Abstract
Üç boyutlu bir kültür yöntemi tarif edildiği primer hipofiz adenomları hücreleri aljinat taneleri yetiştirilir. Aljinat kahverengi deniz yosunu elde edilen bir polimerdir. Kısaca, tümör dokusu küçük parçalar halinde kesilmiş ve kolajenaz ve tripsin ile enzimatik sindirme sunulur. Daha sonra, bir hücre süspansiyonu elde edilir. Tümör hücre süspansiyonu% 1.2 sodyum alginat ile karıştırılmış ve bir CaCl2 solüsyonu içine düştü ve aljinat / hücre süspansiyonu küresel boncuklar oluşturmak üzere CaCI2 ile temas halinde jelleştirilmiş olmasıdır. Aljinat taneleri gömülü hücreleri,% 20 FBS ile zenginleştirilmiş kültür ortamı tarafından sağlanan besin sağlanır. aljinat taneleri üç boyutlu kültürü dört ay kadar uzun bir süre için adenom hücrelerin canlılığını muhafaza eder. Ayrıca, hücreler, sodyum sitrat olan boncuk yıkayarak alginat açığa çıkartılır ve daha immünositokimyasal analizler için cam lameller üzerine tohumlanabilir. Bir cel kullanımıl kültür modeli asgari örgütsüzlük ile aktin hücre iskeletinin fiksasyon ve görselleştirme için izin verir. Özet olarak, aljinat taneleri pituiter adenoma hücrelerinin bakımı için güvenilir bir kültür sistemi sağlar.
Introduction
Bunlar kültür edilmiş hücreler için üç boyutlu bir yapısal destek ve hücreden hücreye iletişimde 1 bakımını sağlamak için, üç boyutlu iskele kapsamlı hücre kültürü kullanılmıştır. Doğal olarak elde edilmiş polimer malzemeleri, tip I kollajenin, kitosan ve alginat da dahil olmak üzere, üç boyutlu bir yapı iskelesi yapmak için kullanılmıştır. Aljinat kahverengi deniz yosunu Macrocystispyrifera (deniz yosunu) elde edilen doğal bir polimerdir. Bu polimer β-D-mannuronik asit (M) ve α-L-guluronik asit (G), kalsiyum ve baryum gibi bazı iki değerli katyonların mevcudiyetinde 2 ve şekiller stabil jeller tekrarlanan birimlerden oluşur. Kalsiyum klorür (CaCI2) çözeltileri yaygın olarak, aljinat tanelerini oluşturmak üzere çapraz bağlama maddesi olarak kullanılmaktadır. Aljinat çözeltiler hemen üç boyutlu küresel jel oluşturmak CaCI2 düştü. alginat çözeltisi hücreleri ile karıştırılır, hücreler aljinat B içine kapsüllenirEADS 3.
Aljinat sağlamıştır olan özellikleri kondroitler 4 iskelet miyoblastların 5 ve nöral kök hücreler 6 da dahil olmak üzere hücreleri, çeşitli kapsüllenmesi için bir matris olarak kullanılmak zorundadır. Bu inert bir malzemedir ve besin, oksijen ve hücre yaşamını ve işlevini korumak metabolik ürünlerin dağıtılması için; Üstelik, diğer jel esaslı kültür sistemleri farklı olarak, aljinat taneleri içinde kültürlenmiş hücreler aynı zamanda, sodyum sitrat, kalsiyum şelatlar kullanılarak iskele serbest bırakılabilecektir ve hücreler daha sonra daha ileri araştırmalar 7 hasat edilebilir.
Hipofiz adenomları tipik olarak düşük çoğalma oranları ile iyi huylu tümörlerdir. Fare hipofiz adenomları hücre çizgileri, iki boyutlu bir sistemin 8 başarılı kültürlenmiştir. Ancak, salgı insan hipofiz hücre tümörlerinin bu kültür verimli bir gelişme değildir; dağınık tümör hipofiz hücrelerinin zayıf büyüyecekkültürde hücreler yayılan sınırlı eki ve sergilemek ve hücreler genellikle kültür çanak 9,10 yüzen agregatlar oluştururlar.
Birçok deneme enzimatik ve mekanik dispersiyon yaklaşım 11, salt mekanik bir dispersiyon yaklaşım 12 ve tümör eksplantlannın 10 kültür de dahil olmak üzere, bir tümör hipofiz hücresi süspansiyonu elde etmek için yapılmıştır. Bu yaklaşımlar ile farklı yazarlar farklı zaman aralıklarında için geçerli yapışık kültürleri elde edilmiştir. Tümör hücrelerinin salgı kapasiteleri tümör tipi ve üremeleri oranları 9 bağlıdır, bu iki boyutlu sistemlerde hayatta kalmak için. Ancak, uzun vadeli kültürlerde, fibroblast fenotipleri ile hücreleri 11,13 hakim. Bu makale ayrıca analizleri sağlayan alginat iskele onları açığa aljinat tanelerinde kapsüllenmiş hipofiz adenomları hücrelerinden bir birincil hücre elde edilmesi için bir yöntem tarif ederkendi hücre biyolojisi, örneğin, kendi iskelet düzenlemelerin yönleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Tıp Kurumu ve Ulusal Politeknik Enstitüsü Araştırma ve Avans Çalışmaları Merkezi'nin yerel etik kurullar tarafından insan malzemesi kullanımı için onaylanmıştır.
1. Tümör Örnek Toplama
- Bir transsfenoid cerrahi işlem 14 ile bir hastadan hipofiz adenomu doku biyopsisi edinin.
- hipofiz adenomları örnek toplamak ve taze,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile zenginleştirilmiş 199 kültür ortamı (M199), 0.6 mg / mL sodyum bikarbonat, 2.4 mg / ml HEPES ve 1, 50 mL% ihtiva eden steril bir cam şişe içine yerleştirin pH 7.4'te antibiyotik (penisilin / streptomisin). Buz üzerinde bir cam şişe içinde örnek koruyun.
Not: Tümör dokusu cerrahi sonra birkaç saat işlenebilir. - buz üzerinde cam şişede laboratuvara tümör örneği taşıyın.
Enzimatik Doku Ayrılma Çözümleri 2. hazırlanması,Tripsin inhibitörü Çözelti ve alginat solüsyonlarından
Not: Hücre kültürü prosedürü öncesinde aşağıdaki çözümleri hazırlamak. Kullanmadan önce 0.22 um zar filtre kullanılarak tüm çözümler, filtre.
- M199-serumsuz 5 ml kollajenaz (tip I) 'in 5 mg çözülmesiyle kolajenaz% 1 çözeltisi hazırlayın.
- PBS-EDTA% 0.3 10 ml tripsin 0.01 g çözülerek% 0.01 çözelti tripsin hazırlayın.
- M199-serumsuz 20 ml soya tripsin inhibitörü, 2 mg çözülmesiyle% 0.1 tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlayın.
- tripsin inhibitörü çözeltisi 4 ml DNase I 134 U / ml 20 ul çözülmesiyle DNAz çözeltisi hazırlayın.
- 155 mM NaCI, 40 ml EGTA 22.8 mg çözülmesiyle EGTA çözeltisi (1.2 M) hazırlayın. PH 7.4 ayarlayın. 50 ml'lik bir son hacme kadar devam edin.
- 155 mM NaCI, 50 ml 238 mg HEPES eritilerek HEPES çözeltisi (20 mM) hazırlanır.
- 1.2 çözerek% 1.2 aljinat çözeltisi hazırlayınHEPES çözeltisi, 100 ml g sodyum alginat yer alır. aljinat çözeltisi Otoklav.
- 7.4 pH ayarlamak, 50 mi HEPES çözeltisi içinde CaCI2 750 mg çözülmesiyle kalsiyum çözeltisi (102 mM) hazırlanması
3. Primer Hücre Kültürü ve Aljinat Kapsülleme
- Laminer akış kabini içinde, yaklaşık olarak 20 mi ari PBS Ca + 2 ve Mg + 2, pH 7.4 (PBS *) ihtiva eden bir 35 mm Petri kabı, tümör dokusu yerleştirin.
- hafifçe doku yıkama, cerrahi pens ile doku almak ve taze PBS * içeren başka petri yerleştirin. kırmızı kan hücreleri ve enkaz kaldırılana kadar bu adımı tekrarlayın.
- cerrahi cımbız kullanarak, hipofiz adenomu doku tutun ve küçük cerrahi makas, küçük parçalar halinde kesin. yuvarlak kenarlı bir Pasteur pipeti ile, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg, 15 ml'lik bir tüp içine Santrifüjü doku parçaları ve PBS * aktarın.
Not: Bir Pasteur kenarlarını yuvarlamak içinPipet, biraz Bunsen beki içinde pipet ucu Alev. - Pasteur pipeti kullanarak PBS * çıkarın ve (yaklaşık olarak doku 65 mm3 5 mi), ters çevirme, iki ya da üç kez karışımı kolajenaz çözeltisi 3-5 ml ekleyin. sabit dönüş, 37 ° C'de 30 dakika boyunca kolajenaz doku inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg'de tüpü santrifüjünde bir Pasteur pipeti ile kollajenaz çıkarın.
- daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg tüp santrifüj, DNAz 5 ml ilave edilir ve üst edilerek, iki ya da üç kez karıştırılır.
Not: doku tamamen ayrışmış değilse, 37 ° C'de 3 dakika boyunca tripsin ile ikinci bir enzimatik sindirim gerçekleştirin. tripsin inhibitör çözeltisinin 2 hacim eklenerek sindirim durdurun. - Pasteur pipeti ile süpernatant aspire ve atın. EGTA çözeltisi 1 hacim pelet yeniden askıya ve aljinat çözeltisi 2 hacim ile karıştırın.
- Yavaşça hücre süspansiyonu ve aljinat mixPasteur pipeti ile pipetleme. Bir 21 G iğne ile steril bir şırınga alın piston kaldırmak; aljinat ve hücre çözeltisi şırınga yüklemek için bir pipet kullanın.
- Yavaşça şırıngaya pistonu yerleştirin ve dikkatli bir şekilde aljinat hücre çözeltisi damla ile damla kalsiyum açısından zengin çözeltinin yaklaşık 30 ml ihtiva eden bir cam behere dağıtın.
- Yaklaşık 5 cm kadar CaCl2 çözeltisine şırınga iğnesi yerleştirin. CaCI2 ile temas halinde alginat hücreli bir süspansiyon jeli küresel tanecikler oluşturulur. 5 dakika boyunca, kalsiyum çözeltisi aljinat tanelerinden tutun.
Not: boncuk düştü edildiği cam beher karıştırın. birbirine yapışmasını önlemek için, dairesel hareketlerle elle yavaşça hareket ettirin. - Dikkatle Pasteur pipeti ile kalsiyum çözeltisi kaldırmak ve FBS% 20 ile zenginleştirilmiş M199 3-5 ml ile iki kez boncuk yıkayın.
- Düzenli T25 doku kültürü içine aljinat boncuk aktarınsteril bir spatula kullanılarak şişe,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de M199 4-5 ml% 20 FBS ile zenginleştirilir ve inkübe ekleyin. Her üç günde bir kültür ortamı değiştirin.
4. Aljinat gelen Hücreleri Özgürleştirin
Not: Ön aljinat tanelerinden hücreleri serbest bırakılması için, poli-D-lisin ile kat 13 mm çapında lamelleri.
DİKKAT: Sülfürik Asit A ÇOK KOROZİV ASİT NEDİR VE APTS GÖZ VE cilt tahrişine neden olabilir. Bu reaktiflerin KOLU İÇİN LATEX ELDİVEN KULLANIN.
- Bir çeker ocak içinde, bir noktadan cımbız ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 20 sulu sülfürik asit ihtiva eden bir cam petri lamelleri bırakın.
- sülfürik asit tortusundan ayırma, ve her biri 5 dakika için damıtılmış su ile lamelleri beş kez yıkayın. Bir noktaya cımbız yer oda sıcaklığında 15 ° C'de 5 dakika için 0.1 M NaOH içeren bir petri tabağına temiz lamelleri kullanılması.
- NaOH Durusu ve imbikle ile bir kez yıkayınled su, su aspire ve lamelleri kurulayın.
- 4 dakika boyunca APTS (aminopropil-trietoksilanın) ile kaplamak için lamelleri bir mikropipet kullanın distile su ile Petri kabı sel (6 lamelleri için 500 ul kullanın). Hızla su aspire ve su altında girmesine izin gelin cımbız ile lamelleri hareketli, damıtılmış su ile yıkayın devam ediyor.
- su aspire ve lamelleri kuru, temiz bir Petri kabı içine bir nokta cımbız yer lamelleri kullanarak ve 3 kez, 45 saniye, her sırasında mikrodalga içinde sterilize. poli-D-lisin, 100 ug (0.1 mg / ml) steril su 1000 ul ekle.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca poli-D-lizin, yaklaşık 50 ul lamelleri inkübe edin. Tamamen poli-D-lisin aspire.
Not: kültür ortamında çözünebilir poli-D-lizin hücresi çoğalmasını inhibe olduğu için önemlidir. - Her biri 5 dakika lamelleri, steril su ile beş kez çalkalayın. st aspireerile su ve izin lamelleri bir laminer akış kabini içinde kurumaya.
- aktin hücre iskeletinin analiz etmek, aljinat gelen hipofiz hücreleri kurtarmak. 1 ml bir pipet kullanılarak kültür şişesi aljinat taneleri bazı alın ve 15 ml'lik bir tüp içine yerleştirin.
- 55 mM sodyum sitrat 5 ml oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 68 xg ve santrifüj (323.6 Na 3 C6Hs 5 O 7 mg, 2H 2 O 20 ml HEPES çözeltisi çözülür). Süpernatantı aspire ve atın.
- % 20 FSB ile zenginleştirilmiş ılık M199 1 ml pelet yeniden askıya; hafifçe Pasteur pipeti ile bir hücre süspansiyonu karıştırılır.
DİKKAT: faloidin VE DAPI ZEHİRLİ DEĞİLDİR. Bu reaktiflerin KOLU İÇİN ELDİVEN KULLANIN. - , Hücreleri saymak 1.5 ml tüp% 0.4 Tripan mavisi çözeltisinin 125 ul aktarmak için. M199 75 ul, son aşama (seyreltme faktörü = 5) 'de elde edilen hücre süspansiyonu 50 ul ekle. İyice karıştırın.
- plac bir mikropipet ucu kullanınhemositometre odasında Tripan mavisi hücre süspansiyonu e yaklaşık 10 ul.
- Faz kontrast aydınlatma bir ters mikroskop kullanılarak hemositometre sayacında hücreleri sayın. 1 mm merkezi kare ve dört 1 mm köşe kareler tüm hücreleri saymak. Seyreltme faktörü ile kare başına ortalama sayısı çarpılarak mililitre başına hücre yoğunluğu elde etmek -. 10 4 Örneğin, kare başına ortalama sayıları 45 hücreleri x 5 x 104 = 2.25 x 106 hücre / ml ise.
Not: hemositometre odasının on meydanlarında hücreleri saymak. alt ve sağ kenarlarında orta çizgiye temas hücreleri saymayın. - Tohum poli-D-lizin kaplı 13 mm çapında cam lameller üzerine 35.000 hücre.
5. Aktin Hücre iskeleti Düzenlemesi
- Kültür içerisinde 48 saat sonra, bir Pasteur pipeti ile kültür ortamı ortadan kaldırmak ve hızlı bir şekilde PBS lamel 500 ul hemen PBS kaldırmak.
- t Fix ve permeabilize37 ° C'de 10 dakika boyunca tespit tamponu (0.1 M BORU, pH 6.75,% 4, PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4,% 0.5 Triton X-100 ve% 2 formaldehid) lamel 500 ul O hücrelerin C
- sabitleme tamponunu çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 3.5 paraformaldehit lamel 500 ul ilave edin. paraformaldehit çözüm çıkarın.
- Her biri 5 dakika için PBS lamel 500 ul ilave edilerek lamelleri üç kez yıkayın. Sabit çalkalamada olarak, oda sıcaklığında lamelleri yıkayın.
- 10 dakika boyunca 50 mM amonyum klorür ile inkübe hücreleri amonyum klorür çözeltisi aspire adım 5.4 tekrarlayın.
- 30 dakika boyunca PBS içinde% 1 BSA (IgG içermez, proteazlar içermez) ile hücrelerin inkübe BSA çözeltisi çıkarın ve adım 5.4 tekrarlayın.
- RT'de 7 dakika, tekrar adımı 5.4 için rodamin-konjuge Phalloidin 50 uM inkübe hücreleri.
- Oda sıcaklığında 5 dakika tekrar adım 5.4 PBS içinde seyreltilmiş DAPI 255 uM hücreleri inkübe edin. Sonunda t montajO bir montaj ortamı ile lamelleri ve oje ile mühür.
- 541 nm eksitasyon dalga boyunda bir 63x objektif ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak aktin sitoskeletal düzenlemelerin görüntüleri elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kültür ve farklı zaman dilimlerinde için aljinat boncuk adenom hipofiz hücrelerinin korunmasında başarı ile tatbik edilmiştir üç ay sonra Şekil 1 aljinat boncuk gömülü hücreleri Şekil.; Bu hücreler. ters ışık mikroskobu (Şekil 1) altındaki iki refraktif yuvarlak şekiller Şekil 2 alginat gömülü fare hipofiz adenomları Hücrelerinde N-kaderin lokalizasyonunu göstermektedir. N-kadherin, hücre-hücre temas (Şekil 2A ve 2C) lokalizedir ve çekirdek (Şekil 2B ve 2C) genişletilmiş kromatin göstermiştir.
aljinat taneleri tümör hücrelerinin kültürde 4 ay için geçerli kalır; Bu nedenle, hücreleri farklı yönlerinin analizler sağlar farklı zamanlarda aljinat taneleri, serbest bırakılabilecektirAynı hücre kültüründe hücre biyolojisi. Örneğin, proliferasyon indeksi çalışmayan Ki-67 immün reaktivite ve 19.2 ± 1.5 ortalama% etiketleme indeksi kullanılarak insan hipofiz adenomları elde edilmiştir (± SEM demek), on elde edilmiştir. Şekil 3 kültürlü insan hipofiz gösterir Ki-67 için immunohistokimyasal adenom hücreleri.
non-invazif hücrelerinin aktin cytoskeletons immünositokimyasal protokole göre boyandı, yukarıda tarif eder. Kültür hücreleri küçük aktin stres lifleri (Şekil 4A) kültür sisteminden bağımsız hipofiz adenomu ile çeşitli hayranlarıyla morfolojileri ve aktin filament düzenlemeleri ile uzun şekiller sergilendi; Örneğin, çalışmayan bir invazif adenomu, bu hücreler arasında baskın şekli sürekli kortikal halkalarda da aktin filamentler bir düzenleme ile tamamlanmıştır. (Şekil 4B).
Şekil 1. 3 ay boyunca aljinat taneleri içine gömülü hücreler. Hücreler ters ışık mikroskobu altında iki kırılma yuvarlak şekiller gösterirler. aljinat gömülü Sağ panel invaziv makroadenom hücrelerinde gösterilir ve sol panelde non-invazif makroadenom hücreleri gösterilmektedir. Ölçek çubuğu = 15 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Aljinat taneleri fare hipofiz adenomları Hücrelerinde N-kaderin (GH3) kültür Şekil 2. immuno-sitokimyasal analizi. GH3 hücreleri, alginat kültürlenmiştir, N-kadherin (kırmızı) için boyandı alginat sistemi gömülü sabit ve çekirdeği (mavi ). Hücreler bir cum düzenlemek vardırUlus hücre-hücre sınırları (A ve C) 'de N-kaderin gösteriliyor. Çekirdek (B ve C) genişletilmiş kromatinli gösterilmektedir. Ölçek çubuğu = 15 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Nükleer antijen ki-67 kültürlü insan hipofiz adenomu hücrelerinin Şekil 3. İmmünoboyama. Aljinat boncuk kültüründe 2.5 ay sonra, invaziv olmayan işleyen adenom hücreler tespit edildi ve daha sonra Ki-67 (Kırmızı) ve çekirdek (mavi) için immunohistokimyasal. Bazı adenom hücreleri Ki-67 pozitif immün göstermektedir. Ölçek çubuğu = 15 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil aljinat boncuk kurtuldu hipofiz adenomu hücrelerinin 4. Aktin hücre iskeleti düzenlemeleri. Hücreler sabit ve TRITC-Phalloidin sahip filamentler aktin için boyandı. Non-invazif adenomu hücreler, küçük aktin stres elyafların (A) gösteren alt-tabaka üzerine uzatılmıştır. Invazif adenomu hücreler sürekli aktin halkaları (B), bir yuvarlak şekil göstermiştir. Ölçek çubuğu = 15 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol pek çok kritik adımlar vardır. İlk hücre kültürünün tüm besinler ve gazların difüzyonu aynı koşullar korumak için gerekli olan boncuk büyüklüğü homojenliği vardır. Bizim tecrübelerimize göre, aljinat boncuk yapmak için bir 21 G iğne kullanımı üniforma boncuk boyutu verimli bir kültür edinimi için izin verir. İkinci önemli faktör iğne mesafedir; Bu mesafe, kalsiyum çözeltisinden 5 cm kalsiyum çözeltisinin yüzeyinde ile aljinat / hücre çözümü akışı çarpışması nedeniyle deforme inci ve ölü hücreleri önlemek için daha fazla olmalıdır. Üçüncü kritik bir adım boncuklar birbirine yapışmasını önlemek için bırakılan edildiği cam karıştırma olduğunu. düzensiz hücre kapsülleme sonuçları tutunan.
Bu protokole bazı değişiklikler Deneyimlerimize göre, örneğin, bir araştırma söz konusu bağlı olarak ağ karıştırılabilir sodyum aljinat çözeltisi gerçekleştirilebilirBir bazal membran tip IV kolajen gibi protein ve daha önce tarif edilen protokol takip i, üç boyutlu bir aljinat iskele elde edin. Bir diğer olasılık 15 mm çap kuyu aljinat minderler yüzen yapmaktır; Bu jellerin içindeki hücreler üzerinde ya da içlerinde tohumlanır edilebilir. Herhangi bir deney onların Ca 2 + veya Mg 2 + konsantrasyonlarda değişiklikler gerekiyorsa aljinat çalışırken Giderme gerekli olabilir. Hidrojel stabilite değiştirilebilir olmasıdır. Ba2 + -ve Cu2 + -crosslinked alginat jeller, sulu çözeltiler içinde nispeten kararlı olan, ne yazık ki, bu katyonlar genellikle 3 sitotoksiktir.
Bu hipofiz adenomları dokular gibi tümör dokularında çalışırken, bu tekniğin bir sınırlama temin küçük bir doku örnektir. Bu nedenle, elde edilen aljinat tanelerinin sayısı doku numunesi uzunluğuna bağlıdır.
Daha önce, bir sistemiüç boyutlu bir kültürde hipofiz adenomları hücreleri korumak tarif edilmiştir. Yazarlar, farklı dönemlere 16 Bu durumda hücreler agrega oluşturmak için sallayarak gyratory hücreleri teslim ve yapılmaktadır. bu hücre süspansiyon kültürünün kullanımı kültür odası içinde sarmal dönüşlü ekipman gerektirir. Burada tarif edilen protokolün bir avantajı, ekstra laboratuar tertibat için ihtiyaç olmaksızın, üç boyutlu bir sistemin hücre kültür için izin vermesidir. Üç boyutlu alginat sistemi gömülü hücrelerin düzenli bir şişe içinde düzenli bir kuluçka makinesi içinde muhafaza edilir. Bir başka avantaj aljinat iskeleti, diğer üç boyutlu sistemlerinin aksine olarak, hücrelerin daha fazla araştırma 7 hidrojel serbest kalması izin vermesidir. Ayrıca, aljinat taneleri içinde kültürlenmesi önemli bir yönü, bu sistemde gömülü hücrelerin de novo hücre dışı matrisi sentezlemek için mümkün olmasıdır. Bir alternatifalginat gömülü hücrelerin incelenmesi için bir yöntem takip eden kesit ve immunohistokimyasal 17 analizler için polietilen glikol artan konsantrasyonları ile kurutulmasından sonra, aljinat tanelerin fiksasyondur.
Biz üç boyutlu ortamda etkileşimlerini analiz etmek için gömülü birincil kültür, normal hipofiz sıçan hücrelere üç boyutlu aljinat taneleri sistemini uygulamak için gelecekte ilgilenen ve aynı zamanda hipofiz adenomu kültür, diğer tip vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W. R.
- Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
- Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
