Abstract
Et tredimensionalt kultur metode er beskrevet, hvor primære hypofyseadenom celler dyrkes i alginatkugler. Alginat er en polymer afledt af brune havalger. Kort fortalt er tumorvævet skåret i små stykker og underkastet en enzymatisk fordøjelse med collagenase og trypsin. Dernæst opnås en cellesuspension. Tumorcellen suspension blandes med 1,2% natriumalginat og dryppet i en CaCl2 opløsning, og alginat / cellesuspensionen geleres ved kontakt med CaCl2 til dannelse sfæriske perler. Cellerne indlejret i alginatkugler forsynes med næringsstoffer leveret af kulturmediet beriget med 20% FBS. Tredimensionale kultur i alginatkugler opretholder levedygtigheden af adenom-celler i længere tid, op til fire måneder. Desuden kan cellerne frigøres fra alginatet ved at vaske perlerne med natriumcitrat og podet på dækglas til yderligere immuncytokemiske analyser. Anvendelsen af en cell kultur model giver mulighed for fiksering og visualisering af actincytoskelettet med minimal desorganisering. Sammenfattende alginatkugler giver en pålidelig dyrkningssystem for opretholdelse af hypofyseadenom celler.
Introduction
Tredimensionale skeletter er blevet omfattende anvendt i celledyrkning, fordi de giver en tredimensionel strukturel støtte til dyrkede celler og opretholdelse af celle-til-celle-kommunikation 1. Naturligt afledte polymere materialer er blevet anvendt til at fremstille tredimensionale skeletter, herunder type I collagen, chitosan og alginat. Alginat er en naturlig polymer afledt af den brune havalger Macrocystispyrifera (Kelp). Denne polymer er sammensat af gentagne enheder af β-D-mannuronsyre (M) og α-L-guluronsyre (G) 2 og danner stabile geler i nærvær af visse divalente kationer, såsom calcium og barium. Calciumchlorid (CaCl2) løsninger anvendes almindeligvis som det tværbindende reagens til dannelse alginatkugler. Alginatopløsninger faldt i CaCl2 straks danne tredimensionale sfæriske geler. Når alginat opløsningen blandes med celler, cellerne indkapsles i alginat BEADS 3.
Alginat har egenskaber, der har gjort det muligt at blive anvendt som en matrix til indkapsling af en række celler, herunder chondrocytter 4, skeletmyoblaster 5 og neurale stam- celler 6. Det er et inaktivt materiale og tillader diffusion af næringsstoffer, ilt og stofskifteprodukter, der opretholder cellens overlevelse og funktion; desuden i modsætning til andre gel-baserede dyrkningssystemer, celler dyrket i alginatkugler kan også frigøres fra stilladset hjælp calciumchelatorer, såsom natriumcitrat, og cellerne kan derefter høstes til yderligere undersøgelser 7.
Hypofyseadenomer er typisk godartede tumorer med lave spredning satser. Rotte hypofyseadenom cellelinier er med held blevet dyrket i et todimensionalt systemet 8. Men denne kultur af sekretoriske humane hypofyse celle tumorer er ikke en effektiv udvikling; dispergerede tumor hypofyseceller vokser dårligti kultur, cellerne udviser begrænset vedhæftning og spredning, og cellerne typisk danner flydende aggregater i kultur fad 9,10.
Adskillige forsøg er blevet gjort for at opnå en tumor hypofyse cellesuspension, herunder en enzymatisk og mekanisk dispersion tilgang 11, et rent mekanisk dispersion tilgang 12 og dyrkningen af tumoreksplantater 10. Med disse tiltag, har forskellige forfattere fået levedygtige vedhængende kulturer i forskellige perioder. Kapaciteten af de tumor sekretoriske celler til at overleve i disse to-dimensionale systemer afhænger af tumortype og deres opformeringsrater 9. Men i langvarige kulturer, celler med fibroblast fænotyper fremherskende, 11,13. Dette papir beskriver en fremgangsmåde til opnåelse af en primær kultur fra hypofyseadenom celler indkapslet i alginatkugler, som yderligere under dannelse dem fra alginat stillads, der muliggør detaljerede analyser afaspekter af deres cellebiologi, fx deres cytoskeletale arrangementer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt til brug af humant materiale af de lokale etiske komiteer fra den behandlende institution og Center for Forskning og Advance Studier af National Polytechnic Institute.
1. Tumor Sample Erhvervelse
- Anskaf hypofyseadenom væv biopsi fra en patient gennem en trans-sphenoidal kirurgisk procedure 14.
- Opsaml hypofyseadenom prøve, og dette i en steril glasflaske indeholdende 50 ml frisk 199 dyrkningsmedium (M199) beriget med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,6 mg / ml natriumbicarbonat, 2,4 mg / ml HEPES og 1% antibiotika (penicillin / streptomycin) ved pH 7,4. Opretholde prøven i en glasflaske på is.
Bemærk: tumorvæv kan behandles flere timer efter operationen. - Transportere tumorprøven til laboratoriet i glasflasken på is.
2. Fremstilling af den enzymatiske Tissue Dissociation Solutions, denTrypsin Inhibitor opløsning, og alginatopløsninger
Bemærk: Før proceduren cellekulturen fremstille følgende løsninger. Filtrere alle opløsningerne ved anvendelse af en 0,22 um membranfilter, før anvendelse.
- Forbered collagenase 1% opløsning ved at opløse 5 mg collagenase (type I) i 5 ml M199-serumfrit.
- Forbered trypsin 0,01% opløsning ved at opløse 0,01 g af trypsin i 10 ml PBS-EDTA 0,3%.
- Forbered 0,1% trypsininhibitor opløsning ved opløsning 2 mg soja trypsininhibitor i 20 ml M199-serumfrit.
- Forbered DNAse opløsning ved opløsning af 20 pi DNase I 134 U / ml i 4 ml af trypsininhibitor opløsning.
- Forbered EGTA-opløsning (1,2 M) ved opløsning 22,8 mg EGTA i 40 ml 155 mM NaCl. Justere pH til 7,4. Fortsæt til et endeligt volumen på 50 ml.
- Forbered HEPES-opløsning (20 mM) ved at opløse 238 mg HEPES i 50 ml 155 mM NaCl.
- Forbered 1,2% alginat opløsning ved opløsning 1,2g natriumalginat i 100 ml af HEPES-opløsning. Autoklaver alginatopløsningen.
- Forbered calcium-opløsning (102 mM) ved opløsning 750 mg CaCI2 i 50 ml HEPES opløsning, justere pH til 7,4
3. primær cellekultur og alginat Indkapsling
- Inde i en laminar strømning, placere tumorvævet i en 35 mm petriskål indeholdende ca. 20 ml PBS Ca2 + og Mg2 + fri, pH 7,4 (PBS *).
- Tag vævet med en kirurgisk pincet og læg den i en anden petriskål indeholdende frisk PBS *, forsigtigt vaske vævet. Gentag dette trin, indtil de røde blodlegemer og rester fjernes.
- Ved hjælp af en kirurgisk pincet, holde hypofyseadenom væv, og med en lille kirurgisk saks, skæres i små stykker. Med en Pasteur-pipette med afrundede kanter, overføre væv fragmenter og PBS * i et 15 ml rør, centrifugeres ved 68 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: For at afrunde kanterne af en Pasteurpipette, hård flamme spidsen af pipetten i en bunsenbrænder. - Fjern PBS * ved anvendelse af en Pasteur-pipette og tilsæt 3-5 ml collagenaseopløsningen (ca. 5 ml til 65 mm 3 af væv), bland to til tre gange ved at vende. Inkuber vævet i collagenase i 30 minutter ved 37 ° C i konstant rotation.
- Centrifugeres røret ved 68 x g i 10 minutter ved stuetemperatur og fjerne collagenase med en Pasteur-pipette.
- Der tilsættes 5 ml DNAse og blandes to til tre gange ved at vende, centrifugeres røret ved 68 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: Hvis vævet ikke er helt dissocieret, udføre en anden enzymatisk fordøjelse med trypsin i 3 minutter ved 37 ° C. Stop fordøjelse ved tilsætning af 2 volumener trypsininhibitor opløsning. - Aspirere supernatanten med en Pasteur-pipette og kassér. Resuspender pellet i 1 volumen EGTA opløsning og blandes med 2 volumener alginatopløsning.
- Bland forsigtigt cellesuspensionen og alginatved pipettering med en Pasteur-pipette. Tag en steril sprøjte med en 21 G nål, fjerne stemplet; bruge en pipette til at indlæse sprøjten med alginat og celle løsning.
- Sæt forsigtigt stemplet ind i sprøjten og omhyggeligt dispensere alginat-celle opløsning drop-by-drop i et bægerglas indeholdende ca. 30 ml af calcium-berigede opløsning.
- Placer nålen af sprøjten ca. 5 cm op til CaCl2-opløsning. De alginat-cellesuspension geler ved kontakt med CaCl2 til dannelse sfæriske perler. Hold alginatkuglerne i calcium- opløsningen i 5 min.
Bemærk: Omrør bægerglas, hvori perlerne er faldet. Flyt den langsomt med hånden i cirkulære bevægelser, for at forhindre dem i at klæbe til hinanden. - Fjern forsigtigt calcium opløsning med en Pasteur-pipette, og vask perlerne to gange med 3-5 ml M199 beriget med 20% FBS.
- Overfør alginatkuglerne til et almindeligt T25 vævskulturkolbe under anvendelse af en steril spatel, tilsættes 4-5 ml M199 beriget med 20% FBS og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2. Skift dyrkningsmediet hver tredie dag.
4. befri Celler fra Alginat
Bemærk: Før befri cellerne fra alginatkuglerne, frakke 13 mm diameter dækglas med poly-D-lysin.
ADVARSEL: SVOVLSYRE ER EN MEGET ætsende syre, OG APTS KAN FORÅRSAGE ØJNE OG HUD. Latex handsker til at håndtere disse reagenser.
- I et stinkskab med et punkt pincet fordybe dækglassene i et glas petriskål indeholdende 20% vandig svovlsyre i 1 time ved stuetemperatur.
- Dekanteres svovlsyre, og vask dækglassene fem gange med destilleret vand i 5 minutter hver. Brug af et punkt pincet sted de rene dækglas i en petriskål indeholdende 0,1 M NaOH i 5 minutter ved stuetemperatur 15.
- Dekanteres NaOH og vask en gang med destillereførte vand, aspirere vand og tør dækglassene.
- Brug en mikropipette til at coate dækglassene med APTS (aminopropyl-triethoxysilan) i 4 minutter (brug 500 pi til 6 dækglas) oversvømme petriskålen med destilleret vand. Hurtigt aspirere vandet og fortsætte med at vaske med destilleret vand, flytte dækglas med punkt pincet til at lade vandet at trænge under.
- Aspirer vand og tør dækglassene, under anvendelse af et punkt pincet sted dækglassene i en ren petriskål og sterilisere dem inde i mikrobølgeovn i 3 gange, 45 sekunder hver. Tilføj 1.000 pi sterilt vand til 100 ug poly-D-lysin (0,1 mg / ml).
- Inkubér dækglas med ca. 50 pi poly-D-lysin i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer poly-D-lysin fuldstændigt.
Bemærk: Dette er vigtigt, fordi opløselig poly-D-lysin i dyrkningsmediet kan hæmme celleproliferation. - Skyl dækglassene fem gange med sterilt vand i 5 min hver. Aspirer sterile vand, og lad dækglas til tørre inde i et laminar flow kabinet.
- For at analysere actincytoskelettet, befri hypofyseceller fra alginatet. Tage nogle af de alginatkugler fra dyrkningskolben anvendelse af en 1 ml pipettespids og placere dem i et 15 ml rør.
- Der tilsættes 5 ml 55 mM natriumcitrat (opløse 323,6 mg Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H2O i 20 ml HEPES opløsning) og centrifugeres ved 68 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Aspirere supernatanten og kassér.
- Re-suspendere pellet i 1 ml varmt M199 beriget med 20% FSB; bland forsigtigt cellesuspensionen med en Pasteur-pipette.
ADVARSEL: phalloidin OG DAPI ER GIFTIG. Brug handsker til at håndtere disse reagenser. - At tælle cellerne, overføre 125 pi 0,4% Trypan blå opløsning til et 1,5 ml rør. Tilføj 75 pi M199 og 50 pi af cellesuspensionen opnået i det sidste trin (fortyndingsfaktor = 5). Bland grundigt.
- Brug en mikropipette tip til place ca. 10 pi af trypanblåt-cellesuspension i hæmocytometeret kammeret.
- Tæl cellerne i hæmocytometer tæller under anvendelse af et omvendt mikroskop med fasekontrast-belysning. Tæl alle cellerne i 1 mm center pladsen og fire 1 mm hjørne kvadrater. Anskaf celledensiteten per milliliter ved at gange den gennemsnitlige tælling pr kvadrat med fortyndingsfaktoren -. 10 4 For eksempel hvis de gennemsnitlige tællinger per kvadrat er 45 celler x 5 x 104 = 2,25 x 106 celler / ml.
Bemærk: Tæl cellerne i ti pladser i hæmocytometeret kammer. Må ikke tælle celler rører den midterste linje nederst og højre side. - Seed 35.000 celler på 13 mm glas diameter dækglas dækket med poly-D-lysin.
5. actincytoskelettet Arrangement
- Efter 48 timer i kultur, fjerne dyrkningsmediet med en Pasteur-pipette og hurtigt at tilføje 500 pi pr dækglas PBS, straks fjerne PBS.
- Fix og permeabilisere than celler med 500 pi pr dækglas af fiksering buffer (0,1 M PIPES, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 0,5% Triton X-100 og 2% formaldehyd) i 10 minutter ved 37 ° C
- Fjern fiksering buffer, og der tilsættes 500 pi pr dækglas på 3,5% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern paraformaldehydopløsning.
- Vask dækglassene tre gange ved tilsætning af 500 pi pr dækglas PBS i 5 minutter hver. Skyl dækglas ved RT, i konstant omrøring.
- Inkubér cellerne med 50 mM ammoniumchlorid i 10 min, aspireres ammoniumchloridopløsning og gentag trin 5.4.
- Inkubér cellerne med 1% BSA (IgG-fri, proteaser-frit) i PBS i 30 minutter, fjern BSA-opløsningen, og gentag trin 5.4.
- Inkubér cellerne med 50 uM rhodamin-konjugeret phalloidin i 7 min ved RT Gentag trin 5.4.
- Inkubér cellerne med 255 uM af DAPI fortyndet i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur, gentag trin 5.4. Endelig montere than dækglas med et monterings medium og forsegle dem med neglelak.
- Erhverve billeder af actin cytoskeletale arrangementer ved hjælp af en konfokal laser scanning mikroskop med en 63X objektiv, på 541 nm excitation bølgelængde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol er blevet anvendt med succes i kulturen og vedligeholdelse af adenom hypofyse celler i alginat perler til forskellige perioder Figur 1 viser indlejrede celler i alginatkugler efter tre måneder.; udviser disse celler bi-refraktiv afrundede former under et omvendt lysmikroskop (figur 1). Figur 2 viser lokaliseringen af N-cadherin i rotte hypofyseadenom celler indlejret i alginat. Den N-cadherin er lokaliseret ved celle-celle kontakter (figur 2A og 2C) og kernen viste kromatin udvidet (figur 2B og 2C).
Tumor celler i alginatkugler forbliver levedygtige i op til 4 måneder i kultur; derfor kan cellerne frigøres fra alginatkuglerne på forskellige tidspunkter, hvilket giver mulighed for analyserne af forskellige aspekter afcellebiologi i den samme cellekultur. For eksempel blev proliferationsindekset opnået fra ti ikke-fungerende humane hypofyseadenomer ved hjælp af immun-reaktivitet for Ki-67, og en gennemsnitlig mærkning indeks på 19,2 ± 1,5% (middel ± SEM) blev opnået. Figur 3 viser dyrkede humane hypofyse adenom celler immunofarvede for Ki-67.
De actin cytoskelet af celler af en ikke-invasiv blev farvet ifølge den immuncytokemiske protokol beskrevet ovenfor. Dyrkede celler udviste aflange former med små actin stress fibre (figur 4A) .De morfologier og actin filament arrangementer varierede med hypofyseadenom uafhængigt af dyrkningssystemet; for eksempel i et ikke-fungerende invasiv adenom, blev den fremherskende form blandt disse celler afrundet med et arrangement af deres actinfilamenter i diskontinuerlige corticale ringe. (Figur 4B).
Figur 1. Celler indlejret i alginatkugler i 3 måneder. Celler udviser bi-refraktiv afrundede former under et inverteret lysmikroskop. I højre panel invasive makroadenom celler indlejret i alginat, er vist, og i venstre panel vises ikke-invasive makroadenom celler. Scale bar = 15 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Immuno-cytokemisk analyse af N-cadherin i rotte hypofyseadenom celler (GH3) kultur i alginatkugler. GH3-celler blev dyrket i alginat, fast indlejret i alginat systemet farvet for N-cadherin (rød) og kernen (blå ). Celler arrangere i en cumUlus viser N-cadherin på celle-celle grænser (A og C). Kernen (B og C) er vist med kromatin forlænget. Scale bar = 15 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. immunfarvning af nuklear antigen ki-67 dyrkede humane hypofyseadenom celler. Efter 2,5 måneder i alginatkugle kultur blev invasive ikke-fungerende adenom cellerne fikseret og derefter immunfarvet for Ki-67 (rød) og kernen (blå). Nogle adenom celler udviser positiv immunfarvning for Ki-67. Scale bar = 15 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. aktincytoskelettet arrangementer af hypofyseadenom celler befriet fra alginatkugler. Celler blev fikseret og farvet for actinfilamenter med TRITC-phalloidin. Celler fra en ikke-invasiv makroadenom blev udvidet over substratet, der viser små actin stress fibre (A). Celler fra en invasiv makroadenom viste en afrundet form med diskontinuerlige actin ringe (B). Scale bar = 15 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol har flere kritiske trin. Den første er perlestørrelse homogenitet, som er nødvendig for at opretholde de samme betingelser for diffusion af næringsstoffer og gasser i alle cellekulturen. Det er vores erfaring, anvendelse af en 21 G nål til at alginatkuglerne muliggør erhvervelsen af en effektiv kultur af ensartet perlestørrelse. Den anden vigtig faktor er afstanden fra nålen; denne afstand skal være mere end 5 cm fra calciumopløsningen at undgå deformerede perler og døde celler som følge af kollision mellem strømmen af alginat / celle opløsningen med overfladen af opløsningen af calcium. Et tredje kritisk trin er glasset omrøring ved hvilken perlerne er faldet for at forhindre dem i at klæbe til hinanden. Stikning resultater i ujævn celle indkapsling.
kan udføres nogle ændringer til denne protokol, afhængigt af forskningen spørgsmål, for eksempel i vores erfaring løsningen af natrium alginat kan blandes wed en kælder membranprotein som type IV-collagen, og ved at følge protokollen beskrevet tidligere, opnå en tredimensional alginat stillads. En anden mulighed er at gøre flydende alginat puder i brønde med en diameter på 15 mm; inde i disse geler kan celler podes over eller inde i dem. Fejlfinding ved arbejde med alginat kan være nødvendig, hvis en bestemt eksperiment brug modifikationer i deres Ca 2 + eller Mg2 + koncentrationer. Dette skyldes, at hydrogel stabilitet kan ændres. Ba 2+ -og Cu 2+ -crosslinked alginatgeler er relativt stabile i vandige opløsninger, desværre, disse kationer er ofte cytotoksiske 3.
Når man arbejder med tumorvæv, såsom hypofyseadenom væv, én begrænsning ved denne teknik er den lille vævsprøve billede. Derfor er antallet af alginatkugler fremstillet afhænger af størrelsen af vævsprøven.
Tidligere et system tilopretholde hypofyseadenom celler i en tredimensionel kultur er blevet beskrevet. Forfatterne indsendt cellerne til roterende ryster til at danne aggregater og fastholdt cellerne i denne betingelse for forskellige perioder 16. Anvendelsen af denne cellesuspension kultur kræver roterende udstyr inde dyrkningskammeret. En fordel ved protokollen beskrevet her er, at det giver mulighed for dyrkning af celler i et tredimensionalt system uden behovet for ekstra laboratorieudstyr. Cellerne indlejret i det tredimensionale alginat systemet opretholdes i en regelmæssig inkubator i en regelmæssig kolbe. En anden fordel er, at alginat stillads, i modsætning til andre tredimensionale systemer, tillader cellerne, der skal frigøres fra hydrogelen til yderligere undersøgelse 7. Endvidere et vigtigt aspekt af dyrkning af celler i alginatkugler er, at cellerne indlejret i dette system er i stand til at syntetisere de novo ekstracellulære matrix. en alternativFremgangsmåde til undersøgelse af celler indlejret i alginat er optagelse af alginatkugler efterfulgt af deres dehydrering med stigende koncentrationer af polyethylenglycol til efterfølgende sektionering og immunhistokemisk analyse 17.
Vi er interesseret i fremtiden at anvende det tredimensionale alginat perler systemet til indlejrede primær kultur normale hypofyse rotteceller for at analysere deres samspil i et tredimensionalt miljø, og også til kultur anden type hypofyseadenomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W. R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
- Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
