Cultura tridimensional em grânulos de alginato, devido à sua simplicidade e reprodutibilidade, foi escolhida para manter as células do adenoma hipofisário. Os procedimentos incluíram uma digestão enzimática inicial e dissociação mecânica do tecido tumoral, e a suspensão celular subsequente foi encapsulada em esferas de alginato.
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Artigo de método
Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um método de cultura tridimensional é descrito em que as células adenoma pituitário primário são cultivadas em drageias de alginato. O alginato é um polímero derivado de algas marinhas castanhas. Resumidamente, o tecido tumoral é cortado em pequenos pedaços e submetidas a uma digestão enzimática com colagenase e tripsina. Em seguida, uma suspensão de células é obtida. A suspensão de células tumorais é misturado com 1,2% de alginato de sódio e vertida numa solução de CaCl 2, e a suspensão de alginato / célula é gelificada em contacto com o CaCl2 para formar grânulos esféricos. As células embebidas nas drageias de alginato são fornecidos com nutrientes fornecidos pelos meios de cultura enriquecido com 20% de FBS. cultura tridimensional em drageias de alginato mantém a viabilidade das células de adenoma por longos períodos de tempo, até quatro meses. Além disso, as células podem ser libertados a partir do alginato por lavagem das pérolas com citrato de sódio e semeadas em lamelas de vidro para posteriores análises imunocitoquímicas. O uso de um celModelo L cultura permite a fixação e a visualização do citoesqueleto de actina com desorganização mínima. Em resumo, as drageias de alginato proporcionam um sistema de cultura de confiança para a manutenção de células de adenoma pituitário.
Introdução
Andaimes tridimensionais têm sido extensivamente utilizados em cultura de células porque proporcionam um suporte estrutural tridimensional de células de cultura e a manutenção de uma comunicação célula-a-célula. materiais poliméricos naturalmente derivados têm sido usados para fazer suportes tridimensionais, incluindo colagénio do tipo I, a quitosana e alginato. O alginato é um polímero natural derivado do Macrocystispyrifera de algas marinhas castanhas (alga marinha). Este polímero é composto por unidades repetidas de ácido D-manurónico β-(M) e L-α-gulurónico ácido (L) 2 e forma geles estáveis na presença de determinados catiões bi....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado para o uso de material humano pelas comissões éticas locais do estabelecimento de saúde e do Centro de Pesquisa e avançar nos estudos do Instituto Politécnico Nacional.
Aquisição Amostra 1. Tumor
- Obter a biópsia de tecido adenoma pituitário de um paciente através de um procedimento cirúrgico trans-esfenoidal 14.
- Recolha da amostra adenoma pituitário e colocá-lo em um frasco de vidro estéril contendo 50 ml de fresco 199 de meio de cultura (M199) enriquecido com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 0,6 mg / ml de bicarbonato de sódio, 2,4 mg / mL de Hepes e 1% antibióticos (penicilina /....
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Resultados
Este protocolo foi aplicado com sucesso na cultura e a manutenção de células de adenoma pituitário em drageias de alginato para diferentes períodos de tempo, A Figura 1 mostra células incorporados em drageias de alginato depois de três meses.; estas células exibem formas arredondadas bi-refracção sob um microscópio de luz invertida (Figura 1). A Figura 2 mostra a localização de N-caderina em células de adenoma pituitária de rato embebido.......
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Discussão
Este protocolo tem várias etapas críticas. A primeira é a homogeneidade do grânulo de tamanho, o que é necessário para manter as mesmas condições de difusão de nutrientes e gases em toda a cultura de células. Na nossa experiência, a utilização de uma agulha de 21 G para fazer as esferas de alginato permite a aquisição de uma cultura eficiente de tamanho uniforme do grânulo. O segundo factor importante é a distância a partir da agulha; esta distância deve ser superior a 5 cm da solução de cálcio para evitar pérolas defor.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Sr. O. Rios por sua assistência técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| 199 meio de cultura | Invitrogen | 31100-027 | Para a cultura, aqueça em um 37 &graus; C banho-maria antes de usar |
| Soro fetal bovino | PAA | A15-751 | |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hidroxietil) piperazina-N&agudo;-2ácido etanossulfônico (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicilina/Estreptomicina | PAA | P11-010 | |
| PBS (Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Colagenase tipo I | Worthington | 4176 | |
| Tripsina | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Inibidor de tripsina de Sorbean | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Ácido algínico, de Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Citrato de sódio (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piparazina-N,N′-bis(ácido 2-etanossulfônico) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polietilenoglicol 6000 (PEG 6000) | Calbioquímico | 528877 | |
| Etileno ácido glicol tetracético (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Sulfato de magnésio (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldeído | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | |
| Cloreto de amônio (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Albumina de Soro Bovino Livre de IgG | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Faloidina– Isotiocianato de tetrametilrodamina B | Sigma | P1951 | tóxico. Use luvas para manusear este reagente |
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Tóxico. Use luvas para manusear este reagente |
| Ácido sulfúrico (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Altamente corrosivo. Use luvas para manusear este reagente |
| Hidróxido de sódio (NAOH) | Merck | 1.06498 | Pode causar irritação nos olhos e na pele. Use luvas para manusear este reagente |
| (3-Aminopropil)trietoxissilano (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Bromidrato de poli-D-lisina | Sigma | P7280 | |
| Solução azul de tripano | Sigma | T8154 | |
| Nome | Company | Número do catálogo | Comentários |
| Equipamento | Tóxico: Pode causar câncer. Use luvas para manusear este reagente | ||
| Rotador | Modelo 230300 | da Boekel Scientific | |
| DuPont Corporation | Modelo sorvall TC6 | ||
| shaker | Instrumentos de linha de laboratório | Modelo 314-820 |
Referências
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
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Reimpressões e permissões
