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Medicine

मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं के तीन आयामी Alginate मनका संस्कृति

Published: February 18, 2016 doi: 10.3791/53637
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN), 2Department of Experimental Pathology, Nacional Institute of Neurology and Neurosurgery

Abstract

एक तीन आयामी संस्कृति विधि का वर्णन किया गया है, जिसमें प्राथमिक पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं alginate मोती में बड़े हो रहे हैं। Alginate एक बहुलक भूरे शैवाल समुद्र से प्राप्त होता है। संक्षेप में, ट्यूमर के ऊतक छोटे टुकड़ों में काट और collagenase और trypsin के साथ एक enzymatic पाचन के लिए प्रस्तुत है। अगले, एक सेल निलंबन प्राप्त की है। ट्यूमर सेल निलंबन 1.2% सोडियम alginate के साथ मिलाया जाता है और एक 2 CaCl समाधान में गिरा दिया, और alginate / सेल निलंबन गोलाकार मोतियों के लिए फार्म 2 CaCl के साथ संपर्क पर gelled है। alginate मोती में एम्बेडेड कोशिकाओं 20% FBS के साथ समृद्ध संस्कृति मीडिया द्वारा प्रदान की पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति की जाती है। alginate मोती में तीन आयामी संस्कृति चार महीने तक, समय की लंबी अवधि के लिए ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं की व्यवहार्यता बनाए रखता है। इसके अलावा, कोशिकाओं सोडियम साइट्रेट के साथ मोती धोने से alginate से मुक्त कराया और आगे immunocytochemical विश्लेषण के लिए कांच coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। एक सेल का उपयोगएल संस्कृति मॉडल निर्धारण और कम से कम विप्लव के साथ actin cytoskeleton के दृश्य के लिए अनुमति देता है। सारांश में, alginate मोती पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं के रखरखाव के लिए एक विश्वसनीय संस्कृति प्रणाली प्रदान करते हैं।

Introduction

तीन आयामी scaffolds बड़े पैमाने पर सेल संवर्धन में इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि वे संवर्धित कोशिकाओं के लिए एक तीन आयामी संरचनात्मक समर्थन और सेल करने वाली कोशिका संचार 1 के रखरखाव प्रदान करते हैं। स्वाभाविक रूप से प्राप्त बहुलक सामग्री प्रकार मैं कोलेजन, chitosan और alginate सहित तीन आयामी scaffolds बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Alginate एक प्राकृतिक बहुलक भूरे शैवाल समुद्र Macrocystispyrifera (सिवार) से ली गई है। इस बहुलक β-D-mannuronic एसिड (एम) और α एल guluronic एसिड (G) जैसे कैल्शियम और बेरियम के रूप में कुछ द्विसंयोजक फैटायनों, की उपस्थिति में 2 और रूपों स्थिर जैल के दोहराया इकाइयों से बना है। कैल्शियम क्लोराइड (2 CaCl) समाधान आमतौर पर alginate मोतियों के लिए फार्म crosslinking अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। Alginate समाधान 2 CaCl में गिरा तुरंत तीन आयामी गोलाकार जैल के रूप में। alginate समाधान कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है, कोशिकाओं alginate ख में समझाया जाता हैईएडीएस 3।

Alginate गुण है कि यह सक्षम है chondrocytes 4, 5 और कंकाल myoblasts तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं 6 सहित कोशिकाओं की एक किस्म के encapsulation के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में इस्तेमाल किया जाना है। यह एक निष्क्रिय सामग्री है और पोषक तत्वों, ऑक्सीजन और चयापचय उत्पादों है कि सेल अस्तित्व और समारोह को बनाए रखने के प्रसार के लिए परमिट; इसके अलावा, अन्य जेल आधारित संस्कृति प्रणालियों के विपरीत, alginate मोती भीतर संवर्धित कोशिकाओं भी पाड़ से जैसे सोडियम साइट्रेट के रूप में कैल्शियम chelators, का उपयोग कर मुक्त हो सकता है, और कोशिकाओं को फिर आगे की जांच के लिए 7 काटा जा सकता है।

पिट्यूटरी adenomas आम तौर पर कम प्रसार दर के साथ सौम्य ट्यूमर है। चूहा पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद सेल लाइनों एक दो आयामी प्रणाली 8 में सफलतापूर्वक संवर्धित किया गया है। हालांकि, स्रावी मानव पिट्यूटरी सेल ट्यूमर की इस संस्कृति के विकास के लिए एक कुशल नहीं है; छितरी ट्यूमर कोशिकाओं को खराब बढ़ने पिट्यूटरीसंस्कृति में, कोशिकाओं सीमित लगाव और प्रसार प्रदर्शन, और कोशिकाओं को आमतौर पर संस्कृति पकवान 9,10 में तैर समुच्चय के रूप में।

कई प्रयासों के एक ट्यूमर पिट्यूटरी सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए बनाया गया है, एक enzymatic और यांत्रिक फैलाव दृष्टिकोण 11, एक पूरी तरह से यांत्रिक फैलाव दृष्टिकोण 12 और ट्यूमर explants 10 के संवर्धन सहित। इन तरीकों के साथ, अलग-अलग लेखकों समय के विभिन्न अवधियों के लिए व्यवहार्य पक्षपाती संस्कृतियों प्राप्त किया है। ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता स्रावी इन दो आयामी प्रणालियों में जीवित रहने के लिए ट्यूमर के प्रकार और उनके प्रसार दरों 9 पर निर्भर करते हैं। हालांकि, लंबी अवधि संस्कृतियों में, fibroblast phenotypes के साथ कोशिकाओं 11,13 प्रबल होना। इस पत्र पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं alginate मोती में समझाया है कि आगे alginate पाड़ इस बात का विस्तृत विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता से उन्हें मुक्त से एक प्राथमिक संस्कृति प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णनउनकी कोशिका जीव विज्ञान, जैसे, उनकी cytoskeletal व्यवस्था के पहलुओं।

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Protocol

इस अध्ययन चिकित्सा संस्थान और राष्ट्रीय पॉलिटेक्निक संस्थान के अनुसंधान और एडवांस स्टडीज सेंटर के स्थानीय नैतिक समितियों द्वारा मानव सामग्री के उपयोग के लिए मंजूरी दे दी थी।

1. ट्यूमर नमूना अधिग्रहण

  1. एक पार जतूक शल्य प्रक्रिया 14 के माध्यम से एक मरीज ​​से पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद ऊतक बायोप्सी प्राप्त करते हैं।
  2. पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद नमूना ले लीजिए और ताजा संस्कृति के माध्यम से 199 (M199) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ समृद्ध, 0.6 मिलीग्राम / एमएल सोडियम बाइकार्बोनेट, 2.4 मिलीग्राम / एमएल HEPES और 1% की 50 मिलीग्राम से युक्त एक बाँझ कांच की बोतल में जगह एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) 7.4 पीएच पर। बर्फ पर एक कांच की बोतल में नमूना बनाए रखें।
    नोट: ट्यूमर के ऊतक सर्जरी के बाद कई मानव संसाधन कार्रवाई की जा सकती।
  3. बर्फ पर कांच की बोतल में प्रयोगशाला में ट्यूमर नमूना परिवहन।

2. एंजाइमी ऊतक हदबंदी समाधान की तैयारी,Trypsin अवरोध समाधान और Alginate समाधान

नोट: सेल संस्कृति प्रक्रिया से पहले निम्न समाधानों को तैयार। एक 0.22 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर का उपयोग कर सभी समाधान, उपयोग करने से पहले फ़िल्टर।

  1. M199-सीरम मुक्त के 5 मिलीलीटर में collagenase (प्रकार मैं) के 5 मिलीग्राम भंग द्वारा कोलैजिनेज़ 1% समाधान तैयार है।
  2. पीबीएस EDTA के 0.3% के 10 मिलीलीटर में trypsin के 0.01 ग्राम भंग करके 0.01% समाधान trypsin तैयार करें।
  3. M199-सीरम मुक्त के 20 मिलीलीटर में सोया trypsin अवरोध करनेवाला के 2 मिलीग्राम भंग द्वारा 0.1% trypsin अवरोध समाधान तैयार है।
  4. trypsin अवरोध समाधान के 4 मिलीलीटर में DNase मैं 134 यू / एमएल के 20 μl भंग द्वारा DNase समाधान तैयार है।
  5. 155 मिमी NaCl के 40 एमएल में EGTA के 22.8 मिलीग्राम भंग द्वारा EGTA समाधान (1.2 मीटर) तैयार करें। 7.4 पीएच को समायोजित करें। 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए आगे बढ़ें।
  6. 155 मिमी NaCl के 50 मिलीलीटर में 238 मिलीग्राम HEPES भंग द्वारा HEPES समाधान (20 मिमी) तैयार करें।
  7. 1.2 भंग द्वारा 1.2% alginate समाधान तैयारHEPES समाधान के 100 मिलीलीटर में ग्राम सोडियम alginate। alginate समाधान आटोक्लेव।
  8. 50 मिलीलीटर HEPES समाधान में 2 CaCl के 750 मिलीग्राम कैल्शियम भंग द्वारा समाधान (102 मिमी) तैयार करने के लिए 7.4 पीएच को समायोजित

3. प्राथमिक सेल संस्कृति और Alginate एन्कैप्सुलेशन

  1. एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट के अंदर, लगभग 20 मिलीलीटर पीबीएस सीए 2 और 2 मिलीग्राम + मुक्त, 7.4 पीएच (पीबीएस *) की युक्त एक 35 मिमी पेट्री डिश में ट्यूमर के ऊतक जगह है।
  2. एक शल्य चिमटी से नोचना साथ ऊतक ले लो और युक्त ताजा पीबीएस * एक और पेट्री डिश में जगह है, धीरे ऊतक धो लें। इस चरण को दोहराएँ जब तक लाल रक्त कोशिकाओं और मलबे को हटा रहे हैं।
  3. एक शल्य चिमटी से नोचना का उपयोग करना, पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद ऊतक पकड़ है, और एक छोटी सी शल्य कैंची के साथ, छोटे टुकड़ों में काट दिया। गोल किनारों के साथ एक पाश्चर विंदुक के साथ, ऊतक टुकड़े और पीबीएस * एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में, अपकेंद्रित्र 68 XG पर 10 मिनट के लिए आरटी पर स्थानांतरण।
    नोट: एक पाश्चर के किनारों दौरपिपेट, थोड़ा एक लेम्प बर्नर में पिपेट की नोक लौ।
  4. पीबीएस * निकालें एक पाश्चर विंदुक का उपयोग और collagenase समाधान के 3-5 मिलीलीटर जोड़ने (लगभग 65 मिमी ऊतक के 3 के लिए 5 मिलीलीटर), inverting द्वारा दो से तीन बार मिला लें। निरंतर रोटेशन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए collagenase में ऊतक सेते हैं।
  5. आरटी पर 10 मिनट के लिए 68 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और एक पाश्चर विंदुक के साथ कोलैजिनेज़ को हटा दें।
  6. DNase के 5 मिलीलीटर जोड़ें और inverting द्वारा दो से तीन बार मिश्रण है, तो आरटी पर 10 मिनट के लिए 68 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    नोट: ऊतक पूरी तरह से अलग नहीं है, तो 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए trypsin के साथ एक दूसरे enzymatic पाचन प्रदर्शन करते हैं। trypsin अवरोध समाधान के 2 संस्करणों के अलावा द्वारा पाचन बंद करो।
  7. पाश्चर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला Aspirate और त्यागें। EGTA समाधान के 1 मात्रा में गोली पुनः निलंबित और alginate समाधान के 2 संस्करणों के साथ मिश्रण।
  8. धीरे सेल निलंबन और alginate मिश्रणपाश्चर विंदुक के साथ pipetting द्वारा। एक 21 जी सुई के साथ एक बाँझ सिरिंज ले लो, सवार हटा; alginate और सेल समाधान के साथ सिरिंज लोड करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  9. धीरे सिरिंज में सवार डालने और ध्यान से alginate-सेल समाधान ड्रॉप द्वारा ड्रॉप एक गिलास कैल्शियम युक्त समाधान के लगभग 30 मिलीलीटर युक्त बीकर में बांटना।
  10. सिरिंज की सुई लगभग 5 सेमी तक 2 CaCl समाधान के लिए रखें। 2 CaCl के साथ संपर्क पर alginate सेल निलंबन जैल गोलाकार मोती के रूप में। 5 मिनट के लिए कैल्शियम समाधान में alginate मोती रखें।
    नोट: कांच बीकर, जिसमें मोती गिरा रहे हैं हिलाओ। यह धीरे धीरे कदम परिपत्र गति में हाथ के साथ, उन्हें एक दूसरे से चिपके से रोकने के लिए।
  11. ध्यान से एक पाश्चर विंदुक के साथ कैल्शियम समाधान निकालें, और M199 के 3-5 मिलीलीटर FBS के 20% के साथ समृद्ध मोती के साथ दो बार धो लें।
  12. एक नियमित रूप से T25 टिशू कल्चर में alginate मोती स्थानांतरणएक बाँझ रंग का उपयोग कर फ्लास्क 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में जोड़ने के 37 डिग्री सेल्सियस पर M199 के 4-5 मिलीलीटर 20% FBS के साथ समृद्ध और incubated। हर तीसरे दिन संस्कृति के माध्यम से बदलें।

4. Alginate से कोशिकाओं आजाद

नोट: पहले alginate मोतियों से कोशिकाओं के चंगुल से मुक्त करने के लिए, पाली डी lysine के साथ कोट 13 मिमी व्यास coverslips।

चेतावनी: सल्फ्यूरिक एसिड एक उच्च संक्षारक एसिड है, और APTS आंख और त्वचा में जलन पैदा कर सकता है। लेटेक्स दस्ताने का उपयोग इन अभिकर्मकों संभालने के लिए।

  1. एक धूआं हुड में, एक बिंदु चिमटी से नोचना के साथ एक गिलास पेट्री आरटी पर 1 घंटे के लिए 20% जलीय सल्फ्यूरिक एसिड युक्त डिश में coverslips विसर्जित कर दिया।
  2. सल्फ्यूरिक एसिड छानना, और coverslips 5 मिनट प्रत्येक के लिए आसुत जल के साथ पांच बार धो लें। एक बिंदु चिमटी से नोचना जगह आर टी 15 पर 5 मिनट के लिए 0.1 एम NaOH युक्त एक पेट्री डिश में साफ coverslips का उपयोग करना।
  3. NaOH छानना और चुलाना के साथ एक बार धोनेएलईडी पानी, पानी निकालना और coverslips सूखी।
  4. 4 मिनट के लिए APTS (aminopropyl-triethoxysilane) के साथ coverslips कोट करने के लिए एक micropipette का उपयोग करें (6 coverslips के लिए 500 μl का उपयोग करें) आसुत जल के साथ पेट्री डिश में बाढ़। जल्दी से पानी निकालना और आसुत जल से धोने के लिए, पानी के नीचे घुसना करने के लिए अनुमति देने के लिए बिंदु चिमटी के साथ coverslips चलती जारी है।
  5. पानी Aspirate और coverslips सूखी, एक साफ पेट्री डिश में एक बिंदु चिमटी से नोचना जगह coverslips का उपयोग और 3 बार, 45 सेकंड प्रत्येक दौरान माइक्रोवेव के अंदर उन्हें बाँझ। पाली-D-लाइसिन की 100 माइक्रोग्राम (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के लिए बाँझ पानी के 1,000 μl जोड़ें।
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए पाली डी lysine के लगभग 50 μl के साथ coverslips सेते हैं। पाली डी lysine पूरी तरह से aspirate।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है क्योंकि घुलनशील संस्कृति के माध्यम में पाली-D-लाइसिन सेल प्रसार को बाधित कर सकते हैं।
  7. 5 मिनट प्रत्येक के लिए coverslips बाँझ पानी के साथ पांच बार कुल्ला। सेंट aspirateerile पानी और अनुमति coverslips एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट के अंदर करने के लिए सूखी।
  8. actin cytoskeleton का विश्लेषण करने के लिए, alginate से पिट्यूटरी कोशिकाओं को आजाद कराने। 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग संस्कृति कुप्पी से alginate मोतियों से कुछ लेने के लिए और उन्हें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह है।
  9. 55 मिमी सोडियम साइट्रेट के 5 मिलीलीटर जोड़ें आरटी पर 10 मिनट के लिए 68 XG पर और सेंट्रीफ्यूज (ना 3 सी 6 एच 5 हे 7 की ३२३.६ एमजी, 2 एच 2 20 में हे मिलीलीटर HEPES समाधान भंग)। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और त्यागें।
  10. गर्म M199 के 1 मिलीलीटर 20% एफएसबी के साथ समृद्ध में गोली पुनः निलंबित; धीरे एक पाश्चर विंदुक के साथ सेल निलंबन मिश्रण।
    चेतावनी: Phalloidin और DAPI विषाक्त कर रहे हैं। दस्ताने का उपयोग इन अभिकर्मकों संभालने के लिए।
  11. , कोशिकाओं की गिनती एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को 0.4% Trypan नीले समाधान के 125 μl हस्तांतरण करने के लिए। M199 के 75 μl और अंतिम चरण (कमजोर पड़ने कारक = 5) में प्राप्त सेल निलंबन के 50 μl जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण।
  12. plac करने के लिए एक micropipette टिप का उपयोग करेंई लगभग 10 hemocytometer कक्ष में Trypan नीले-सेल निलंबन के μl।
  13. चरण विपरीत रोशनी के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग hemocytometer काउंटर में कोशिकाओं की गणना। 1 मिमी केंद्र वर्ग और चार चौकों 1 मिमी कोने में सभी कोशिकाओं की गणना। कमजोर पड़ने कारक द्वारा वर्ग के प्रति औसत गिनती गुणा करके मिली लीटर प्रति सेल घनत्व प्राप्त -। 10 4 उदाहरण के लिए यदि वर्ग के प्रति औसत मायने रखता है 45 कोशिकाओं एक्स 5 एक्स 104 = 2.25 x 106 कोशिकाओं / एमएल है।
    नोट: hemocytometer चैम्बर के दस चौकों में कोशिकाओं की गणना। नीचे और दाएँ पक्ष पर मध्य रेखा को छू कोशिकाओं की गिनती नहीं है।
  14. बीज 13 मिमी व्यास गिलास पाली-D-लाइसिन के साथ कवर coverslips पर 35,000 कोशिकाओं।

5. actin cytoskeleton व्यवस्था

  1. संस्कृति में 48 घंटे के बाद, एक पाश्चर विंदुक के साथ संस्कृति के माध्यम से हटाने के लिए और जल्दी से पीबीएस के coverslip प्रति 500 ​​μl जोड़ने के लिए, तुरंत पीबीएस को हटा दें।
  2. फिक्स और permeabilize टीवह 37 डिग्री पर 10 मिनट के लिए निर्धारण बफर (0.1 एम पाइप, पीएच 6.75, 4% खूंटी-6000, 1 मिमी EGTA, 1 मिमी MgSO 4, 0.5% ट्राइटन X-100 और 2% formaldehyde) की coverslip प्रति 500 μl के साथ कोशिकाओं सी
  3. नियतन बफर निकालें और आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 3.5% paraformaldehyde के coverslip प्रति 500 ​​μl जोड़ें। paraformaldehyde समाधान निकालें।
  4. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के coverslip प्रति 500 ​​μl जोड़कर coverslips तीन बार धोएं। आरटी पर coverslips कुल्ला, लगातार आंदोलन में।
  5. 10 मिनट के लिए 50 मिमी अमोनियम क्लोराइड के साथ कोशिकाओं को सेते अमोनियम क्लोराइड समाधान निकालना और कदम 5.4 दोहराएँ।
  6. 30 मिनट के लिए पीबीएस में 1% बीएसए (आईजीजी मुक्त, proteases मुक्त) के साथ कोशिकाओं को सेते बीएसए समाधान निकालने और कदम 5.4 दोहराएँ।
  7. आरटी पर 7 मिनट, दोहराने कदम 5.4 के लिए rhodamine संयुग्मित phalloidin के 50 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  8. आरटी पर 5 मिनट, दोहराने कदम 5.4 के लिए पीबीएस में पतला DAPI की 255 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। अंत में टी माउंटवह एक बढ़ते मध्यम के साथ coverslips और उन्हें नेल पॉलिश के साथ सील।
  9. एक 63X उद्देश्य के साथ एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग actin cytoskeletal व्यवस्था की छवियों, 541 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में मोल।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल संस्कृति और समय के विभिन्न अवधियों के लिए alginate मोती में ग्रंथ्यर्बुद पिट्यूटरी कोशिकाओं के रखरखाव में सफलतापूर्वक लागू किया गया है तीन महीने के बाद alginate मोती में एम्बेडेड कोशिकाओं चित्रा 1 से पता चलता है। इन कोशिकाओं को एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के तहत द्वि-अपवर्तनांक गोल आकार दिखा रहे हैं। चित्रा 2 चूहे पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद alginate में एम्बेडेड कोशिकाओं में एन cadherin के स्थानीयकरण से पता चलता है। एन cadherin सेल सेल संपर्कों (2A चित्रा और 2 सी) में स्थानीय है और नाभिक क्रोमेटिन बढ़ाया (चित्रा 2 बी और 2 सी) से पता चला।

alginate मोती में ट्यूमर कोशिकाओं संस्कृति में अप करने के लिए 4 महीने के लिए व्यवहार्य रहते हैं; इसलिए, कोशिकाओं को अलग अलग समय पर alginate मोती, जो के विभिन्न पहलुओं के विश्लेषण के लिए अनुमति देता से मुक्त हो सकते हैंएक ही सेल संस्कृति में कोशिका जीव विज्ञान। उदाहरण के लिए, प्रसार सूचकांक से प्राप्त हुई थी दस गैर कामकाज की-67 के लिए प्रतिरक्षा-जेट, और 19.2 ± 1.5% की एक मतलब लेबलिंग सूचकांक का उपयोग कर मानव पिट्यूटरी adenomas (SEM ± मतलब है) प्राप्त हुई थी। चित्रा 3 सुसंस्कृत मानव पिट्यूटरी चलता ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं की-67 के लिए immunostained।

एक गैर इनवेसिव की कोशिकाओं के actin cytoskeletons immunocytochemical प्रोटोकॉल के अनुसार दाग थे ऊपर का वर्णन है। संस्कृति कोशिकाओं छोटे actin तनाव फाइबर (चित्रा -4 ए) व्याप्ति morphologies और actin रेशा व्यवस्था पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद संस्कृति प्रणाली की स्वतंत्र के साथ अलग-अलग आकार के साथ लम्बी प्रदर्शन किया; उदाहरण के लिए, एक गैर कामकाज आक्रामक ग्रंथ्यर्बुद में, इन कोशिकाओं के बीच प्रमुख आकार असंतत cortical छल्ले में उनकी एक्टिन तंतु की एक व्यवस्था के साथ गोल था। (चित्रा 4 बी)।


चित्रा 1। प्रकोष्ठों 3 महीने के लिए alginate मोती में एम्बेडेड कोशिकाओं एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत द्वि-अपवर्तनांक गोल आकार दिखा रहे हैं। सही पैनल आक्रामक macroadenoma alginate में एम्बेडेड कोशिकाओं में दिखाए जाते हैं, और बाएं पैनल में गैर इनवेसिव macroadenoma कोशिकाओं दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 15 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Alginate मोती में (GH3) चूहा पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं में एन cadherin संस्कृति की चित्रा 2. इम्यूनो-cytochemical विश्लेषण। GH3 कोशिकाओं alginate में सुसंस्कृत थे, तय alginate प्रणाली के लिए एन cadherin (लाल) दाग में एम्बेडेड और नाभिक (नीला )। प्रकोष्ठों एक सह में व्यवस्था कर रहे हैंULUS सेल सेल सीमाओं (ए और सी) में एन cadherin दिखा। नाभिक (बी और सी) क्रोमेटिन बढ़ाया के साथ दिखाया गया है। स्केल बार = 15 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. परमाणु प्रतिजन Ki-67 सुसंस्कृत मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं के Immunostaining। Alginate मनका संस्कृति में 2.5 महीनों के बाद, आक्रामक गैर कामकाज ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं तय किया गया और उसके बाद की-67 (लाल) और नाभिक (नीला) के लिए immunostained। कुछ ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं की-67 के लिए सकारात्मक immunostaining दिखा। स्केल बार = 15 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<पी वर्ग = "jove_content" fo: रख-together.within-पेज = "1"> चित्रा 4
चित्रा 4. alginate मोतियों से मुक्त कराया पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं के actin cytoskeleton व्यवस्था। प्रकोष्ठों तय की और TRITC-phalloidin साथ तंतु actin के लिए दाग रहे थे। एक गैर इनवेसिव macroadenoma से कोशिकाओं, सब्सट्रेट पर बढ़ाया गया छोटे actin तनाव फाइबर (ए) दिखा। एक आक्रामक macroadenoma से कोशिकाओं असंतत actin के छल्ले (बी) के साथ एक गोल आकार दिखाया। स्केल बार = 15 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण कदम है। पहले मनका आकार एकरूपता है, जो सेल संस्कृति के सभी में पोषक तत्वों और गैसों के प्रसार का एक ही स्थिति बनाए रखने के लिए आवश्यक है। हमारे अनुभव में, एक 21 जी सुई का उपयोग alginate मोती बनाने के लिए वर्दी मनका आकार के एक कुशल संस्कृति के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है। दूसरा महत्वपूर्ण पहलू सुई से दूरी है; इस दूरी को कोई अधिक कैल्शियम समाधान से 5 सेमी विकृत मोती और मृत कोशिकाओं को कैल्शियम समाधान की सतह के साथ alginate / सेल समाधान की धारा के टकराव के कारण से बचने के लिए की तुलना में होना चाहिए। एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम गिलास सरगर्मी जिसमें मोती उन्हें एक दूसरे से चिपके से रोकने के लिए गिरा दिया जाता है। असमान सेल encapsulation में परिणाम चिपके हुए।

इस प्रोटोकॉल को कुछ संशोधनों के अनुसंधान प्रश्न के आधार पर, उदाहरण के लिए, हमारे अनुभव में सोडियम alginate का समाधान डब्ल्यू मिलाया जा सकता है किया जा सकता हैजैसे प्रकार चतुर्थ कोलेजन एक तहखाने झिल्ली प्रोटीन, और प्रोटोकॉल पहले से वर्णित निम्नलिखित ith, एक तीन आयामी alginate पाड़ प्राप्त करते हैं। एक और संभावना अस्थायी 15 मिमी व्यास कुओं में alginate कुशन बनाने के लिए है; इन जैल अंदर, कोशिकाओं के ऊपर या उन्हें अंदर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। किसी भी विशेष रूप से प्रयोग उनकी सीए 2 या 2 मिलीग्राम + सांद्रता में संशोधनों की जरूरत है, तो समस्या निवारण जब alginate के साथ काम करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इसका कारण यह है हाइड्रोजेल स्थिरता बदला जा सकता है। बा 2 + 2 + -और घन -crosslinked alginate जैल जलीय समाधान में अपेक्षाकृत स्थिर रहे हैं, दुर्भाग्य से, इन फैटायनों अक्सर होते हैं साइटोटोक्सिक 3।

जब इस तरह के पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद ऊतकों के रूप में ट्यूमर के ऊतकों के साथ काम कर रहा है, इस तकनीक की एक सीमा छोटे ऊतक प्रदान की नमूना है। इसलिए, प्राप्त alginate मोतियों की संख्या ऊतक नमूने का आकार निर्भर करता है।

इससे पहले, एक करने के लिए प्रणालीएक तीन आयामी संस्कृति में पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं को बनाए रखने में वर्णित किया गया है। लेखकों विभिन्न अवधियों के लिए 16 इस हालत में gyratory समुच्चय के रूप में करने के लिए झटकों के लिए कोशिकाओं प्रस्तुत की और कोशिकाओं को बनाए रखा। इस सेल निलंबन संस्कृति के उपयोग के संस्कृति कक्ष के अंदर gyratory उपकरणों की आवश्यकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक फायदा यह है कि यह अतिरिक्त प्रयोगशाला के उपकरण की आवश्यकता के बिना एक तीन आयामी प्रणाली में कोशिकाओं के संवर्धन के लिए अनुमति देता है। तीन आयामी alginate प्रणाली में एम्बेडेड कोशिकाओं को एक नियमित कुप्पी के अंदर एक नियमित इनक्यूबेटर में रखा जाता है। एक और लाभ यह alginate पाड़, अन्य तीन आयामी सिस्टम के साथ इसके विपरीत, परमिट है कि कोशिकाओं को आगे की जांच के लिए 7 हाइड्रोजेल से मुक्त कराया जा रहा है। इसके अलावा, alginate मोती में संवर्धन कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि कोशिकाओं को इस प्रणाली में एम्बेडेड नए सिरे से बाह्य मैट्रिक्स synthetize करने में सक्षम हैं। एक विकल्पalginate में एम्बेडेड कोशिकाओं के अध्ययन के लिए विधि बाद सेक्शनिंग और इम्यूनो-histochemical का विश्लेषण करती है 17 के लिए पॉलीथीन ग्लाइकोल की सांद्रता में वृद्धि के साथ उनके निर्जलीकरण के द्वारा पीछा alginate मोतियों की नियतन है।

हम यह भी पिट्यूटरी adenomas की संस्कृति अन्य प्रकार के लिए भविष्य में रुचि क्रम में एम्बेडेड प्राथमिक संस्कृति सामान्य पिट्यूटरी चूहे की कोशिकाओं के लिए तीन आयामी alginate मोती प्रणाली लागू करने के लिए एक तीन आयामी वातावरण में उनकी बातचीत का विश्लेषण करने के लिए, और कर रहे हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent 
199 culture medium  Invitrogen  31100-027 For culture, warm in a 37 °C water bath before use 
Fetal bovine serum  PAA A15-751
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 106329
N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma  H-4034
Penicillin/Streptomycin PAA P11-010
PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Invitrogen  21600-044
Collagenase type I Worthington 4176
Trypsin  Invitrogen  27250-018
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Research Organics 3002E
Sorbean trypsin inhibitor  Invitrogen  17075-029
DNAse Worthington 2139
Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) Sigma  A-2158
Calcium chloride (CaCl2) J.T. Baker 1332
Sodium citrate (Na3C6H5O7) J.T. Baker 3646
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Organics 9624P
Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) Calbiochem 528877
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Research Organics 9574E
Magnesium Sulfate (MgSO4) J.T. Baker 2500
Triton-X 100 Sigma X100
Formaldehyde J.T. Baker 2106
Paraformaldehyde Sigma P6148
Ammonium chloride (NH4Cl) J.T. Baker 660
BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free Jackson Immuno Research 001-000-161
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma P1951 Toxic. Use gloves to handle this reagent 
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Invitrogen  D1306 Toxic. Use gloves to handle this reagent 
Sulfuric acid (H2SO4) J.T. Baker 9681 Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent 
Sodium hydroxide (NAOH) Merck 1.06498 Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent 
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) Sigma A-3648
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
Trypan blue solution Sigma T8154 
Name   Company  Catalog Number  Comments
Equipment  Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent 
Rotator  Boekel Scientific Model 230300
Centrifuge DuPont Corporation  Model sorvall TC6
shaker  Lab-line Instruments Model 314-820 

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References

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चिकित्सा अंक 108 तीन आयामी संस्कृति पिट्यूटरी adenomas प्राथमिक सेल संस्कृति alginate मोती Neuroendocrinology
मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं के तीन आयामी Alginate मनका संस्कृति
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Avila-Rodríguez, D.,… More

Avila-Rodríguez, D., Paisano-Cerón, K., Valdovinos- Ramírez, I., Solano-Agama, C., Ortiz-Plata, A., Mendoza-Garrido, M. E. Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells. J. Vis. Exp. (108), e53637, doi:10.3791/53637 (2016).

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