Abstract
三维培养方法进行说明，其中主垂体腺瘤细胞生长在藻酸盐珠。海藻酸钠是从棕色海藻衍生的聚合物。简言之，将肿瘤组织切成小块并用胶原酶和胰蛋白酶提交酶促消化。接着，获得的细胞悬浮液。肿瘤细胞悬浮液与1.2％的藻酸钠混合，并落入氯化钙溶液，和藻酸盐/细胞悬浮液凝胶化上与氯化钙 2接触，以形成球形珠。嵌在藻酸盐珠将细胞用由有20％FBS富集培养基中提供营养物供给。在藻酸盐珠的三维培养保持腺瘤细胞的活力为长时间，最多四个月。此外，细胞可以从藻酸盐通过洗涤柠檬酸钠珠粒中释放并接种于玻璃盖玻片上用于进一步免疫细胞化学分析。使用CEL的升培养模式可以使用最少的解体细胞骨架的固定和可视化。总之，藻酸盐珠用于维修垂体腺瘤细胞的可靠培养系统。
Introduction
三维支架已在细胞培养被广泛使用，因为它们提供用于培养细胞的三维结构支撑和细胞-细胞通讯1的维护。天然衍生的聚合物材料已用于制造三维支架，包括I型胶原蛋白，壳聚糖和藻酸盐。海藻酸钠是从褐色海藻Macrocystispyrifera（海带）的天然聚合物。该聚合物是由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）的2和形式在某些二价阳离子，如钙和钡的存在下是稳定的凝胶的重复单元。氯化钙（ 氯化钙 ）溶液通常用作交联剂以形成藻酸盐珠。海藻酸钠溶液滴入氯化钙立即形成三维球凝胶。当藻酸盐溶液与细胞混合，将细胞封装在藻酸盐bEADS 3。
藻酸盐具有已启用它的属性被用作用于多种细胞，包括软骨4，骨骼肌成肌细胞5和神经干细胞6的包封的基质。它是一种惰性材料，并允许营养物，氧气和维持细胞的存活和功能的代谢产物的扩散;此外，不同于其他基于凝胶的培养系统，藻酸盐珠内培养的细胞，也可以从该支架使用钙螯合剂，如柠檬酸钠解放，然后将细胞可以收获进一步调查7。
垂体腺瘤通常是良性肿瘤低增殖率。大鼠垂体腺瘤细胞系已经在二维系统 8成功培养。然而，这种文化分泌人垂体细胞瘤是不是一个高效的开发;分散垂体肿瘤细胞生长不佳在培养中，细胞呈现出有限的附着和铺展，并将细胞通常形成在培养皿9,10-漂浮聚集。
已进行了多种尝试，以获得肿瘤垂体细胞悬浮液，包括酶和机械分散方法11，一个单独机械分散方法12和肿瘤外植体10的培养。用这些方法中，不同的作者获得可行的粘附培养不同的时间段。肿瘤分泌细胞的能力在这些两维系统生存取决于肿瘤的类型和它们的增殖率9。但是，在长期培养，与成纤维细胞表型细胞为主11,13。本文介绍了从封装在藻酸盐珠垂体腺瘤细胞进一步释放他们的海藻酸钠支架，能够进行详细的分析获得原代培养的方法它们的细胞生物学，例如，其细胞骨架的安排的各个方面。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这项研究获得批准，由医疗机构和国家理工学院的研究和推进研究中心的地方伦理委员会使用人的材料。
1.肿瘤样品采集
- 通过反式蝶骨手术过程14获得从病人垂体腺瘤组织活检。
- 收集垂体腺瘤样品，将其放入含有50有10％胎儿牛血清（FBS）的富集的新鲜199培养基（M199），0.6毫克/毫升碳酸氢钠，2.4毫克/毫升HEPES和1％的混合物的无菌玻璃瓶抗生素（青霉素/链霉素）在pH 7.4。保持在玻璃瓶中在冰上的样品。
注意：肿瘤组织可以在手术后进行处理几个小时。 - 运送肿瘤样品在玻璃瓶上冰的实验室。
2.酶组织解离溶液的制备中，胰蛋白酶抑制剂的解决方案和解决方案海藻酸钠
注意：在此之前的细胞培养过程制备以下的溶液。过滤用0.22微米的膜过滤器的所有解决方案，使用前。
- 通过在5ml M199-无血清的5毫克胶原酶（I型）的溶解制备胶原酶1％的溶液。
- 准备由0.01克胰蛋白酶溶解在10ml的PBS-EDTA的0.3％胰蛋白酶0.01％的溶液。
- 由2毫克的大豆胰蛋白酶抑制剂的溶解于20ml的M199-无血清的制备0.1％胰蛋白酶抑制剂溶液。
- 通过在4毫升的胰蛋白酶抑制剂溶液中溶解20微升的DNA酶I 134 U / ml的制备DNA酶溶液。
- 由22.8毫克的EGTA溶解在40毫升155毫摩尔NaCl的制备EGTA溶液（1.2M）。将pH调节至7.4。继续在50 ml的终体积。
- 通过在50毫升155毫摩尔NaCl的溶解238毫克的HEPES制备的HEPES溶液（20毫摩尔）。
- 通过溶解1.2准备1.2％海藻酸钠溶液克藻酸钠在100ml的HEPES溶液。高压灭菌的藻酸盐溶液。
- 通过在50毫升HEPES液750毫克氯化钙溶解制备钙溶液（102毫米），调节pH值至7.4
3.原代细胞培养和海藻酸钠封装
- 层流柜内，将肿瘤组织中含有大约20毫升的PBS 的 Ca 2+和Mg 2+游离，pH值7.4（PBS *）的35毫米培养皿中。
- 取组织用外科镊子，并将其放置在含有新鲜的PBS *另一个陪替氏培养皿，轻轻洗净组织。直到红血细胞和碎片除去重复此步骤。
- 使用镊子手术，按住垂体腺瘤组织，并用小手术剪，切成小块。用巴氏吸管圆边，在RT转移组织碎片和PBS *入15ml管中，离心68 xg离心10分钟。
注意：要圆一个巴斯德的边缘吸管，微火焰的吸管尖在本生灯。 - 使用巴斯德吸管除去PBS *和添加3-5毫升胶原酶溶液（大约5毫升的组织为65mm 3），通过颠倒混合的两到三倍。孵育在胶原酶的组织为恒定旋转，在37℃30分钟。
- 离心管中，在68×g离心在RT 10分钟，并用巴氏吸管除去胶原酶。
- 添加5毫升DNA酶，并通过反相混合的两到三倍，然后离心管在68×g离心在RT 10分钟。
注意：如果组织未完全离解，在37℃下用胰蛋白酶进行第二次酶消化3分钟。通过加入2倍体积的胰蛋白酶抑制剂溶液的停止消化。 - 吸用巴氏吸管将上清液并丢弃。重悬在1体积的EGTA溶液沉淀，用2体积海藻酸钠溶液中混合。
- 轻轻地混合细胞悬液和海藻酸钠通过用巴氏吸管吸取。采取与21g的针头的无菌注射器，取出活塞;使用移液管装入与藻酸盐和细胞溶液的注射器。
- 轻轻插入柱塞插入注射器并仔细分配所述藻细胞溶液滴逐滴入含约30毫升富钙溶液的玻璃烧杯中。
- 放置在注射器的针约5cm至氯化钙溶液。在与氯化钙接触藻细胞悬浮液的凝胶，以形成球形珠。保持藻酸盐珠在5分钟的钙溶液。
注：搅拌玻璃烧杯，其中珠被丢弃。用打圈的手慢慢移动，以防止它们粘在一起。 - 小心地取出用巴氏吸管中的钙溶液中，并用3-5毫升M199与FBS的20％的富集洗珠两次。
- 转移海藻酸钠珠成常规T25组织培养烧瓶使用无菌刮刀，在5％的CO 2的潮湿培养箱中添加4-5 M199毫升富含20％FBS和孵育在37℃。更换培养基每三天。
4.解放从海藻细胞
注意：在此之前，从藻酸盐珠解放细胞，用聚D-赖氨酸涂层13毫米直径的盖玻片。
注意：硫酸是一种高腐蚀性酸和APTS可引起眼和皮肤有刺激性。 USE乳胶手套来处理这些试剂。
- 在通风橱中，用点镊子浸泡在含有20％硫酸水溶液，在室温1小时的玻璃陪替氏培养皿的盖玻片。
- 滗硫酸，并用蒸馏水洗涤盖玻片五次，每次5分钟。使用镊子点的地方干净盖玻片含0.1 M氢氧化钠5分钟，在室温15培养皿。
- 倒出氢氧化钠洗一次与夹带原导致水，吸水和干燥的盖玻片。
- 使用一个微量涂布的盖玻片与APTS（氨基丙基三乙氧基硅烷）处理4分钟（用500微升6盖玻片）淹没培养皿用蒸馏水。迅速吸出水，并继续用蒸馏水洗，移动与点镊子盖玻片以允许水底下穿过。
- 吸水和干燥盖玻片，用点镊地方的盖玻片到一个干净的培养皿中，并在3次，每次45秒消毒他们的微波的内部。添加1000微升无菌水至100微克多聚-D-赖氨酸（0.1毫克/毫升）。
- 孵育大约50微升聚-D-赖氨酸的盖玻片在RT 5分钟。完全吸出聚-D-赖氨酸。
注意：这是重要的，因为可溶性聚D-赖氨酸的培养基中能抑制细胞增殖。 - 冲洗盖玻片用无菌水五次，每次5分钟。吸出STerile水并允许盖玻片到层流柜内干燥。
- 分析肌动蛋白骨架，解放从海藻垂体细胞。用1毫升枪头，采取一些的藻酸盐珠培养瓶中，将它们放入15毫升管。
- 添加5毫升55 mM柠檬酸钠（溶解323.6毫克的Na 3 C 6 H 5 O 7，2H 2 O在20ml的HEPES溶液）和离心机在68×g离心在RT 10分钟。吸出上清液并丢弃。
- 重悬在1毫升温暖M199的20％FSB丰富了颗粒;轻轻地用巴斯德吸管混合细胞悬浮液。
注意：毒伞素和DAPI是有毒的。使用手套来处理这些试剂。 - 计数细胞，转移125微升的0.4％台盼蓝溶液到1.5ml管中。添加M199的75微升和50微升在最后步骤（稀释倍数= 5）中得到的细胞悬浮液。调匀。
- 使用微量尖PLACË约10微升的血细胞计数器室台盼蓝细胞悬液。
- 使用具有相衬照明倒置显微镜计数在血球计数器中的细胞。算上1mm的中心广场和四个1毫米角区域的所有单元格。通过用稀释因子乘以每平方平均计数得到每毫升细胞密度- 10 4例如，如果每平方的平均计数为45细胞×5×104 = 2.25×106细胞/ ml。
注意：计数细胞在血细胞计数器室十正方形。不要指望细胞触及底部和右侧的中间线。 - 种子35,000个细胞上覆盖有聚-D-赖氨酸的直径13mm玻璃盖玻片上。
5.微丝骨架安排
- 培养48小时后，取出培养基用巴氏吸管赶紧每PBS的盖玻片加入500μl，立即取出PBS。
- 修复和通透Ť他细胞用每固定缓冲液（0.1M PIPES，pH值6.75，4％的PEG-6000，1mM的EGTA，1mM的MgSO 4上，0.5％的Triton X-100和2％的甲醛）的盖玻片500μl的10分钟，在37℃ C
- 除去固定缓冲区和添加每3.5％多聚甲醛的盖玻片500μl的在PBS中在RT下30分钟。取出多聚甲醛溶液。
- 通过加入每PBS中盖玻片500微升，每次5分钟，洗涤盖玻片三次。冲洗盖玻片在室温下，在不断搅拌。
- 孵育用50mM氯化铵的细胞10分钟，吸出氯化铵溶液，并重复步骤5.4。
- 孵育在PBS的1％BSA（抗体，免蛋白酶-）细胞30分钟，除去BSA溶液，并重复步骤5.4。
- 孵育罗丹明缀合的鬼笔环肽的50微米的细胞在室温下7分钟，重复步骤5.4。
- 孵育DAPI的PBS稀释在室温下5分钟，重复步骤5.4的255微米的细胞。最后安装ŧ他与一安装平台盖玻片并用指甲油密封。
- 获得的使用共聚焦激光扫描显微镜具有63X物镜的肌动蛋白细胞骨架的安排的图像，在541nm处的激发波长。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议已经在培养，并在不同的时间段藻酸盐珠腺瘤垂体细胞的维持成功地应用于图1示出在藻酸盐珠包埋的细胞后三个月。这些细胞表现出的双折射的圆形形状的倒置光学显微镜（图1）下，图2示出了N-钙粘蛋白的嵌入在藻酸盐大鼠垂体腺瘤细胞中的定位。的N-钙粘蛋白在细胞-细胞接触（图2A 和 2C）的本地化和细胞核显示染色质延伸（图2B和2C）。
在藻酸盐珠的肿瘤细胞保持存活在培养长达4个月;因此，细胞可在不同时间藻酸盐珠粒，其允许的不同方面的分析中解放出来在相同的细胞培养物的细胞生物学。例如，从所获得的增殖指数十个非常运作利用免疫反应进行Ki-67的，和19.2±1.5％的平均标记指数人垂体腺瘤（平均值±SEM），得到图 3所示人垂体免疫染色Ki-67的腺瘤细胞。
一种非侵入性的细胞的肌动蛋白细胞骨架是根据免疫细胞化学协议染色以上描述。培养的细胞表现出与小的肌动蛋白应力纤维（图4A）与垂体腺瘤独立的培养系统的变化.The形貌和肌动蛋白丝的安排细长形状;例如，在一个非功能侵入腺瘤，这些细胞中的主要形状用在断续皮质环的其微丝排列圆形。 （图4B）。
图1.将细胞包埋在3个月的藻酸盐珠粒。细胞表现出的倒置光学显微镜下的双折射率圆形形状。在嵌入藻右侧面板侵入腺瘤细胞被示出，并在左侧面板的非侵入性腺瘤细胞被示出。比例尺= 15微米请点击此处查看该图的放大版本。
在大鼠垂体腺瘤细胞N-钙粘蛋白（GH3）培养在藻酸盐珠的图2.免疫细胞化学分析。GH3细胞在藻酸盐培养，固定嵌在染色N-钙粘蛋白（红色）的藻酸盐系统和细胞核（蓝色）。细胞排列在暨汗国显示在细胞间的边界（A 和 C）N-cadherin的。细胞核（B和C）中示出与染色质延长。比例尺= 15微米请点击此处查看该图的放大版本。
图3.核抗原Ki-67的培养的人垂体腺瘤细胞的免疫染色。在藻酸盐珠培养2.5个月后，侵入性非功能腺瘤细胞固定，然后免疫染色中Ki-67（红色）和细胞核（蓝色）。一些腺瘤细胞显示Ki-67阳性染色。比例尺= 15微米请点击此处查看该图的放大版本。
图4.藻酸盐解放垂体腺瘤细胞微丝骨架的安排。细胞固定并染色以TRITC鬼笔环肽的肌动蛋白丝。从一个非侵入性腺瘤细胞延伸在衬底上，显示出小的肌动蛋白应力纤维 （A）。从大腺瘤侵入细胞呈不连续的肌动蛋白环（B）一个圆形。比例尺= 15微米请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议有几个关键步骤。第一是珠粒度均匀性，这是需要保持营养物和气体的扩散的相同的条件下在所有的细胞培养物。根据我们的经验，采用了21g的针头，使藻酸盐可用于收购珠均匀大小的有效文化。第二个重要因素是从针的距离;这个距离必须不超过从钙溶液5cm至避免变形珍珠和死细胞由于与钙溶液的表面上的藻酸盐/细胞溶液流的碰撞。第三关键步骤是在玻璃搅拌在其中珠被丢弃，以防止它们粘到彼此。坚持在不平坦的电池封装结果。
一些修改这个协议可以根据所研究的问题来进行，例如，在我们的经验藻酸钠的溶液可以混合瓦特第i基底膜蛋白像IV型胶原，并且按照先前描述的方案，得到一种三维藻支架。另一种可能性是使漂浮在直径15毫米的孔藻靠垫;这些凝胶内，细胞可以高于或在他们里面播种。如果任何特定实验在他们的 Ca 2+或Mg 2+浓度需要修改与藻酸盐时故障排除可能是必要的。这是因为水凝胶稳定性可以改变。巴2+ -and 铜离子-crosslinked藻凝胶在水溶液中相对稳定的，不幸的是，这些阳离子是经常的细胞毒性3。
当与肿瘤组织如垂体腺瘤组织工作，该技术的一个限制是所提供的小的组织样本。因此，获得的藻酸盐珠的数量取决于组织样品的大小。
以前，一个系统保持在三维培养垂体腺瘤细胞已经描述。作者提交的细胞回旋振荡，以形成聚集体并保持所述细胞在这种条件下对不同时期16。使用这种细胞悬浮培养需要培养室内旋回设备。这里所描述的协议中的一个优点是，它允许在一个三维系统细胞，而不需要额外的实验设备的培养。嵌入在三维藻系统将细胞保持在正规烧瓶内定期培养箱。另一个优点是，藻酸盐支架，在与其他立体系统相反，允许从水凝胶中释放进一步调查7细胞。此外，在藻酸盐珠培养细胞的一个重要方面是，嵌入在该系统中的细胞能够synthetize 从头细胞外基质。替代嵌入在藻细胞的研究的方法是将藻酸盐珠随后通过脱水随着聚乙二醇的浓度为后续切片和免疫组织化学分析17的固定。
我们感兴趣的是未来的三维藻酸盐珠系统为嵌入式主培养正常垂体的大鼠细胞应用，以便分析在三维环境它们之间的相互作用，同时也为培养其他类型垂体腺瘤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W. R.
- Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
- Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
