Abstract
שיטת תרבות תלת ממדים מתוארים שבו תאי אדנומה בבלוטת יותרת מוח העיקרי מגודלי חרוזי אלגינט. אלגינט הוא פולימר נגזר אצות ים חומות. בקצרה, רקמת הגידול נחתכה לחתיכות קטנות שהוגשה לבית עיכול אנזימטי עם collagenase טריפסין. לאחר מכן, השעית תא מתקבלת. השעית התאים הסרטנית היא מעורבב עם אלגינט נתרן 1.2% וצנחה פתרון 2 CaCl, ואת השעיית אלגינט / תא בג'ל על קשר עם CaCl 2 כדי ליצור חרוזים כדוריים. התאים מוטבעים החרוזים אלגינט מסופקים עם חומרים מזינים שמספקים התקשורת והתרבות הועשר 20% FBS. תלת ממד התרבות בחרוזי אלגינט שומרת על יכולת הקיום של תאי אדנומה לתקופות זמן ארוכים, עד ארבעה חודשים. יתר על כן, התאים יכולים להיות משוחררים מן אלגינט על ידי שטיפת החרוזים עם ציטראט נתרן זרעו על coverslips זכוכית עבור ניתוחי immunocytochemical נוספת. שימוש cell מודל התרבות מאפשר קיבוע וויזואליזציה של שלד התא אקטין עם חוסר ארגון מינימלי. לסיכום, חרוזי אלגינט לספק מערכת תרבות אמינה לשמירה על תאי אדנומה בבלוטת יותרת המוח.
Introduction
פיגומים תלת ממדי נעשה שימוש נרחב ב culturing תא כי הם מספקים תמיכה מבנית תלת ממדי עבור תאים בתרבית לבין שמירה על התא אל התא תקשורת 1. באופן טבעי חומרים פולימריים נגזר שימשו לעשות תלת מימדי פיגומים כולל סוג אני קולגן, chitosan ו אלגינט. אלגינט הוא פולימר טבעי נגזר Macrocystispyrifera אצות הים החום (קלפ). פולימר זה מורכב מיחידות חוזרות של חומצה β-D-mannuronic (M) ו α-L-guluronic חומצה (G) 2 וצורות ג'לים יציבים בנוכחות קטיונים divalent מסוימים, כגון סידן בריום. פתרונות סידן כלוריד (2 CaCl) משמשים גם מגיב crosslinking ליצירת חרוזי אלגינט. פתרונות אלגינט ירדו לתוך CaCl 2 להיוצר מייד ג'לים כדורי תלת ממדי. כאשר הפתרון אלגינט הוא מעורבב עם תאים, התאים במארז לתוך b אלגינטEADS 3.
יש אלגינט נכסים אשר אפשרו לו לשמש כמטריצה אנקפסולציה של מגוון תאים, כולל chondrocytes 4, myoblasts השלד 5 ותאי גזע עצביים 6. זהו חומר אינרטי ומתיר דיפוזיה של חומרים מזינים, חמצן ומוצרי מטבולית המקיימות תא הישרדות ותפקוד; יתר על כן, בניגוד למערכות תרבות אחר מבוסס ג'ל, תאים בתרבית בתוך חרוזי אלגינט יכול גם להיות משוחררת מן הפיגום באמצעות chelators סידן, כגון נתרן ציטרט, והתאים ניתן לקצור אז עבור חקירות נוספות 7.
אדנומות יותרת המוח הם בדרך כלל גידולים שפירים עם שיעורי התפשטות נמוך. שורות תאי יותרת המוח אדנומה עכברוש היו בתרבית בהצלחת מערכת דו-ממדית 8. עם זאת, התרבות זו של גידולי תא יותרת המוח אנושיים פרשה אינה פיתוח יעיל; תאי בלוטת יותרת המוח הגידול התפזרו לגדול גרועבתרבות, תאים להפגין מצורף מוגבלת והפצה, והתאים בדרך כלל בצורת אגרגטים צפה בצלחת התרבות 9,10.
מספר ניסיונות נעשו כדי לקבל השעיה תא יותרת המוח הגידול, כולל גישה האנזימטית פיזור מכני 11, גישה פיזור מכני אך ורק 12 ואת culturing של explants הגידול 10. עם גישות אלה, מחברים שונים שהשיגו תרבויות חסידות מעשיות עבור טווחים זמן שונים. הקיבולות של תאי פרשת גידול לשרוד במערכות דו ממדים אלה תלויים בסוג הגידול ושיעורי שגשוגם 9. עם זאת, בתרבויות לטווח ארוך, תאים עם פנוטיפים פיברובלסטים שולטים 11,13. המאמר זה מתאר שיטה לקבלת תרבות עיקרית מתא אדנומה בבלוטת יותרת המוח גלום חרוז אלגינט שמשחרר אותם עוד יותר מן הפיגום אלגינט המאפשר ניתוחים מפורטים שלהיבטים של הביולוגיה של התא שלהם, למשל, הסדרי cytoskeletal שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר לשימוש חומר אנושי ידי הוועדות מקומיות האתיות של המוסד הרפואי ואת המרכז למחקר המתקדם המחקרים של המכון הפוליטכני הלאומי.
1. רכישה במדגם גידול
- השג את הביופסיה רקמות יותרת המוח אדנומה מחולה באמצעות הליך כירורגי טרנס-sphenoidal 14.
- אסוף המדגם יותרת המוח אדנומה ולמקם אותו לתוך בקבוק זכוכית סטרילית המכילה 50 מ"ל של מדיום תרבות 199 טריים (M199) מועשר 10% בסרום שור העובר (FBS), 0.6 מ"ג / סודיום ביקרבונט מ"ל, 2.4 מ"ג / מ"ל HEPES ו -1% אנטיביוטיקה (פניצילין / סטרפטומיצין) ב- pH 7.4. לשמור על המדגם בבקבוק זכוכית על קרח.
הערה: רקמת הגידול ניתן לעבד מספר שעות לאחר הניתוח. - הובלה במדגם הגידול למעבדה בבקבוק הזכוכית על קרח.
2. הכנת פתרונות דיסוציאציה רקמות אנזימתי, אתפתרון מעכב טריפסין ואת הפתרונות אלגינט
הערה: לפני תחילת ההליך תרבית תאים להכין את הפתרונות הבאים. לסנן את כל הפתרונות באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר, לפני השימוש.
- כן פתרון collagenase 1% על ידי המסת 5 מ"ג collagenase (סוג I) ב 5 מיליליטר של חינם M199-סרום.
- הכן טריפסין פתרון 0.01% על ידי המסת 0.01 גרם של טריפסין ב 10 מ"ל של 0.3% PBS-EDTA.
- כן פתרון מעכב 0.1% טריפסין על ידי המסת 2 מ"ג של מעכבי טריפסין סויה ב 20 מיליליטר של חינם M199-סרום.
- הכן פתרון DNAse ידי המסת 20 μl של DNAse אני 134 U / מ"ל ב 4 מ"ל של הפתרון מעכב טריפסין.
- הכן פתרון EGTA (1.2 M) על ידי המסת 22.8 מ"ג של EGTA ב 40 מ"ל של 155 מ"מ NaCl. התאם את ה- pH ל -7.4. המשך לנפח סופי של 50 מ"ל.
- הכן פתרון HEPES (20 מ"מ) על ידי המסת 238 HEPES מ"ג ב 50 מ"ל של 155 מ"מ NaCl.
- כן פתרון אלגינט 1.2% על ידי המסת 1.2אלגינט נתרן גרם ב 100 מ"ל של פתרון HEPES. חיטוי הפתרון אלגינט.
- כן פתרון סידן (102 מ"מ) על ידי המסת 750 מ"ג של CaCl 2 ב 50 מ"ל פתרון HEPES, כדי להתאים את pH 7.4
Encapsulation תרבות אלגינט 3. תא ראשוני
- בתוך בארון זרימה למינרית, למקם את רקמת הגידול בצלחת פטרי 35 מ"מ המכיל כ 20 מ"ל של PBS Ca 2 + ו Mg 2+ חינם, pH 7.4 (PBS *).
- קח את הרקמה עם פינצטה כירורגית ולמקם אותו עוד צלחת פטרי המכיל * PBS טרי, לשטוף בעדינות את הרקמה. חזרו על שלב זה עד כדוריות הדם האדומות ופסולת יוסרו.
- באמצעות פינצטה כירורגית, להחזיק את רקמת אדנומה בבלוטת יותרת המוח, ועם מספרי כירורגיות קטנים, לחתוך אותו לחתיכות קטנות. עם פיפטה פסטר עם קצוות מעוגלים, להעביר את שברי הרקמה ואת PBS * לתוך צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 68 XG במשך 10 דקות ב RT.
הערה: כדי לעגל את הקצוות של פסטרפיפטה, להבה קצה במקצת של פיפטה עם מבער בונזן. - הסר את PBS * בעזרת פיפטה פסטר להוסיף 3-5 מ"ל של תמיסת collagenase (כ 5 מ"ל במשך 65 מ"מ 3 של רקמות), לערבב פעמיים עד שלוש פעמים על ידי היפוך. דגירת רקמות collagenase למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס רוטציה קבועה.
- צנטריפוגה הצינור ב 68 XG במשך 10 דקות ב RT ולהסיר את collagenase עם פיפטה פסטר.
- הוסף 5 מ"ל של DNAse ומערבבים פעמיים עד שלוש פעמים על ידי היפוך, ואז צנטריפוגות את הצינור ב 68 XG במשך 10 דקות ב RT.
הערה: אם הרקמה לא ניתק לחלוטין, לבצע עיכול אנזימטי השני עם טריפסין במשך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. עצור את מערכת העיכול על ידי תוספת של 2 כרכים של פתרון מעכב טריפסין. - לשאוב supernatant עם פיפטה פסטר וזורקים. Re- להשעות גלולה ב 1 עוצמת הקול של פתרון EGTA ומערבבים עם 2 כרכים של פתרון אלגינט.
- בעדינות מערבבים את ההשעיה תא אלגינטעל ידי pipetting עם פיפטה פסטר. קח מזרק סטרילי עם מחט 21 G, להסיר את הבוכנה; להשתמש פיפטה לטעון את המזרק עם הפתרון אלגינט ותא.
- הכנס בעדינות את הבוכנה לתוך המזרק בזהירות לוותר פתרון תאי אלגינט טיפה אחר טיפה לתוך כוס זכוכית המכיל כ 30 מיליליטר של הפתרון העשיר בסידן.
- מניחים את המחט של המזרק כ 5 ס"מ עד הפתרון 2 CaCl. הג'לים ההשעיה אלגינט תאים על קשר עם CaCl 2 כדי ליצור חרוזים כדוריים. שמור את החרוזים אלגינט בפתרון סידן במשך 5 דקות.
הערה: מערבב את כוס הזכוכית שבו החרוזים מושמטים. הזז את זה לאט עם היד בתנועות מעגליות, כדי למנוע מהם להידבק זה לזה. - מוציאים בזהירות את הפתרון סידן עם פיפטה פסטר, ולשטוף את החרוזים פעמיים עם 3-5 מ"ל של M199 מועשר 20% FBS.
- מעביר את חרוזי אלגינט לתוך בתרבית רקמה T25 רגילהבקבוקון בעזרת מרית סטרילי, להוסיף 4-5 מ"ל של M199 מועשר FBS 20% וטופחו על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2. שנה את המדיום תרבות מדי יום שלישי.
4. לשחרר תאים מן אלגינט
הערה: לפני שחרור תאים מן החרוזים אלגינט, coverslips מ"מ קוטר מעיל 13 עם פולי- D- ליזין.
זהירות: גופרתי חומצה הוא מאכל מאוד חומצה, APTS יכול לגרום EYE ועור גירוי. יש להשתמש בכפפות גומי כדי בהודעות האלה חומרים כימיים.
- במנדף, עם פינצטה נקודת לטבול את coverslips בצלחת פטרי זכוכית המכילים חומצה גופרתית מימית 20% במשך שעה 1 ב RT.
- למזוג חומצה גופרתית, ולשטוף את coverslips חמש פעמים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד. באמצעות מקום פינצטה נקודת את coverslips נקי בצלחת פטרי המכילה 0.1 M NaOH במשך 5 דקות ב RT 15.
- למזוג NaOH ולשטוף פעם אחת עם לזקקמים הוביל, לשאוב את המים ולייבש את coverslips.
- השתמש micropipette כדי לצפות את coverslips עם APTS (aminopropyl-triethoxysilane) למשך 4 דקות (השתמש 500 μl עבור 6 coverslips) להציף את צלחת פטרי עם מים מזוקקים. במהירות לשאוב מים ולהמשיך לשטוף עם מים מזוקקים, הזזת coverslips עם פינצטה נקודת לאפשר למים לחדור מתחת.
- לשאוב מים ולייבש את coverslips, באמצעות מקום פינצטה נקודת את coverslips לתוך צלחת פטרי נקי לעקר אותם בתוך מיקרוגל במהלך 3 פעמים, 45 שניות כל אחד. להוסיף 1,000 μl של מים סטריליים עד 100 מיקרוגרם של פולי- D- ליזין (0.1 מ"ג / מ"ל).
- דגירה coverslips עם כ 50 μl של D- ליזין פולי במשך 5 דקות ב RT. לשאוב D- ליזין פולי לחלוטין.
הערה: זה חשוב כי מסיסי פולי- D- ליזין במדיום תרבות יכול לעכב התפשטות תאים. - שוטפים את coverslips חמש פעמים עם מים סטריליים עבור 5 דקות כל אחד. לשאוב stמי erile ולאפשר coverslips להתייבש בתוך בארון זרימה למינרית.
- כדי לנתח את cytoskeleton אקטין, לשחרר את תאי בלוטת יותרת המוח מן אלגינט. קח כמה חרוזים אלגינט מהבקבוק התרבות באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל ולהכניס אותם לתוך צינור 15 מ"ל.
- הוסף 5 מ"ל של נתרן ציטרט 55 מ"מ (לפזר 323.6 מ"ג של Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H 2 O ב 20 מ"ל HEPES פתרון) צנטריפוגות ב 68 XG במשך 10 דקות ב RT. לשאוב supernatant וזורקים.
- Re- להשעות גלולה ב 1 מ"ל של חם M199 מועשר 20% FSB; מערבבים את ההשעיה תא בעדינות עם פיפטה פסטר.
זהירות: phalloidin ו DAPI רעיל. יש להשתמש בכפפות לטפל אלה חומרים כימיים. - כדי לספור את התאים, להעביר 125 μl של פתרון כחול 0.4% Trypan לצינור 1.5 מ"ל. הוסף 75 μl של M199 ו -50 μl של השעיה התא המתקבל בשלב האחרון (גורם לדילול = 5). מערבבים היטב.
- השתמש קצה micropipette כדי Placדואר כ 10 μl של השעיה כחולות תאי Trypan בתא hemocytometer.
- ספירת תאים שכנגד hemocytometer באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם תאורת שלב ניגודיות. לספור את כל התאים בכיכר במרכז 1 מ"מ וארבעה 1 מ"מ ריבועים בפינה. השג את צפיפות התאים למיליליטר ידי הכפלת ספירת הממוצע לכל מ"ר על ידי גורם לדילול -. 10 4 לדוגמה אם ספירת הממוצע לכל מ"ר הוא 45 תאים x 5 x 104 = 2.25 x 106 תאים / מ"ל.
הערה: ספירת תאים בעשרה ריבועים של חדר hemocytometer. אל תסמוך תאי נגיעה בקו אמצעי בתחתית ובצד ימין. - זרע 35,000 תאים על 13 מ"מ קוטר זכוכית coverslips מכוסה פולי- D- ליזין.
הסדר 5. יקטינו נוגדנים
- לאחר 48 שעות בתרבות, להסיר את המדיום תרבות עם פיפטה פסטר ובמהירות להוסיף 500 μl לכל coverslip של PBS, להסיר באופן מיידי את PBS.
- תיקון ו permeabilize tהוא התאים עם 500 μl לכל coverslip של חיץ קיבעון (0.1 M צינורות, pH 6.75, 4% PEG-6000, 1 מ"מ EGTA, 1 מ"מ MgSO 4, 0.5% Triton X-100 ו -2% פורמלדהיד) במשך 10 דקות ב 37 מעלות C
- הסר את חוצץ קיבעון ולהוסיף 500 μl לכל coverslip של paraformaldehyde 3.5% ב PBS במשך 30 דקות ב RT. הסר את הפתרון paraformaldehyde.
- שטפו את coverslips שלוש פעמים על ידי הוספת 500 μl לכל coverslip של PBS במשך 5 דקות כל אחד. שוטפים את coverslips ב RT, ב תסיסה מתמדת.
- דגירה התאים עם אמוניום כלוריד 50 מ"מ במשך 10 דקות, לשאוב את הפתרון אמוניום כלוריד וחזור על שלב 5.4.
- דגירת התאים עם 1% BSA (IgG-חינם, פרוטאזות-חינם) ב PBS למשך 30 דקות, להסיר את פתרון BSA וחזור על שלב 5.4.
- דגירה התאים עם 50 מיקרומטר של phalloidin rhodamine מצומדות עבור 7 דקות ב RT, חזור על שלב 5.4.
- דגירה התאים עם 255 מיקרומטר של DAPI מדולל PBS במשך 5 דקות ב RT, חזור על שלב 5.4. לבסוף הר tהוא coverslips עם הרכבה בינונית ולאטום אותם עם לק.
- לרכוש תמונות של הסדרים cytoskeletal אקטין באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal עם מטרה 63X, באורך גל עירור 541 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה יושם בהצלחה בתרבות ותחזוקה של תאי בלוטת יותרת המוח אדנומה בחרוזים אלגינט לתקופות זמן שונות איור 1 מציג תאים מוטבע חרוזים אלגינט לאחר שלושה חודשים.; תאים אלה להציג דו-שבירת צורות מעוגלות תחת מיקרוסקופ אור הפוך (איור 1). תרשים 2 מציגים את הלוקליזציה של N-cadherin בתאים אדנומה בבלוטת יותרת מוח עכברוש המוטבע אלגינט. N-cadherin הוא מקומי על קשר תאי תאים (איור 2 א ו 2 ג) ואת הגרעין הראה הכרומטין המורחב (האיור 2B ו 2C).
תאים סרטניים בחרוזים אלגינט נשארים קיימא עבור עד 4 חודשים בתרבות; ולכן, התאים יכולים להשתחרר מן החרוזים אלגינט בזמנים שונים, המאפשר ניתוחים של היבטים שונים של ביולוגיה של התא באותה תרבית תאים. לדוגמה, מדד התפשטות התקבל עשרה שאינן פועלות אדנומות יותרת המוח האנושי באמצעות תגובתיות החיסונית Ki-67, ומדד תיוג ממוצע של 19.2 ± 1.5% (ממוצע ± SEM) הושג. איור 3 מראה יותרת המוח האנושי תרבותי תאי אדנומה immunostained עבור Ki-67.
תקטין cytoskeletons של תאים של פולשני הוכתם על פי פרוטוקול immunocytochemical לתאר לעיל. תרבות תאים הציגו צורות מוארכות עם סיבי יקטין מתח קטן (איור 4 א) .the מורפולוגיות והסדרי נימה יקטין מגוונת עם אדנומה בבלוטת יותרת המוח העצמאית של המערכה התרבות; למשל, אדנומה פולשני שאינו מתפקד, הצורה השלטת בקרב תאים אלה היתה מעוגלת עם הסדר של סיבי אקטין שלהם בטבעות קליפת המוח רציפה. (איור 4B).
FO: keep-together.within-page = "1"> 
תאי איור 1. מוטבע חרוזי אלגינט במשך 3 חודשים. תאים להציג צורות מעוגלות דו-שבירה תחת מיקרוסקופ אור הפוך. בתאי macroadenoma פולשנית תקין הפנל המוטבע אלגינט נראים לעין, ובחלונית עזבה את תאי macroadenoma פולשני מוצגים. בר סולם = 15 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ניתוח-cytochemical חיסונית של N-cadherin בתאים אדנומה בבלוטת יותרת המוח עכברוש (GH3) תרבות בחרוזים אלגינט. תאים GH3 היו בתרבית אלגינט, קבוע מוטבע במערכת אלגינט מוכתם עבור-cadherin N (אדום) ואת גרעין (כחול ). תאים הוא לארגן בתוך בהצטיינותUlus מראה N-cadherin בגבולות תאים תאים (A ו- C). הגרעין (B ו- C) מוצג עם הכרומטין מורחב. בר סולם = 15 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Immunostaining של תאים אדנומה בבלוטת יותרת המוח האנושי תרבותי קי-67 אנטיגן גרעיני. אחרי 2.5 חודשים בתרבות חרוז אלגינט, תאים שאינם מתפקדים אדנומה פולשנית קובעו אז immunostained עבור Ki-67 (אדום) ואת גרעין (כחול). כמה תאים אדנומה להראות immunostaining חיובי עבור Ki-67. בר סולם = 15 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הסדרי cytoskeleton יקטין של תאי אדנומה בבלוטת יותרת המוח משוחררים חרוזי אלגינט. תאים קובעו ונצבעו עבור תקטין חוטים עם TRITC-phalloidin. תאים מתוך macroadenoma פולשני הוארכו מעל המצע, מראה סיבי אקטין מתח קטן (א). תאים מתוך macroadenoma פולשני הראו צורה מעוגלת עם טבעות יקטינו רציפה (B). בר סולם = 15 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה יש כמה שלבים קריטיים. הראשונה היא ההומוגניות גודל חרוז, אשר נדרש כדי לשמור על אותם תנאים של דיפוזיה של חומרים מזינים וגזים בכל תרבית תאים. מניסיוננו, שימוש במחט G 21 לעשות את החרוזים אלגינט מאפשר לרכישת תרבות יעילה של גודל חרוז אחיד. הגורם החשוב השני הוא המרחק בין המחט; המרחק זה חייב להיות לא יותר מ 5 סנטימטרים מהפתרון סידן להימנע פנינים מעוותות תאים מתים בשל ההתנגשות של הנחל של פתרון אלגינט / תא עם פני שטח של פתרון סידן. שלב קריטי שלישי הוא ערבוב הזכוכית שבו החרוזים מושמטים כדי למנוע מהם להידבק זה לזה. דבקות תוצאות אנקפסולציה תא האחידה.
כמה שינויים בפרוטוקול זה יכול להתבצע בהתאם של שאלת המחקר, למשל, הניסיון שלנו הפתרון של אלגינט נתרן ניתן לערבב wה- i חלבון קרום במרתף כמו קולגן מסוג IV, ובעקבות פרוטוקול שתואר לעיל, להשיג פיגום אלגינט תלת ממדי. אפשרות נוספת היא להפוך צף כריות אלגינט בבארות בקוטר 15 מ"מ; בתוך ג 'ל אלו, ניתן זורעים תאים מעל או בתוכם. פתרון בעיות כאשר עובדים עם אלגינט יכולה להיות הכרחית אם כל ניסוי מסוים צריך שינויי Ca 2 + או Mg 2 + הריכוזים שלהם. הסיבה לכך היא יציבות הידרוג'ל ניתן לשנות. Ba 2 + -ואז Cu 2+ -crosslinked ג'לים אלגינט יציבים יחסית בתמיסות מימיות, למרבה הצער, קטיונים אלו הן בדרך כלל ציטוטוקסיות 3.
כשעובדים עם רקמות הגידול כגון רקמות אדנומה בבלוטת יותרת המוח, מגבלה אחת של טכניקה זו היא דגימת רקמה קטנה מסופק. לכן, מספר חרוזים אלגינט המתקבל תלוי בגודל של דגימת רקמה.
בעבר, מערכתלשמור על תאי אדנומה יותרת תרבות תלת ממדי תוארה. המחברים הגיש את התאים gyratory רועד ליצור אגרגטים ומתוחזק התאים במצב זה לתקופות שונות 16. שימוש תרבות השעית תא זה דורש ציוד gyratory בתוך חדר התרבות. אחד יתרונות של הפרוטוקול המתואר כאן הוא שהיא מאפשר עבור culturing של תאים במערכת תלת ממדי ללא צורך בציוד מעבדה נוסף. התאים מוטבעים במערכת אלגינט תלת ממדים נשמרים באינקובטור קבוע בתוך בקבוק רגיל. יתרון נוסף הוא כי פיגום אלגינט, בניגוד מערכות תלת ממדיות אחרות, מאפשר לתאים להיות משוחררים מן הידרוג'ל לחקירה נוסף 7. יתר על כן, היבט חשוב של culturing התאים חרוזים אלגינט הוא שתאי מוטבע במערכת זו מסוגלים synthetize דה נובו תאי מטריקס. חלופהשיטה לחקר תאי מוטבע אלגינט היא הקיבוע של חרוזי אלגינט ואחריו ההתייבשות שלהם עם הריכוז גדל והולך של פוליאתילן גליקול עבור חתך עתידי החיסונית-histochemical מנתח 17.
אנחנו מעוניינים בעתיד ליישם את מערכת חרוזים תלת ממדי אלגינט לתאי עכברוש יותרת המוח נורמלים תרבות עיקרית מוטבעים על מנת לנתח האינטראקציות שלהם בסביבה תלת ממדים, וגם סוג התרבות אחר של אדנומות יותרת המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W. R.
- Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
- Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
