Abstract
En tredimensionell odling metod beskrivs i vilken primära hypofysadenom celler odlas i alginatpärlor. Alginat är en polymer härledd från brunt havsalger. Kortfattat är den tumörvävnad skars i små bitar och utsattes för en enzymatisk digerering med kollagenas och trypsin. Därefter görs en cellsuspension erhålles. Tumörcellsuspension blandas med 1,2% natriumalginat och droppades i en CaCl2-lösning, och den alginat / cellsuspensionen gelas vid kontakt med den CaCl2 för att bilda sfäriska pärlor. Cellerna inbäddade i alginatpärlorna levereras med näringsämnen som tillhandahålls av odlingsmedier berikade med 20% FBS. Tredimensionella kultur i alginatpärlor upprätthåller livskraften hos adenom cellerna under långa tidsperioder, upp till fyra månader. Dessutom kan cellerna frigöras från alginatet genom tvättning av pärlorna med natriumcitrat och såddes på täckglas för ytterligare immunocytokemiska analyser. Användningen av ett cell kulturmodell möjliggör för fixering och visualisering av aktin cytoskelettet med minimal oordning. Sammanfattningsvis alginatpärlor ge en tillförlitlig kultursystem för underhåll av hypofysadenom celler.
Introduction
Tredimensionella ställningar har i stor utsträckning använts i cellodling eftersom de ger ett tredimensionellt strukturellt stöd till odlade celler och upprätthållandet av cell-till-cellkommunikation 1. Naturligt framställda polymermaterial har använts för att göra tredimensionella ställningar inklusive typ I-kollagen, kitosan och alginat. Alginat är en naturlig polymer som härrör från bruna havsalger Macrocystispyrifera (Kelp). Denna polymer är sammansatt av upprepade enheter av β-D-mannuronsyra (M) och α-L-guluronsyra (G) 2 och bildar stabila geler i närvaro av vissa divalenta katjoner, såsom kalcium och barium. Kalciumklorid (CaCl2) lösningar är allmänt använda som tvärbindningsreagens för att bilda alginatpärlor. Alginatlösningar sjönk i CaCl2 omedelbart bilda tredimensionella sfäriska geler. När alginatlösningen blandas med celler, cellerna inkapslade i alginat beads 3.
Alginat har egenskaper som har gjort det möjligt att användas som en matris för inkapsling av en mängd olika celler, inklusive kondrocyter 4, skelett myoblaster 5 och neurala stamceller 6. Det är ett inert material och tillåter diffusion av näringsämnen, syre och metaboliska produkter som upprätthåller cellens överlevnad och funktion; Dessutom, till skillnad från andra gelbaserade odlingssystem, celler odlade i alginatpärlor kan också frigöras från ställningen med användning av kalcium kelatorer, såsom natriumcitrat, och cellerna kan sedan skördas för fortsatta undersökningar 7.
Hypofysadenom är typiskt godartade tumörer med låga proliferationshastigheter. Råtta hypofysadenom cellinjer har framgångsrikt odlas i ett två-dimensionellt system 8. Men är denna kultur av sekretoriska hypofys celltumörer mänskliga inte en effektiv utveckling; spridda tumör hypofysceller växer dåligti kultur, cellerna uppvisar begränsad vidhäftning och spridning, och cellerna bildar typiskt flytande aggregat i odlingsskålen 9,10.
Flera försök har gjorts för att erhålla en tumör hypofys cellsuspension, innefattande en enzymatisk och mekanisk dispersion tillvägagångssätt 11, en uteslutande mekanisk dispersion tillvägagångssätt 12 och odlingen av tumör explants 10. Med dessa metoder har olika författare erhållna livskraftiga vidhäftande kulturer för olika tidsperioder. Kapaciteten hos tumör sekretoriska celler att överleva i dessa tvådimensionella system beror på tumörtyp och deras förökningshastigheter 9. Men i långsiktiga kulturer, celler med fibroblaster fenotyper dominerar 11,13. Detta dokument beskriver en metod för att erhålla en primär kultur från hypofysadenom celler inkapslade i alginat pärlor som ytterligare frigör dem från alginat klätterställning som möjliggör detaljerade analyser avaspekter av deras cellbiologi, t.ex. deras cytoskelettala arrangemang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes för användning av mänskligt material av den lokala etiska kommittéerna från den medicinska inrättningen och centrum för forskning och Advance Studier av National Polytechnic Institute.
1. tumörprov Förvärv
- Skaffa hypofysadenom vävnadsbiopsi från en patient genom en trans sphenoidal kirurgiskt ingrepp 14.
- Samla upp hypofysadenom provet och placera den i en steril glasflaska som innehåller 50 ml färskt 199 odlingsmedium (M199) berikad med 10% fetalt bovint serum (FBS), 0,6 mg / ml natriumvätekarbonat, 2,4 mg / ml HEPES och 1% antibiotika (penicillin / streptomycin) vid pH 7,4. Hålla provet i en glasflaska på is.
Notera: Tumörvävnaden kan bearbetas flera h efter operationen. - Transportera tumörprov till laboratoriet i glasflaska på is.
2. Framställning av den enzymatiska vävnadsdissociering Solutions, denTrypsin Inhibitor Solution och de alginatlösningar
Obs: Före cellodlingsförfarande förbereda följande lösningar. Filtrera alla de lösningar med hjälp av ett 0,22 | j, m membranfilter, före användning.
- Förbereda kollagenas 1% lösning genom att lösa upp 5 mg av kollagenas (typ I) i 5 ml av M199-serumfritt.
- Förbereda trypsin 0,01% lösning genom upplösning av 0,01 g trypsin i 10 ml PBS-EDTA 0,3%.
- Förbereda 0,1% trypsin-inhibitor-lösning genom att lösa 2 mg soja-trypsininhibitor i 20 ml M199-serumfritt.
- Förbereda DNAse lösning genom att lösa upp 20 | il DNas I 134 U / ml i 4 ml lösning av trypsin-inhibitor.
- Förbereda EGTA-lösning (1,2 M) genom att lösa upp 22,8 mg av EGTA i 40 ml 155 mM NaCl. Justera pH till 7,4. Fortsätt till en slutlig volym av 50 ml.
- Förbereda HEPES-lösning (20 mM) genom att lösa 238 mg HEPES i 50 ml 155 mM NaCl.
- Bered 1,2% alginat lösning genom att lösa 1,2g natrium-alginat i 100 ml av HEPES-lösning. Autoklavera alginatlösningen.
- Framställa kalciumlösning (102 mM) genom att lösa 750 mg CaCl2 i 50 ml HEPES-lösning, justera pH till 7,4
3. Primär Cell Culture och alginat inkapsling
- Inne i ett skåp med laminärt flöde, placera tumörvävnaden i en 35 mm petriskål innehållande ungefär 20 ml PBS Ca2 + och Mg2 + fri, pH 7,4 (PBS *).
- Ta vävnaden med en kirurgisk pincett och placera den i en annan petriskål med färsk PBS *, tvätta försiktigt vävnaden. Upprepa detta steg tills de röda blodkropparna och skräp tas bort.
- Med hjälp av en kirurgisk pincett, håll hypofysadenom vävnad, och med en liten kirurgisk sax, skär den i små bitar. Med en pasteurpipett med rundade kanter, överföra vävnadsfragment och PBS * till ett 15 ml rör och centrifugera vid 68 xg under 10 min vid RT.
Obs! För att runda av kanterna på en Pasteurpipett något flamma spetsen av pipetten i en bunsenbrännare. - Avlägsna PBS * med användning av en Pasteur-pipett och tillsätt 3-5 ml av den kollagenaslösning (ca 5 ml för 65 mm 3 av vävnad), blanda två till tre gånger genom att vända. Inkubera vävnaden i kollagenas under 30 min vid 37 ° C i konstant rotation.
- Centrifugera röret vid 68 xg under 10 min vid RT och avlägsna kollagenas med en Pasteur-pipett.
- Tillsätt 5 ml DNAse och blanda två till tre gånger genom att vända, sedan centrifugera röret vid 68 xg under 10 min vid RT.
Obs: Om vävnaden inte är fullständigt dissocierade, utföra en andra enzymatisk uppslutning med trypsin under 3 min vid 37 ° C. Stoppa digerering genom tillsats av 2 volymer trypsininhibitor lösning. - Aspirera supernatanten med en Pasteur-pipett och kasta. Återsuspendera pelleten i en volym av EGTA-lösning och blanda med 2 volymer alginatlösning.
- Blanda försiktigt cellsuspensionen och alginatgenom att pipettera med en Pasteur-pipett. Ta en steril spruta med en 21 G nål, ta bort kolven; använda en pipett för att ladda sprutan med alginat och cellösningen.
- Försiktigt in kolven i sprutan och noggrant dosera alginat-cell lösning drop-by-drop i en glasbägare innehållande ca 30 ml av kalciumrik lösning.
- Placera nålen på sprutan ca 5 cm upp till CaCl2-lösning. De alginat-cellsuspensions geler vid kontakt med CaCl2 för bildning av sfäriska pärlor. Hålla alginatpärlor i kalciumlösningen i 5 min.
Obs: Rör om glasbägare i vilken pärlorna tappas. Flytta den sakta med handen i cirkulära rörelser, för att hindra dem från att fastna vid varandra. - Försiktigt bort kalciumlösningen med en Pasteurpipett och tvätta pärlorna två gånger med 3-5 ml M199 berikad med 20% FBS.
- Överför alginatpärlor i en vanlig T25 vävnadskulturkolv med en steril spatel, tillsätt 4-5 ml M199 berikad med 20% FBS och inkuberades vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2. Ändra odlingsmediet var tredje dag.
4. Liberate Celler från Alginat
Obs: Före befria cellerna från alginatpärlor, kappa 13 täck mm diameter med poly-D-lysin.
VARNING: Svavelsyra är en starkt frätande syra och APTS KAN ORSAKA ÖGON OCH HUD. Använd latexhandskar för att hantera dessa REAGENSER.
- I ett dragskåp, med en punkt pincett doppa täckglasen i en glaspetriskål som innehåller 20% vattenhaltig svavelsyra under 1 h vid RT.
- Häll av svavelsyra, och tvätta täckglasen fem gånger med destillerat vatten under 5 min vardera. Med användning av en punkt pincett plats de rena täckglas i en petriskål innehållande 0,1 M NaOH under 5 min vid RT 15.
- Häll av NaOH och tvätta en gång med Distilledde vatten, aspirera vatten och torka täck.
- Använd en mikropipett att belägga täck med APTS (aminopropyl-trietoxisilan) under 4 min (använd 500 l 6 täck) översvämma petriskål med destillerat vatten. Snabbt aspirera vatten och fortsätta att tvätta med destillerat vatten, flytta täck med punkt pincett för att låta vattnet tränga under.
- Aspirera vatten och torka täck, med hjälp av en punkt pincett plats täck i en ren petriskål och sterilisera dem i mikrovågsugnen under 3 gånger, 45 sekunder vardera. Lägga 1000 | il sterilt vatten till 100 ^ g av poly-D-lysin (0,1 mg / ml).
- Inkubera täckglas med ca 50 | il av poly-D-lysin under 5 minuter vid RT. Aspirera poly-D-lysin helt.
Obs: Detta är viktigt eftersom löslig poly-D-lysin i odlingsmediet kan hämma celltillväxt. - Skölj täckglasen fem gånger med sterilt vatten för 5 min vardera. Aspirera sterile vatten och låt täck torka i ett skåp med laminärt flöde.
- För att analysera aktin cytoskelettet, befria hypofysceller från alginat. Ta del av alginatpärlor från odlingskolven med hjälp av en 1 ml pipettspets och placera dem i en 15 ml tub.
- Tillsätt 5 ml av 55 mM natriumcitrat (upplösa 323,6 mg Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H2O i 20 lösning ml HEPES) och centrifugera vid 68 xg under 10 min vid RT. Aspirera supernatanten och kassera.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml varmt M199 berikad med 20% FSB; blanda försiktigt cellsuspensionen med en Pasteur-pipett.
VARNING: falloidin OCH DAPI är giftiga. Använd handskar för att hantera dessa REAGENSER. - Att räkna cellerna, överföring 125 pl av 0,4% Trypan blå lösning till ett 1,5 ml rör. Lägga 75 ul M199 och 50 | j, l av cellsuspensionen som erhölls i det sista steget (spädningsfaktor = 5). Blanda omsorgsfullt.
- Använd en mikropipett tips till Place ungefär 10 pl av trypanblått-cellsuspensionen i hemocytometer kammaren.
- Räkna cellerna i hemocytometer räknaren med ett inverterat mikroskop med faskontrast-belysning. Räkna alla celler i 1 mm centrum torget och fyra 1 mm hörn rutor. Erhålla celltätheten per milliliter genom att multiplicera den genomsnittliga räkningen per kvadrat med spädningsfaktorn -. 10 4 Till exempel om den genomsnittliga impulser per kvadrat är 45 celler x 5 x 104 = 2,25 x 106 celler / ml.
Obs: Räkna celler i tio rutor i hemocytometer kammaren. Räkna inte celler berör mittlinjen på botten och höger sida. - Frö 35.000 celler på 13 mm diameter glastäckglas belagda med poly-D-lysin.
5. aktincytoskelettet arrangemang
- Efter 48 timmar i kultur, ta bort odlingsmediet med en pasteurpipett och snabbt lägga 500 l per täck PBS, omedelbart ta bort PBS.
- Fix och permeabilisering than celler med 500 pl per täckglas av fixeringsbuffert (0,1 M PIPES, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 0,5% Triton X-100 och 2% formaldehyd) under 10 min vid 37 ° C
- Avlägsna fixeringsbuffert och tillsätt 500 pl per täckglas av 3,5% paraformaldehyd i PBS under 30 min vid RT. Ta bort paraformaldehydlösning.
- Tvätta täck tre gånger genom tillsats av 500 pl per täck PBS under 5 minuter vardera. Skölj täckglasen vid RT, i konstant omrörning.
- Inkubera cellerna med 50 mM ammoniumklorid i 10 minuter, aspirera ammoniumkloridlösning och upprepa steg 5,4.
- Inkubera cellerna med 1% BSA (IgG-fri, proteaser-free) i PBS under 30 minuter, ta bort BSA lösning och upprepa steg 5,4.
- Inkubera cellerna med 50 | iM av rodamin-konjugerat falloidin under 7 min vid RT, upprepa steg 5,4.
- Inkubera cellerna med 255 | iM av DAPI utspädd i PBS under 5 minuter vid RT, upprepa steg 5,4. Slutligen montera than täck med en monteringsmedium och täta dem med nagellack.
- Förvärva bilder av aktin cytoskelettala arrangemang med hjälp av en konfokala laserskanning mikroskop med en 63x objektiv, vid 541 nm excitationsvåglängd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll har tillämpats med framgång i kulturen och underhåll av adenom hypofysceller i alginatpärlor för olika tidsperioder Figur 1 visar inbäddade celler i alginatpärlor efter tre månader. dessa celler uppvisar bi-brytnings rundade former under ett inverterat ljusmikroskop (figur 1). Figur 2 visar lokaliseringen av N-cadherin i rått hypofysadenom celler inbäddade i alginat. N-cadherin är lokaliserad vid cell-cellkontakter (Figur 2A och 2C) och kärnan visade kromatinet förlängas (figur 2B och 2C).
Tumörceller i alginatpärlor förblir livsdugliga i upp till 4 månader i odling; därför kan cellerna frigöras från alginatpärlorna vid olika tidpunkter, vilket möjliggör analyser av olika aspekter avcellbiologi i samma cellkultur. Till exempel, var proliferationen indexet erhållet från tio icke-fungerande humana hypofysadenom med hjälp av immun-reaktiviteten för Ki-67, och en genomsnittlig märkningsindex av 19,2 ± 1,5% (medelvärde ± SEM) erhölls. Figur 3 visar odlade humana hypofys adenom celler immun för Ki-67.
Aktin cytoskeletons celler av en icke-invasiv färgades enligt immuncytokemiska protokoll beskriver ovan. Odlingsceller uppvisade avlånga former med små aktin spänningsfibrer (Figur 4A) .De morfologier och aktin filamentarrangemang varierade med hypofysadenom oberoende av odlingssystemet; till exempel, i en icke-fungerande invasiv adenom, var den dominerande formen bland dessa celler avrundas med ett arrangemang av deras aktinfilament i diskontinuerliga kortikala ringar. (Figur 4B).
Figur 1. Celler inbäddade i alginatpärlor i 3 månader. Celler uppvisar bi-brytnings rundade former under ett inverterat ljusmikroskop. I den högra panelen invasiva macroadenoma celler inbäddade i alginat visas, och i den vänstra panelen icke-invasiva macroadenoma celler visas. Skala bar = 15 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Immuno-cytokemisk analys av N-cadherin i Rat hypofysadenom celler (GH3) kultur i alginatpärlor. GH3-celler odlades i alginat, fast inbäddad i alginat systemet färgas för N-cadherin (röd) och kärnan (blå ). Celler ordna i en cumUlus visar N-cadherin i cell-cell gränser (A och C). Kärnan (B och C) är visade med kromatin förlängas. Skala bar = 15 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Immunfärgning av kärnantigen Ki-67-odlade humana hypofysadenom celler. Efter 2,5 månader i alginat pärla kultur, var invasiva icke-fungerande adenom fixerades cellerna och därefter immun för Ki-67 (röd) och kärnan (blå). Vissa adenom celler visar positiv immunfärgning för Ki-67. Skala bar = 15 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. aktincytoskelettet arrangemang av hypofysadenom celler befriats från alginatpärlor. Cellerna fixeras och färgas för aktinfilament med TRITC-falloidin. Celler från en icke-invasiv macroadenoma förlängdes över substratet, som visar små aktin spänningsfibrer (A). Celler från en invasiv macroadenoma visade en rundad form med diskontinuerliga aktin ringar (B). Skala bar = 15 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll har flera viktiga steg. Den första är pärlstorlek homogenitet, som krävs för att bibehålla samma villkor för diffusion av näringsämnen och gaser i hela cellkulturen. I vår erfarenhet, användning av en 21 G nål för att göra alginatpärlorna möjliggör för förvärv av en effektiv kultur av enhetlig pärlstorleken. Den andra viktiga faktorn är avståndet från nålen; detta avstånd får inte vara mer än 5 cm från kalciumlösningen för att undvika deformerade pärlor och döda celler på grund av kollisionen av strömmen av den alginat / cell-lösning med ytan av kalciumlösningen. Ett tredje kritiskt steg är glaset omrörning i vilken pärlorna sjunkit för att hindra dem från att fastna vid varandra. Stickning resulterar i ojämn cellinkapslings.
Vissa ändringar i detta protokoll kan utföras beroende på frågeställningen, till exempel, i vår erfarenhet lösningen av natriumalginat kan blandas wed en basalmembranprotein som typ IV-kollagen, och genom att följa det protokoll som tidigare beskrivits, erhållande en tredimensionell alginat byggnadsställning. En annan möjlighet är att göra flytande alginat kuddar i brunnarna 15 mm diameter; inuti dessa geler kan celler ympas ovanför eller inuti dem. Felsökning när du arbetar med alginat kan vara nödvändigt om en viss experiment behöver ändringar i deras Ca2 + eller Mg 2 + koncentrationer. Detta beror på att hydrogelen stabiliteten kan ändras. Ba 2+ -och Cu 2+ -crosslinked alginat geler är relativt stabila i vattenlösningar, tyvärr, dessa katjoner ofta cytotoxiska 3.
När man arbetar med tumörvävnader såsom hypofysadenom vävnader, är en begränsning av denna teknik den lilla vävnadsprov tillhandahålls. Därför är antalet av alginatpärlor erhållits beror av storleken på det vävnadsprov.
Tidigare, ett system för attupprätthålla hypofysadenom celler i en tre-dimensionell kultur har beskrivits. Författarna lämnat cellerna till spindel skakar att bilda aggregat och underhålls cellerna i detta tillstånd för olika perioder 16. Användningen av denna cellsuspensionskultur kräver spindel utrustning inuti odlingskammaren. En fördel med det protokoll som beskrivs här är att det gör det möjligt för odling av celler i ett tredimensionellt system utan behov av extra laboratorieutrustning. Cellerna inbäddade i det tredimensionella alginat systemet bibehålls i en vanlig inkubator inne i en vanlig kolv. En annan fördel är att alginatet byggnadsställning, i motsats till andra tre-dimensionella system, tillåter cellerna att bli befriade från hydrogelen för vidare undersökning 7. Vidare är en viktig aspekt av att odla celler i alginatpärlor att cellerna inbäddade i detta system har möjlighet att syntetisera de novo extracellulära matrisen. Ett alternativmetod för att studera celler inbäddade i alginat är fixeringen av alginatpärlor följt av deras uttorkning med ökande koncentrationer av polyetylenglykol för efterföljande sektionering och Immuno-histokemisk analys 17.
Vi är intresserade av att i framtiden tillämpa tredimensionella alginat pärlor systemet inbäddade primära kultur normala hypofysen råttceller för att analysera deras interaktioner i en tredimensionell miljö, och även kultur annan typ av hypofysadenom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W. R.
- Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
- Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
