتنمو في 500 ميكرولتر مستنبت لل16-24 ساعة .
- في اليوم التالي، إضافة 100 نانومول (مبلغ الدهون النهائي) من الشفاه-Q إلى 2 قوارير في خط الخلية وكذلك واحد من كل خط الخلية على الشريحة الغرفة.نقل على الفور 1 قارورة في كل سطر الخلية إلى 4 درجات مئوية، والقارورة الثانية إلى الحاضنة.
ملاحظة: حجم تحقيقات تضاف إلى قوارير والشرائح الغرفة هي نفسها، مما يجعل التركيز على الشرائح غرفة 10 أضعاف أعلى (5 مل هو 500 ميكرولتر مستنبت). وهذا أمر ضروري لأن الكشف المجهري هو أقل حساسية من نظام التصوير NIR مضان حيث يتم تصوير الكريات خلية من قوارير. - إضافة المجاني DY-676-COOH في يعادل تركيز على المحتوى صبغ الشفاه-Q إلى الخلايا في 2 قوارير في خط الخلية وكذلك واحد من كل خط الخلية على الشريحة الغرفة، ثم نقل على الفور 1 قارورة في خط الخلية إلى 4 ° C (نضوب الطاقة) وقارورة أخرى جنبا إلى جنب مع الشريحة الغرفة إلى الحاضنة. احتضان كل الخلايا لمدة 24 ساعة في الظروف المماثلة. الخلايا في قارورة دون تحقيق تخدم السيطرة غير المعالجة كما.
- NIRF التصوير والتحليل شبه الكمي
- بعد 24 ساعة مدة الحضانة، وحصاد الخلايا في قوارير عن طريق غسل الخلايا 2 مرات مع هانكس مخزنة محلول ملحي (HBSS) ثم تتخلص من الخلايا في 500 ميكرولتر HBSS وبيليه بواسطة الطرد المركزي (5 دقائق في 200 x ج) في 500 ميكرولتر أنابيب.
- وضع أنابيب مع الكريات الخلية (وHBSS) في تصوير NIRF والصورة باستخدام المرشحات للالإثارة (615-665 نانومتر) والانبعاثات (قطع في> 700 نانومتر).
- خصم تألق ذاتي وتقييم شدة هدف مقابل تألق ذاتي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وهذا يعطي مستويات شبه الكمية للكثافة مضان كما متوسط إشارة (التهم تحجيم / ثانية)، التي تمثل مستويات العد بعد التوسع لمدة التعرض، وزيادة الكاميرا، binning وعمق البت، بحيث قياسات قابلة للمقارنة بين بعضها البعض.
- التحليل المجهري متحد البؤر
- بعد 24 ساعة الحضانة، وحصاد الخلايا على شرائح الغرفة عن طريق غسل 2 مرات مع 500 ميكرولتر HBSS.
- إصلاح مLLS مع 200 ميكرولتر HBSS تحتوي على 3.7٪ (ت / ت) الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة في RT.
- في حين تثبيت يجري، يخفف من وصمة عار DNA، هويشت-33258 01:50 بمحلول المتزايدة.
- بعد التثبيت، وغسل الخلايا 2 مرات مع HBSS ثم فصل الدوائر من الشرائح الزجاجية. إضافة 50 ميكرولتر تصاعد محلول يحتوي على الحمض النووي وصمة عار على كل بقعة المقابلة لآبار الشرائح الغرفة. تغطية الخلايا مع coverslips الزجاج، وختم حواف مع طلاء الأظافر الشفاف والهواء الجاف لمدة 10 دقيقة في RT (الظلام).
- خلايا صورة على مضان المجهر مناسبة أو المجهر متحد البؤر. استخدام الإعدادات الإثارة وانبعاث التالية لرؤية مكونات المقابلة: نوى (هويشت-33258: الإثارة 405 نانومتر، والانبعاثات 420-480 نانومتر). NBD-مخدر (liposomal الدهون: الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر). DY-676-COOH (NIR صبغة الفلورسنت: الإثارة 633-645 نانومتر، والانبعاثات 650-700 نانومتر).
ملاحظة: تأكد من أن مضان المجهرتم تجهيز توفرة مع المرشحات المناسبة التي تسمح الإثارة وانبعاث موجات أعلى من 630 نانومتر.
استنادا الحويصلية-3. في فيفو الإسفار التصوير من التهاب
- إعداد الحيوانات والمواد
- البيت القديم الأسبوع 8-12 الفئران NMRI الذكور تزن حوالي 36 غرام تحت ظروف قياسية مع بالمال وبالشهرة أيضا الطعام والماء الإعلانية.
- سبعة أيام قبل بداية التجارب، وإعطاء كل الفئران لنظام غذائي منخفض pheophorbide من أجل الحد من تألق ذاتي الأنسجة.
- قبل أربع وعشرين ساعة من بداية كل تجربة، يحلق الفئران في المنطقة المرغوبة (مثل منطقة الظهر كاملة إذا هو المطلوب التصوير وذمة هند الساق).
- وزن الحيوانات وحساب كمية التحقيق ليتم حقنه في الماوس (الشفاه-Q والشفاه-DQ في 10 مكرومول (تركيز الدهن) لكل كيلوغرام من وزن وخالية DY-676-COOH (أي ما يعادل صبغ محتوى الشفاه-Q تستخدم) .
- صورة الحيوانات فيعلى الجسم كله NIR الإسفار تصوير مع نفس الإعدادات المستخدمة في الكريات الخلية. يوفر هذا القياس تألق ذاتي من الحيوانات.
- حل 10 ملغ زيموزان-A في 1 مل من محلول ملحي متساوي التوتر وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تحريض التهاب في الجسم الحي وNIRF التصوير
- إعداد 3 الحقن في الماوس التي تحتوي على الحلول التالية. ملء حقنة واحدة مع 50 ميكرولتر زيموزان-A حل (10 ملغ / مل)، والحقنة الثانية مع 50 ميكرولتر محلول ملحي متساوي التوتر. ملء الحقنة الثالثة مع تحقيقات، يتم فيه تحديد الشفاه-Q والشفاه-DQ (10 ميكرومول / كجم من وزن (الدهن)) للحيوانات الاختبار وخالية DY-676-COOH (تركيز كما هو الحال في الشفاه-Q) للحيوانات السيطرة. تأكد من أن يتم تخفيفه تحقيقات مع معقم HBSS إلى 150 الحجم النهائي ميكرولتر.
- تطبيق كريم العين على عيون الحيوانات لتجنب جفاف وتخدير الحيوانات مع 2٪ الأيزوفلورين حتى أنهم نائما بعمق ولا تتفاعل عند لمسها على الكفوف (وهذا يستغرق حوالي 2 دقيقة).
- ضع الماوس على حصيرة دافئة (لا يزال تحت التخدير) وحقن-A زيموزان تحت الجلد حل على الساق الخلفية اليمنى ومحلول ملحي على الساق الخلفية اليسرى. حقن مباشرة التحقيق عن طريق الوريد وصورة الحيوان بعد ذلك ثم وقت قياسي من حقن / قياس (كما ر = 0 ساعة). حفظ الصور الناتجة كما مكعبات الصورة وكرر الخطوات المذكورة أعلاه لجميع الحيوانات الأخرى وتحقيقات منها.
- صورة الحيوانات كل 2 ساعة لمدة 10 ساعة حقن آخر، ثم في 24 ساعة حقن آخر، والتأكد من أن مرحلة من غرفة القياس دافئة (على سبيل المثال، عن طريق وضع حصيرة الدافئة تحت)، وذلك لتجنب انخفاض حرارة الجسم. بعد كل قياس، ووضع الحيوانات في قفص مع الغذاء والمياه الإعلانية بالمال وبالشهرة أيضا ووضع القفص في غرفة الحيوان المعتدلة. الموت ببطء الحيوانات عن طريق التخدير الأول مع 2٪ الأيزوفلورين حتى الحيوانات لم تعد تستجيب للمس، ثم الموت ببطء مع ثاني أكسيد الكربون لمدة 5-10 دقيقة، مما يجعلتأكد من أن الحيوانات توقف التنفس تماما ويحدث تيبس الميت.
- تشريح الفئران وفقا لبروتوكولات القياسية والتي يمكن تقييمها على الانترنت (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) وصورة الأجهزة.
- تقييم نتائج القياس وفقا لتعليمات الشركة الصانعة التي كتبها خصم لأول مرة مضان العام للحيوانات (unmixing) ثم المناطق إسناد من الفائدة للتألق ذاتي (من اليسار الساق الخلفية مع المياه المالحة) ومضان المستهدفة من منطقة ملتهبة (الساق الخلفية اليمنى مع زيموزان-A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تغليف من تركيزات عالية من الأصباغ الفلورية مثل NIRF صبغ DY676-COOH المستخدمة هنا في الداخل مائي من الجسيمات الشحمية يؤدي إلى مستوى عال من مضان التبريد. تبريد مضان، وهي ظاهرة شهدت مع العديد من fluorophores في تركيز عال، يمكن استغلالها في العديد من تطبيقات التصوير الجسم الحي حيث طالب حساسية عالية وموثوقية الكشف عن المنطقة المستهدفة. استخدام الجسيمات الشحمية أيضا يوفر الحماية للصباغة الذي لا غنى عنه للتطبيقات في الجسم الحي. توصيف دقيق للالجسيمات الشحمية ضروري ويتضمن عدة عوامل مثل مستوى صبغ مغلفة والاستقرار وحجم الجسيمات الشحمية، مضان تبريد ونشاط صبغ مغلفة في المختبر، وأيضا تطبيق لأغراض التصوير في الجسم الحي. مقارنة بين صبغ الحرة، DY-676-COOH والجسيمات الشحمية مروي (الشفاه-Q) فضلا عن الحويصلية غير مروي (الشفاه-DQ) مع منخفض جدا تناسقالتموينية للصباغة مغلفة هي بالتالي الحرجة وخاصة بالنسبة للفي الجسم الحي الأوصاف.
الجسيمات الشحمية باستخدام الماء فيلم وتقنية البثق مع تجميد التوالي وذوبان الجليد دورات قبل قذف أعدت تحتوي على جزيئات الصبغة المتبقية الحرة التي يمكن فصلها بنجاح من الجسيمات الشحمية بسبب أطول الاحتفاظ بها في المصفوفة الترشيح هلام، بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية التي أزل أسرع ( الشكل 1B). اعتمادا على مستوى التخفيف بعد الترشيح هلام، خطوة تنبيذ فائق اختياري تمكن تركيز الجسيمات الشحمية كما هو موضح (الشكل 1C). وبناء على امتصاص وانبعاث خصائص الصبغة مغلفة، وتركيز الصبغة مغلفة عازم بمساعدة منحنى معايرة للصباغة مجانا (1D الشكل). إلى جانب تركيز الصبغة مغلفة، فمن المهم تحديد حجم وتجانس الخلف الجسيمات الشحميةإعداد إيه. كما رأينا في الشكل 1E، الميكروسكوب الالكتروني من الجسيمات الشحمية التي كتبها الطريقة الأساسية إعداد تكشف عن التشكل في الغالب unilamellar من الحويصلات liposomal، التي تحتوي على intravesicular DY-676-COOH سواء داخل نطاق تركيز تبريد (الشفاه-Q، 606-846 ميكرومتر DY-676 ) أو على تركيز الصبغة غير مروي (الشفاه-DQ، و 25 ميكرومتر DY-676). وعلاوة على ذلك، فإنها تكشف عن حجم التوزيع متجانس من حوالي 120 نانومتر ومؤشرات التشتت المتعدد أقل بكثير من 1 (الجدول 1). ونظرا لمضان التبريد، ويظهر الشفاه-Q اثنين ماكسيما امتصاص في المخزن المائي، حيث يتميز الذروة واحدا تلو التحول نحو الأطوال الموجية الزرقاء. وتماشيا مع ذلك، فإن الانبعاثات مضان منخفضة جدا بالمقارنة مع صبغة مجانا (الشكل 2A وباء، والحق). تجميد الضرر من نتائج الجسيمات الشحمية في الإفراج عن الصبغة التي يحصل المخفف في الحل المحيطة بها. امتصاص ذروة تحول اللون الأزرق لذا ديsappears، مما أدى إلى ذروة امتصاص واحدة من الشفاه-Q. المقابلة إلى ذلك، شهدت زيادة في كثافة مضان من التي تضررت تجميد الشفاه-Q، مما يدل على أن تفعيل استغرق مضان من جزيئات الصبغة صدر المكان. الصبغة خالية يكشف فقط كحد أقصى واحد امتصاص وكثافة مضان العالية والتي تظل في نفس المستوى، بغض النظر عن التجميد (الشكل 2A وباء، اليسار). تشير هذه النتيجة إلى تغليف للصباغة في الجسيمات الشحمية، كما هو الحال في الشفاه-Q ستحمي الصبغة من البيئة، في الحفاظ على تركيز عال وتبريد مضان المرتبطة بها وإذا تفعيلها من خلال محفزات الهدف سيمكن الكشف يرجع إلى زيادة في مضان.
تحقيقات Liposomal لتكوين الدهون الكامنة تكشف عن وجود امتصاص أكلة السائد الذي تحول دون نضوب الطاقة. ويمكن ملاحظة ذلك من خلال الإقبال على الشفاه-Q من قبل أكلة غاية الفئران خط خلية بلعم J774A.1، وأكلة أقل ما يقال خط خلية ورم أرومي دبقي البشري U-118MG في 37 ° C وتثبيط عند 4 درجات مئوية (3A الشكل وباء). الصبغة خالية DY-676-COOH يكشف امتصاص في خطوط الخلايا البلعمية على حد سواء عند 37 درجة مئوية وعند 4 درجات مئوية مما يدل على أن liposomal التحقيق الشفاه-Q لا يحتوي على صبغة خالية المتبقية في الحل، ويمكن أن تخضع فقط امتصاص النشط. المسح بالليزر الصور المجهرية مبائر مزيد من إثبات امتصاص وتفعيل الشفاه-Q في الخلايا البلعمية (الشكل 3C). وعلاوة على ذلك، فإن عدم ومضان في خط الخلية يفية البشري غير أكلة، HT-1080 يشير إلى أن الإقبال على الشفاه-Q هو في الغالب عن طريق البلعمة، وبالتالي، سيكون مناسبة للتصوير الالتهاب حيث حيدات أكلة / تشارك الضامة.
وتمشيا مع امتصاص أكلة من الجسيمات الشحمية ينظر في خطوط خلايا مستنبتة، ونظرا لمضان التبريد الحقن في الوريد من الخيوط الشفاه-Q إلى زمنياالزيادة تعتمد في كثافة مضان من وذمة في نماذج الفئران (4A الشكل، الشفاه-Q)، مع منخفضة جدا مضان الخلفية. تم الكشف عن كثافة مضان القصوى من وذمة 8-10 ساعة بعد حقن الشفاه-Q. وينظر على العكس، قوي نسبيا الجرد الوطني مضان من الفأرة بأكمله بعد تطبيق مجانية DY-676-COOH (الشكل 4A، DY-676-COOH) أو دائما على الحويصلية، الشفاه-DQ (الشكل 4A، الشفاه-DQ ). مقارنة الشفاه-Q، نضح السريع والتخليص من الحر DY-676-COOH كما رأينا 0-4 ساعة حقن آخر، يتداخل مع التصوير، بحيث موثوقية الكشف عن وذمة غير ممكن (الشكل 4A، DY-676-COOH ). وعلاوة على ذلك، فإن الحويصلية غير مروي، الشفاه-DQ يكشف عن مضان الأقصى للذمة خلال 2-4 ساعة بعد الحقن التي تبقى ثابتة تقريبا حتى 8 ساعة، ثم يتناقص تدريجيا على غرار مروي مقرها الشفاه-Q-ذمة مضان. أداء الشرج شبه الكميyses، حيث يتم تعيين المناطق ذات الاهتمام (رويس) للذمة مقابل الخلفية، يمكن للمرء أن جعل استنتاجات حول مستويات مختلفة من الكشف مع تحقيقات مختلفة. وفقا لتحليل شبه كمي من 5 حيوانات في كل مجموعة (التحقيق)، ويمكن أن يكون أكثر ذمة معنويا (P = 0.001) الكشف مع الشفاه-Q من مع مجانا DY-676-COOH أو غير مروي، الشفاه-DQ (الشكل 4B).
أجهزة التصوير من الفئران الموت الرحيم 24 ساعة بعد الحقن تحقيقات تكشف معتدل خارج الحي مضان الكبد / المرارة والكلى ومستوى منخفض جدا أو لا مضان من الطحال والرئتين والقلب (الشكل 5)، والذي يعمل كدليل للقضاء من تحقيقات من خلال مسار الطرق الصفراوية.
الشكل 1: إعداد الحويصلية DY-676-COOH محملة الصورة. (AC) نظرة عامة التخطيطي لخطوات تركيب المعنية. (A) الإعداد لترطيب فيلم وقذف مع الأشعة تحت الحمراء القريبة صبغ DY-676-COOH. (ب) صورة من الإعداد الترشيح هلام عصامي يظهر البيني بين غير مغلفة (مجانا) صبغ والجسيمات الشحمية. الجسيمات الشحمية أزل أولا وتظهر الأخضر والأزرق بسبب مغلفة DY-676-COOH (الأزرق) وفسفوليبيد الأخضر مسجلة، NBD-مخدر. (C) صورة الممثل من الحويصلية الرواسب (الشفاه-Q) بعد تركيز من قبل تنبيذ فائق. ( D) منحنى المعايرة الممثل من DY-676-COOH في 10 ملي تريس 7.4 درجة الحموضة (التي تحتوي على 1٪ تريتون X100) المستخدمة لتقدير حجم liposomal الصبغة. (E) صورة مجهرية الإلكترون كرو-انتقال الشفاه-Q. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ن صفحة = "دائما"> 
الشكل 2: تقرير فيزيائية للتبريد مضان والتنشيط في المختبر (A) امتصاص أطياف الشفاه-Q (يمين) ومجانا DY-676-COOH (يسار) بقياس 10 ملم في تريس العازلة درجة الحموضة 7.4، قبل أو بعد تجميدها في - 80 ° C. ملاحظة ذروة مزدوجة مميزة من الشفاه-Q مقارنة الحرة DY-676-COOH واختفاء ذروة الزرقاء تحولت بعد تجميد ضرر من الشفاه-Q. (B) الموافق مضان أطياف انبعاث الشفاه-Q (يمين) و قياس مجانا DY-676-COOH (يسار) في 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 قبل أو بعد تجميدها في -80 ° C.
الشكل (3): امتصاص الخلوي ومضان تفعيل الشفة osomes. تم بواسطة NIR التصوير مضان الكريات خلية إعداد الصور في (A) بعد التعرض لتحقيقات المقابلة لمدة 24 ساعة على درجات الحرارة المشار إليها. لم الخلايا-HT 1080 لم تنج من فترات حضانة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. الرسوم البيانية شريط في (ب) تمثل مستويات شبه الكمية للإشارات مضان حصلت عن طريق تعيين رويس إلى الكريات خلية في A. يدل كل شريط متوسط شدة ن = 3 تجارب ± SD. تم الحصول عليها الصور في (C) بواسطة الليزر متحد البؤر المسح المجهري للخلايا يتعرضون لتحقيقات على الثقافة الشرائح غرفة لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية. ملاحظة مستوى عال من مضان في ارتفاع أكلة الفئران خط خلية بلعم J774A.1 ومضان المعتدل في أكلة خفيفة خط خلية ورم أرومي دبقي الإنسان U-118MG. يظهر غير أكلة خط الخلية يفية الإنسان HT-1080 لم مضان من تحقيقات. NBD-DOPE: أخضر فسفوليبيد الفلورسنت.تحميل / 52136 / 52136fig3highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويبين الشكل 4. في التصوير الضوئي الجسم الحي وذمة الناجم عن زيموزان في الفئران. (A) صورة الماوس على اليسار مواقف تحت الجلد تطبق زيموزان-A (500 ميكروغرام في 50 ميكرولتر المالحة) والحل السيطرة المالحة (50 ميكرولتر) على الجهة اليسرى. الحقن في الوريد للتحقيقات المشار إليها والجسم كله NIR التصوير مضان في النقاط الزمنية المشار إليها تكشف تدريجيا، ولكن الزيادة الكبيرة في إشارات مضان من ذمة وخلفية منخفضة إشارات من الشفاه-Q (اللوحة العليا) مع الحد الأقصى لمضان في 8 ساعة حقن آخر. الصبغة خالية يكشف نضح والتخليص السريع ضمن 4 ساعة حقن آخر (الجزء الأوسطل)، في حين الشفاه-DQ يكشف الكشف عن وذمة مع شدة إشارة منخفضة وأعلى مضان الشامل الخلفية. عرض رسومية في (ب) يكرر إشارات مضان لوحظ من وذمة الكشف مع كل مسبار مقارنة بالمنطقة التحكم (المالحة) في ن = 5 حيوانات في كل مجموعة. كل قطعة تمثل إشارات مضان يعني من (ن = 5) ± SEM. مع الرسوم البيانية، والحد الأقصى للإشارة مضان من الكشف عن ذمة التحقيق مع كل هي متميزة بسهولة (الشفاه-Q، 8 ساعة، الشفاه-DQ ساعة وخالية DY-676-COOH، آخر 2 ساعة حقن 2-4). هناك كثافة مضان معنويا (P = 0.001) أعلى من وذمة مع الشفاه-Q مقابل الشفاه-DQ في تي = 0-24 ساعة، ومع الشفاه-Q مقابل الحرة DY-676-COOH في تي = 4-24 ساعة. الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور بيو-البصرية خارج الحي من الأعضاء من الفئران 24 ساعة التطبيق البعدي التحقيق، وما يقابلها من تحليل شبه كمي لشدة مضان من الأجهزة. يمثل كل شريط متوسط كثافة مضان (ن = 4) ± SEM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| صياغة الحويصلية | حجم [نانومتر] | مؤشر التشتت المتعدد (PI) | زيتا المحتملة [بالسيارات] |
| الشفاه DQ (dequenched) | 123.4 ± 0.6 | 0.055 ± 0.02 | -10.6 ± 0.4 |
| الشفة-Q (مروي) | 118.5 ± 0.7 | 0.04 ± 0.02 | -9 ± 2 |
| الشفاه دبي الوطني (ث / س DY-676-COOH) | 123.0 ± 1.4 | 0.04 ± 0.03 | -11 ± 1 |
الجدول 1: توصيف الجسيمات الشحمية التي تشتت الضوء الديناميكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منذ الجسيمات الشحمية ويمكن أيضا أن تكون بمثابة نظم توفير الأصباغ الفلورية، وتمكين التصوير من الأمراض المستهدفة. تغليف من تركيزات عالية من الأصباغ الفلورية مثل الصبغة NIRF، DY676-COOH المستخدمة هنا، يؤدي إلى ارتفاع مستوى التبريد مضان من صبغ شرك. تبريد مضان، وهي ظاهرة شهدت مع العديد من fluorophores في تركيز عال يمكن استغلالها في العديد من تطبيقات التصوير الحي، حيث طالب حساسية عالية وموثوقية الكشف عن المنطقة المستهدفة. استخدام الجسيمات الشحمية أيضا يوفر الحماية للصباغة الذي لا غنى عنه للتطبيقات في الجسم الحي.
تقنية الترطيب فيلم وقذف هي الطريقة المستخدمة على نطاق واسع والتي تمكن الإعداد الناجح من الجسيمات الشحمية مع نطاقات مختلفة الحجم حسب الحاجة، وتسمح التعديلات مثل التغليف من العديد من المواد المختلفة 25. وهكذا، وهي مناسبة لإعداد الشفةمغلفة osomes مع صبغة الفلورسنت الجرد الوطني، DY-676-COOH لأغراض التصوير. طريقة غلة الجسيمات الشحمية مع 600-840 ميكرومتر تركيزات صبغ intravesicular، التي تقع ضمن تركيز مروي للصباغة. الطارد جهة LiposoFast الأساسية المستخدمة في تجانس تشكلت عفويا تشتت الحويصلة هو مناسبة لإعداد الحويصلية في نطاق مختبر صغير، نظرا للتوافق الجهاز، مع الحقن تصل إلى 1 حجم مل. للتحضيرات واسعة النطاق ويوصى استخدام المجانسة ارتفاع ضغط أكبر التي هي قادرة على التجانس التفرق حويصلة بسعة 1،000 L للساعة الواحدة. الترشيح هلام (حجم الاستبعاد) اللوني هو خطوة حاسمة مما يضمن الفصل بين الصبغة liposomal مغلفة من جزيئات غير مغلفة (مجانا) صبغ 26. طول العمود الترشيح هلام أمر حيوي لفصل الفعال للالجسيمات الشحمية من الصبغة مجانا. وبالتالي، فمن الضروري إعداد عمود لا يقل عن 28 سم طول رس فصل بنجاح الجسيمات الشحمية من الحر DY-676-COOH المستخدمة هنا. ومن المثير للاهتمام، وهذا هو طول مرتين طالما أن تستخدم في تنقية carboxyfluorescein (CF) الجسيمات الشحمية تحميلها من carboxyfluorescein مجانا. العيب الرئيسي من الترشيح هلام هو تخفيف 5-6 أضعاف من العينات النقية. وهذا يمكن أن يتم تعويضهم من قبل تنبيذ فائق، إذا كانت هناك حاجة الجسيمات الشحمية عالية التركيز. خلال تنبيذ فائق في الجسيمات الشحمية الرواسب وطاف يمكن إزالتها بسهولة (27). طرق أخرى لتركيز الجسيمات الشحمية مثل قبل غسيل الكلى 28 هي أكثر استهلاكا للوقت من تنبيذ فائق.
إلى جانب طريقة ترطيب فيلم وقذف، المرحلة عكس طريقة التبخر 23 فضلا عن طريقة حقن الإيثانول 24 تمكين إعداد الحويصلية مع كفاءة عالية التغليف لكثير من المواد المائية. ومع ذلك، كشفت تحقيقاتنا وترطيب الفيلم جنبا إلى جنب مع دورة تجميد وذوبان الجليدالصورة ليكون الأسلوب الأكثر مناسبة لتغليف intraliposomal كاف من DY-676-COOH. زيادة تركيز انطلاق DY-676-COOH تستخدم لفيلم ترطيب يزيد من فعالية وتركيز الصبغة intraliposomal، عند استخدام تركيز الدهون الثابتة من 30 ملم. وعلى الرغم من هذه الفعالية والتغليف مع طريقة التجميد والذوبان هو أقل من 10٪ من تركيز الصبغة بدءا المستخدمة، ولكن مع ذلك غير كافية لتغليف للتركيز التبريد المطلوبة للتصوير. وعلاوة على ذلك، الصبغة خالية من فصل الجسيمات الشحمية عن طريق الترشيح هلام يمكن إعادة تدويرها عن طريق تحلية والجفاف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، مما يجعل إعادة التغليف-ممكن وبأقل الخسائر الإجمالية صباغة. تغليف للصباغة بواسطة بروتوكول الأساسي ليس له تأثير على حجم ومورفولوجية الجسيمات الشحمية كما يراها مؤشرات التشتت المتعدد وصورة مجهرية الإلكترون من الشفاه-Q.
عدة طرق بسيطة يمكن استخدامها لevaluatالبريد نشاط استعداد الفلورسنت liposomes.DY-676-COOH لديه ميل عالية لإخماد الذاتي بتركيزات عالية 21،29 ربما الناجمة عن تشكيل H-ديمر والتفاعلات بين الجزيئات التراص بي صباغة. هذه التفاعلات، التي تحدث بسبب القرب من أنصاف أقطار فورستر من جزيئات الصبغة بتركيزات عالية، ويمكن أن يباد من قبل التخفيف 30. ولذلك، التغليف من تركيزات عالية من DY-676-COOH لا يحمي فقط الصبغة من طهاية في الجسم الحي، ولكن أيضا من المخزن المؤقت المحيطة، وبالتالي الحفاظ على تركيز عال والاحتفاظ تبريد مضان التي يمكن الكشف عنها بمثابة امتصاص زرقاء تحول الذروة والانبعاثات مضان منخفضة كما رأينا في الشكل 2. تجميد الجسيمات الشحمية تدريجيا في -80 ° C يؤدي إلى تكوين بلورات الجليد في المناطق الداخلية مائي 31 الذي يسبب تلف الغشاء liposomal عند إذابة بتهور في 30 ° C. الإفراج، والتخفيف مضان تشغيل إشاراتvation من داخل liposomal DY-676-COOH في المخزن بعد كشف التجمد في ذروة امتصاص واحدة والزيادة تقريبا 2.5 أضعاف في كثافة مضان (الشكل 2)، والذي يشير إلى أن الشفاه-Q بالتالي تعزل عالية، التبريد تركيز DY-676-COOH وغير activatable. أساليب أخرى لتلف liposomal الدهون طبقة ثنائية مثل استخدام المنظفات أو المذيبات العضوية لا تكشف عن خلافات واضحة بين الصبغة الحرة وliposomal مغلفة الصبغة، لأنها على حد سواء التأثير على الخواص الطيفية للعديد من الأصباغ الفلورية 32. تجميد بطيئة الذوبان وطريقة قاسية ذكرت هنا بالتالي بمثابة طريقة أكثر موثوقية واعدة للتحقق من صحة التغليف عالية من fluorophores في الجسيمات الشحمية وتبريد مضان يترتب على ذلك. من امتصاص وانبعاث أطياف سليمة الشفاه-Q (الشكل 2)، ويمكن الكشف عن بعض مستوى مضان المتبقية. وهذا يمكن أن تنجم عن أحادية غير مروي صبغ داخل يبوsomes وأيضا من التفاعل كهرباء وتأثير الصبغة تغليف بواسطة فوسفورية الجماعات رئيس القطبية 33.
كما يمكن أن يرى في الشكل 3، وتراكم متميزة من الشفاه-Q في البلاعم الفئران أكلة خفيفة للغاية وأكلة ورم أرومي دبقي خط الخلية البشرية، U-118MG 34، ولكن ليس في غير أكلة خط الخلية يفية الإنسان HT-1080، يشير أن الشفاه-** والتصوير أساس من التهاب ستكون مواتية، منذ البالعات هي لاعبين أساسيين من العمليات الالتهابية. حقيقة أن استنفاد الطاقة يلغي الإقبال على الشفاه-Q ولكن ليس امتصاص المجاني DY-676-COOH يجسد خصوصية امتصاص أكلة من الشفاه-Q ويكشف عن أن الشفاه-Q يزال سليما أثناء التجربة، وإطلاق سراح آخر للصباغة و سوف امتصاص مستقلة للطاقة تجري مما يؤدي إلى مضان الكشف. تضمين فسفوليبيد الفلورية الخضراء، NBD-مخدر في طبقة ثنائية الحويصلية تمكن التصوير المجهري وdiscriminatioن بين غير تدهورت-من الجسيمات الشحمية المتدهورة الخلوية وخاصة إذا تتم التجارب امتصاص تعتمد على الوقت كما ذكرت في وقت سابق 32. الصور المجهرية تكشف الجرد الوطني مضان من DY-676-COOH الذي يرتبط مع مستويات كثافة مضان الكريات الخلايا، على النحو الذي يحدده التحليل شبه الكمي بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية. ووفقا لهذا، وخطوط الخلايا البلاعم الفئران تظهر أعلى مضان، في حين أن ورم أرومي دبقي الإنسان تكشف عن مضان السفلي من كلا DY-676-COOH وبنك دبي الوطني-مخدر من السابق. كما هو متوقع في يفية خط الخلية البشرية، HT-1080 تكشف عن أي مضان إما الأصباغ liposomal أو الحر DY-676-COOH، الذي يعزز حقيقة أن الشفاه-Q امتصاص، هو في الغالب عن طريق البلعمة.
، واعتبرت عدة عناصر تحكم في التصوير فيفو التهاب يحركها البلعمة للتحقيق إمكانات الشفاه-Q المستندة. وبالنظر إلى أن الحرة DY-676-COOH يمكن تناولها من قبل phagocytعمليات التفتيش الموقعي، طهاية من الشفاه-Q قد يؤدي إلى إطلاق سراح من الصبغة، والتي يمكن تناولها من قبل البالعات. لتجنب هذا، تم إعداد الشفاه-Q مع 5 مول٪ من مضاد. وعلاوة على ذلك، فإنه من الضروري التمييز بين امتصاص بسبب المستندة إلى التهاب تأثير EPR وامتصاص النشط وتفعيل مضان. ولمعالجة ذلك، كان تقييم ومقارنة ثلاثة تحقيقات مختلفة، وهي دائما على الشفاه DQ، ومروي الشفاه-Q والحر DY-676-COOH في الفئران الحاملة الناجم عن زيموزان ذمة ضروريا. زيموزان-A الذي يعد من جدران الخلايا من خميرة الخباز والمبيضات البيض هو المنشط الطبيعي لإفراز خلوى عبر dectin-1 ومثل عدد مستقبلات 2/6 (TLR 2/6). السيتوكينات يفرز بدوره تحفز تفعيل شلالات المصب مما يؤدي إلى تسرب الأوعية الدموية، وبالتالي تخفيف دخول الوعاء / تسرب من وحيدات / الضامة من خزان الطحال 35 وكذلك العدلات، وهجرتهم إلى مواقع التهاب(وذمة) 36-39. عملية حيدات القائم على زيموزان / بلعم التسرب والهجرة تحتاج فقط 4،5-6 ساعة الأمر الذي يجعل زيموزان أداة استراتيجية لدراسة العمليات الالتهابية 36-39. بسبب تسرب الأوعية الدموية التي تنتج أثناء التهاب، حقن في الوريد يمكن إما أن تؤخذ تحقيقات من قبل وحيدات / الضامة (البالعات) أثناء هجرتهم الى الموقع التهاب أو يتسرب ويتم تناولها في موقع وذمة (تأثير EPR) 40. استخدام غير مروي-الشفاه-DQ يكشف عن الخلفية أقوى الشاملة لإشارات ذمة من الشفاه-Q، وزيادة مضان من وذمة وهو ما يعكس هجرة وحيدات الضامة. في الواقع، وينظر في مضان الأقصى للذمة بالفعل 2-4 ساعة التطبيق البعدي من الشفاه-DQ ويبقى ثابتا تقريبا حتى 8 ساعة. بدلا من الشفاه-DQ والشفاه-Q، الحر DY-676-COOH يخضع لنضح السريع بعد الحقن وأخلى ضمن 4 ساعة، بحيث التصوير واضح في ذمة غير ممكن. فيterestingly، واستخدام النتائج الشفاه-Q في الزيادة المستمرة في كثافة مضان وذمة وإشارات خلفية منخفضة جدا. وتعزى هذه الزيادة المستمرة في كثافة مضان مع الشفاه-Q لمضان تفعيل liposomal صدر صباغة. أخذت معا، يمكن الاستنتاج أن مساهمة EPR التأثير في مجال التصوير الشفاه-Q على أساس هو الحد الأدنى منذ الشفاه-DQ تكشف أقصى مضان (تأثير EPR والهجرة الوحيدات) في 4 ساعة حقن آخر. وهكذا، liposomal التغليف يوفر الحماية والتسليم متميزة من DY-676-COOH، والتي بدورها تمكن أكثر موثوقية في مجال التصوير المجراة من ذمة، وحصرا بعد استيعاب وتدهور (تفعيل مضان) بواسطة الخلايا البلعمية. وحتى الآن، واستخدام الناجم عن زيموزان ذمة الساق الخلفية للتحقق من صحة خصائص التصوير من الجسيمات الشحمية الفلورسنت هو جديد. بروتوكول ذكرت هنا يمكن توسيع سواء عن طريق تغليف من الأصباغ الفلورية مختلفة والتصوير تأثير مختلف درو المثبطةع على تحريض الالتهاب، وبالتالي يمثل أداة مفيدة لإعداد وتوصيف تحقيقات مناسبة للتصوير الطبي الحيوي.
خطوة حاسمة أخرى نحو تعريف تحقيقات التصوير المناسبة هي التحقق من خصائصها الدوائية وطرق التخلص منها. توزيع تحقيقات في الأجهزة التي تلعب دورا حيويا في إفراز مثل الكبد والكلى وكذلك الاحتفاظ بها قصيرة والقضاء مناسبة من هذه الأجهزة عادة ما يكون مؤشرا، أن تحقيقات سوف بكثير من المرجح تظهر أي آثار سلبية على المريض. ووفقا لهذا، أعدت أجهزة الفئران 24 ساعة بعد حقن الشفاه-Q أو الحر DY-676-COOH تكشف فقط مضان خفيف من الكبد / المرارة والكلى، والذي يدل على القضاء المفضل من fluorophore liposomal من خلال الطريق الطرق الصفراوية. وإثبات الإقامة القصيرة للتحقيقات في هذه الأجهزة والقضاء الفعال من خلال 7-فلأعدت د إشارات مضان أعلى من أجهزة 6 ساعات بعد حقن الشفاه-Q أو الحر DY-676-COOH 32. هذه الملاحظات هي وفقا للالقضاء على الجسيمات الشحمية 41 و احتياطي أهمية بما في ذلك دراسات biodistribution عندما تميز تحقيقات. وعلى الرغم من آثار جانبية ضارة، مثل تهيج الجلد وتكمل تفعيل 42،43 تم الإبلاغ عن تركيبات liposomal المستخدمة في التطبيقات السريرية، لم الكشف عن هذه الآثار مع الجسيمات الشحمية الأساسية. وعلاوة على ذلك، والمراقبة من الفئران تعاني من نقص المناعة لمدة أسبوعين بعد الحقن التحقيق الذي قاده لاستكمال إزالة الألغام من تحقيقات من أجهزة الفئران (لا يظهر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المنح الألمانية للبحوث HI-698 / 10-1 وRU-1652 / 1-1. نشكر دورين مايو للحصول على المساعدة الفنية ممتازة والشركة DYOMICS محدودة، جينا لدعمهم الرقيقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
References
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
- Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
- Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
- Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
- Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
- Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
- Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
- Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
- Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
- Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
- Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
- Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
- Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
- Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
- Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
- Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
- Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
- Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
- New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
- Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
- Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
- Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
- Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
- Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
- Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
- Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
- Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
- Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
- Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
- Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).
