Summary
Ici , nous utilisons la méthodologie FISH pour suivre LINE-1 retrotransposition au niveau des noyaux unique étalements de chromosomes de lignées cellulaires HepG2 exprimant de façon stable LINE-1 synthétique.
Introduction
Human long Interspersed nucléaire Element-1 (Line-1 ou L1) est un élément mobile autonome qui se propage dans le génome par un "copier-coller" mécanisme de retrotransposition. A L1 humain typique est environ 6 kb et consiste en un 5'UTR (région non traduite) qui sert de promoteur, deux cadres de lecture ouverts (ORF): L1 et L1 -ORF1 -ORF2, et un 3'UTR avec un polyA . queue L1 protéine -ORF1 a trois domaines distincts: un domaine bobine-bobine, ARN reconnaissance Motif et domaine C-terminal, alors que la protéine L1 -ORF2 a endonucléase, la transcriptase inverse et cystéine riches domaines 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 présente des activités chaperonnes d'acide nucléique, tandis que L1 -ORF2 fournit des activités enzymatiques, avec les protéines nécessaires à la rétrotransposition 1,2,6.
Un cycle de L1 retrotransposition commence par la transcription de la 5'UTR de L1 L1 -ORF1 présente soit cis de liaison d' où elle conditionne son propre ARN ou trans liaison d' où elle emballe les autres ARN (c. -à- SINE / SVA / pseudogènes) pour former une particule de ribonucléoprotéine (RNP) avec L1 -ORF2p 7, 8. RNP translocation dans le noyau où l'activité d'endonucléase de L1 -ORF2p pseudos ADN génomique (ADNg) pour exposer un groupe OH - groupe 9, qui est à son tour utilisé par la transcriptase inverse pour amorcer et inverse l' ARN synthétisent l'ADN de l' extrémité 3 '. Lors de la synthèse inverse, le second brin d'ADN est entaillé 7-20 pb à partir du site nick d' origine pour créer des pauses décalées qui sont remplis pour former les signatures insertion L1 séquences (par exemple, TTTTAA) appelés duplications site cible (DNT) 9,10. Ce processus est connu comme cible principale transcription inverse (TPRT) et conduit à Insertisur des copies complètes ou tronquées de L1 / DNT avec d' autres ADN aux deux extrémités de la séquence insérée L1 rétrotransposition a également été démontré. médié par TPRT analogue à la fin de jonction non homologue dans certains types de cellules 11.
Le vecteur L1 rétrotransposition utilisé dans nos études est non épisomiques et se compose de tagged L1 -ORF1 & 2p commandés par des promoteurs CMV L1-5'UTR combinés (figure 1) 12. Les versions antérieures de cette construction ont été décrits dans des études utilisant des levures et des cultures de cellules humaines 13,14,15. Deux promoteurs CMV distincts situés aux extrémités 5 'et 3' du vecteur, à l'extrémité 3 'placé dans une orientation inverse pour diriger l'expression de la néomycine après épissage et d'intégration. La cassette d'indicateur de rétrotransposition à l' extrémité 3 ' se compose d'un gène inséré anti - sens à la néomycine L1 -ORFs et rendu inactif par séparation en deux moitiés par une bouledans l' intron avec le donateur épissage (SD) et accepteur épissage (SA) sites (figure 1). Lors de l' intégration dans un chromosome, L1 est transcrit à partir du promoteur commun pour produire un ARNm qui est constitué d'un ARNm bicistronique et de l' ARNm néomycine inactif. Au cours du traitement de l'ARN, l'intron de globine est épissé du gène de la néomycine pour restaurer un gène de néomycine complètement fonctionnel. L'ARNm hybride est emballé dans un RNP en cis et translocation dans le noyau où il est intégré dans le génome comme étant soit pleine longueur ou tronquées insertions en utilisant TPRT.
Nous décrivons ici une méthode qui utilise l' hybridation fluorescente in situ (FISH) avec des sondes spécifiquement dirigés au gène de la néomycine épissé (Sneo) pour suivre les habitudes de -retrotransposiition L1 et les taux d'insertion au niveau du noyau unique. L'efficacité et la spécificité de la détection a été confirmée en utilisant retrotransposition compétent et constructions incompétents et sondes pour detect Sneo ou la néomycine et globine intron jonction 16. Cette méthodologie représente pour certaines des lacunes des tests de rétrotransposition à base de culture cellulaire, tels que des insertions multiples, la résistance des colonies et l'expansion du clone favorable.
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Protocol
Remarque: Toutes les étapes doit être effectuée à la température ambiante, sauf indication contraire. S'il vous plaît se référer à la section Réactifs pour plus de détails sur la façon de préparer des réactifs individuels.
1. Étiquetage L1 Sondes
REMARQUE: Les sondes peuvent être marquées par un marquage chimique ou PCR.
- Marquage chimique
- Faire gel d'agarose à 0,7-1% dans le tampon Tris-acétate-EDTA (TAE) du tampon, de la chaleur dans un four micro-ondes jusqu'à ce que fondu, laisser refroidir le gel, puis ajouter du bromure d'éthidium (0,5 pg / ml). Verser dans le bac de gel, ajouter des peignes et laisser le gel se solidifier à la température ambiante.
- Marquer la sonde Sneo (1-2 pg) avec ou CY3 FITC à 37 ° C pendant 1 heure selon le protocole du fabricant.
NOTE: Sneo désigne le S pliced gène mycin Neo exprimé après un cycle complet de retrotransposition. La sonde est de ~ 1000 pb. Sneo peut être amplifié par PCR de tout vecteur ou de genomic ADN. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour des informations sur streptavidine CY3 / FITC réactifs de marquage. - Mélanger la solution de sonde Sneo marquée avec un tampon d'ADN 1x de chargement, charge dans chaque puits et exécuter à 75-100 volts pendant 15-20 min.
- Visualiser la bande de sonde en utilisant un Ultra Violet (UV) Illuminateur. Notez que la taille de la sonde Sneo peut être ajustée et que les noyaux de verrouillage d' acide (LNA) peut également être ajoutée (figure 2).
- Cut sonde marquée Sneo du gel avec une lame propre, solubiliser et purifier la sonde Sneo du gel en utilisant un kit Clean-Up PCR selon le protocole du fabricant.
ATTENTION: Couvrir chaque de partie exposée du corps avec des boucliers de protection (c. -à- manteaux de laboratoire et UV masque clair) lors de la visualisation et la coupe du gel. Voir le tableau des matières et réactifs pour information au gel purifier les produits de PCR. - Re-run 5 pi de Sneo étiquetés sonde avec une sonde Sneo non marqué sur un gel d'agarose à 0,7% (voir 1.1.1) pour conAugmenter la taille de l' entreprise et la perte d'intensité du signal (figure 2).
- Quantifier la quantité de sonde Sneo marqué en mesurant l'absorbance à 260 nm et diluer la sonde Sneo à 10 ng / ul aliquotes dans nucléase libre H 2 O. aliquotes de conserver à -20 ° C.
- Étiquetage PCR (méthode alternative pour l' étiquetage de la sonde)
- Combiner des amorces spécifiques (5'-Sneo ggatagcattgggagatatacct-3 'et 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') avec des réactifs de PCR dans un seul tube: 13,6 ul de nuclease libre H 2 O; 0,1 pi de dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ul dTTP (10 nM); 0,05 ul dUTP-biotine / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 pi Go Tag 5x tampon; 0,4 ul Go Tag Polymerase; 1 pl Sneo gabarit (10 ng). Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour des informations sur les réactifs de PCR.
- Ajuster la quantité de chaque réactif en multipliant par le nombre total d'échantillons.
- Utilisez le paramètre vélo PCR suivants pour amplifier et d'étiquettes Sneo sondes: 95 ° C pendant 2 minutes; 35 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 62 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 60 secondes; 72 ° C pendant 2 min; Tenir à 4 ° C indéfiniment.
REMARQUE: La température de recuit peut être ajustée ou PCR gradient peut être effectuée pour déterminer des températures de recuit optimales pour d'autres sondes. - Faire gel 0,7-1% comme dans la section 1.1.1, la charge et de visualiser la bande de sonde dans la section 1.1.4.
- Couper et purifier la sonde Sneo étiquetés comme dans la section 1.1.5.
- Re-run 5 pi de Sneo étiquetés sonde avec Sneo sonde non marqué pour confirmer l' augmentation de la taille et la perte d'intensité du signal (voir la figure 2).
- Quantifier la quantité de sonde Sneo marquée par mesure de l' absorbance à 260 nm et diluer la sonde Sneo à 10 ng / ul aliquotes dans nucléase libre H 2 O.
2. Préparation des étalements chromosomiques
- Générer des clones stables exprimant le squelette du vecteur (control) ou rétrotransposition L1 compétent en utilisant des méthodes classiques de sélection. 12,16 Bien que les reporters non épisomiques ont été utilisés pour mettre en corrélation les résultats avec les études de transcription, des vecteurs épisomiques peuvent également être utilisés. Cultiver des cellules exprimant de manière stable le contrôle ou L1 vecteur (1 x 10 6 cellules par 10 cm plaque, avec des ajustements de la taille de la plaque réalisés selon les besoins) dans les milieux de croissance complet. Pour les cellules HepG2, en utilisant du RPMI-1600, 10% de SVF et 200 ug / ml d'hygromycine. Cultiver les cultures à 70% de confluence à 37 ° C et 5% de CO 2.
NOTE: Le choix du milieu de croissance est dépendante du type de cellule. Etant donné que les plasmides utilisés ici comportent des cassettes de sélection à la fois pour l'hygromycine et la néomycine, la sélection stable de clones pourrait également être fait avec de la néomycine après sélection sur hygromycine, mais la quantité de néomycine doit être optimisé pour établir des seuils de tolérance pour chaque type de cellule. - Ajouter colcémide (0,4 pg / ml) au milieu de culture et incuber pendant 90 min pour arrêter les cellules à métaphase. Si l'on utilise différents types de cellules, déterminer la concentration optimale de la colcémide et le temps d'exposition (60, 90 et 120 min) pour optimiser arrêt de la métaphase de manière empirique.
- Laver les cellules 2 fois avec 10 ml de PBS 1x Dulbecco (DPBS), trypsiniser en y ajoutant 5/3 ml d'une solution à 0,25% de trypsine aux cellules et incuber pendant 5 minutes pour détacher les cellules. Inactiver trypsine avec une quantité égale de milieux contenant 10% de FBS.
- Centrifuger les cellules pendant 2 min à 1000 x g à 4 ° C, aspirer le milieu à partir du culot cellulaire et laver les cellules avec du DPBS. Aspirer tous les DPBS, laissant 200 pi de DPBS pour remettre en suspension les cellules. cellules Veiller sont bien mélangés et que tous les bouquets sont dispersés. Utilisez le scintillement ou pipetage doux pour mélanger et disperser des touffes et éviter tourbillonnement.
- Ajouter 5 ml de solution hypotonique (ie, 75 mM KCl) qui est pré-chauffé à 37 ° C goutte à goutte tout en faisant tourner le tube de 15 ml horizontalement et incuber à 37 ° C pendant 20 min. Voir le tableau des matériaux et Reagents pour obtenir des informations sur la façon d'obtenir et de faire une solution hypotonique.
- Centrifuger les cellules à 120 g pendant 5 min à 4 ° C et répétez les étapes 02.04 à 02.05 3x laissant environ 200 pi de solution hypotonique pour remettre en suspension les cellules après chaque lavage. Faire en sorte que, à la fin des 3 lavages, le culot est visiblement blanc et gonflé.
- Re-suspendre le culot dans 200 ul de solution Carnoy fixatif et faire 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 dilutions en solution Carnoy fixatif. Déposer 10 ul de chaque dilution sur une lame propre et sec à partir d'environ 1 cm au-dessus et d'exposer immédiatement le côté libre diffusion à la vapeur chaude de l'eau bouillante pendant 30 secondes. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour des informations sur la façon de rendre la solution Carnoy fixatif.
- Sécher les écarts à la température ambiante, tache avec 0,1 pg / ml de Hoechst-33342 par immersion pendant 15-20 min en Coplin Jar et laver 3x avec du DPBS. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon de rendre la solution Hoechst-33342. <li> Voir se propage sur la fluorescence / contraste de phase microscope au grossissement 40X. Après l' optimisation de la préparation de la propagation, les écarts ne doivent pas être colorées avec Hoechst-33342. Voir se propage sur le contraste de phase microscope au grossissement 10X pour déterminer la qualité et la propagation de séparation tel que décrit dans la section des résultats (voir Figure 3).
- Sélectionnez et encerclez bons spreads avec un Marqueur de diamant sur le côté opposé de la glissière (c. -à- diffuser sans côté).
- Magasin se propage à -20 ° C pendant jusqu'à un mois. Eviter l'exposition à l'humidité.
3. Fluorescence In Situ Hybridation (FISH)
- Stabiliser et déshydratant spreads
NOTE: Equilibrer métaphase chromosome se propage à la température ambiante si elle est conservée à -20 ° C. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon d'obtenir et de faire des réactifs.- Incuber métaphase chromosome se propage avec 200 pi RNase A pour1 heure à 37 ° C.
- Laver les lames dans du tampon SSC 2x deux fois pendant 5 min à chaque fois suivi d'un rinçage avec une solution 10 mM de HCl.
- Incuber spreads avec 1% de pepsine pendant 10 min à 37 ° C, rincer avec de l' H 2 O désionisée et laver deux fois avec un tampon de 2x-SSC pendant 5 minutes chacun.
- Incuber spreads avec 4% de paraformaldehyde pendant 10 minutes et laver dans un tampon SSC 2x deux fois pendant 5 min chacun.
- Déshydrater se propager par incubation pendant 2 min dans une série d'éthanol: 70%, 80% et 95% d'éthanol.
- diapositives Air sec.
- Hybridation Spreads avec L1 sondes rétrotransposition marqué au (ie, Sneo)
ATTENTION: Pour les sondes directes marqué, tenir à l'écart de la lumière à tout moment. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon d'obtenir et de faire des réactifs.- Ajouter 30 ng d'Sneo à un tampon d'hybridation, de la chaleur à 72 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir pendant 2 minutes à la température ambiante.
- Ajouter 30 pl de solution de sonde Sneo à each propagation, couvrir avec lamelle et sceller les bords avec du ciment en caoutchouc. Assurez-vous qu'aucune formation de bulles.
- Chauffer la lame à 72 ° C pendant 5 minutes sur un bloc de chaleur, baisse progressive de la température à 37 ° C, et incuber pendant une nuit dans une chambre humidifiée obscurité à 37 ° C.
- Lavage et Affichage (ou adjonction d'anticorps secondaire)
ATTENTION: Pour les sondes directes marqué, tenir à l'écart de la lumière à tout moment.
NOTE: Voir le tableau des matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon de se préparer. Utilisation d'un volume suffisant pour couvrir la totalité de la propagation des chromosomes est recommandé. Rappelez-vous que le volume excédentaire sera perdue lorsque la lamelle est ajouté.- Immerger les lames dans un tampon SSC 2x pour enlever des lamelles.
- Laver les lames par immersion dans un tampon de SSC 2x à 45 ° C pendant 5 min.
- Laver les lames par immersion dans un tampon de lavage à 45 ° C pendant 5 minutes, 2x.
- Laver les lames par immersion dans du tampon SSC 0,1x à 45 ° C pendant 10 min.
- Laver les lames par immersion dans un tampon SSC 2x à 45 ° C pendant 10 min.
REMARQUE: Placez un pot Coplin contenant du tampon recommandé dans un bain d'eau, régler la température à 45 ° C. - Refroidir les lames à température ambiante et équilibrer les lames dans le tampon de détection.
- Pour des sondes marquées directes, passez à l'étape 3.4.10.
- Pour des sondes marquées indirectes, bloc dans un tampon de blocage pendant 20-30 min et laver 3x dans DPBS.
- Incuber avec 50 pi d'anticorps secondaire (par exemple, 5 ug / ml de streptavidine-FITC, ou αCY3 dans un tampon de blocage) pendant 1 h.
- Laver les lames dans 2x SSC pendant 5 minutes deux fois.
- Counterstain avec Hoechst-33342 solution (0,1 pg / ml) pendant 10 min.
NOTE: cette coloration est fait pour colorer les chromosomes pour la co-localisation avec sonde. - Laver à DPBS 3x, ajouter une goutte de milieu de montage, placer une lamelle et sceller les bords avec du vernis à ongles.
- Analyser L1 retrotransposition en utilisant un microscope à fluorescence à 40X magnification.
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Representative Results
Un diagramme schématique du vecteur rétrotransposition L1 est présenté dans la figure 1. Le vecteur est constitué d'un gène de la néomycine dans l' orientation antisens par rapport à L1 ORFs qui est interrompu par un intron de globine dans l' orientation sens et pris en sandwich par les sites SD et SA. Quand intégré de façon stable dans un chromosome, L1 ARNm est transcrit à partir du promoteur CMV et le combiné L1-5'UTR (figure 1). Au cours du traitement de l'ARN, l'intron de globine est épissé du gène de la néomycine. Le néo- L1 ARN est emballé, transporté et intégré dans le génome soit comme une pleine longueur ou l' insertion tronquée. Comme indiqué précédemment , L1 rétrotransposition peut être suivi par FISH en utilisant des sondes spécifiques pour la néomycine épissés (figure 1).
La figure 2 montre une représentation schématique de la sonde à la néomycine, à l'labeled sondée qui est plus grand dans la taille et la fluorescence déficiente en raison des différences dans les longueurs d'onde d'excitation. Notez que le CY3 et FITC excitent à différentes longueurs d'onde que le bromure d'éthidium ADN coloré.
La densité de métaphase chromosomiques spreads a été déterminée en diluant la solution mère d'origine en 1: 2, 1: 4, 1: 8 et 1:16 dilutions et chaque écart évalué pour la densité, la distribution et la distance des écarts du noyau au grossissement 10X ( La figure 3A). Les résultats montrent une densité élevée, clumpy et éclatèrent spreads (figure 3A-i-ii), ainsi répartie aussi régulièrement et se propage bien espacées (figure 3A-III-IV). La faible densité se propage avec une distribution uniforme ont été choisis pour une analyse ultérieure.
spreads chromosomiques ont été colorées avec le colorant Hoechst et la propagation de qualité évaluée en fonction de la longueur des chromosomes, la rondeur des spreads et distance inter-chromosomique (figure 3B). Ces indices sont influencés par la durée pendant laquelle les cellules ont été traitées avec le colcémide, une solution hypotonique, d'une solution de Carnoy fixatif et / ou la manière dont les cellules ont éclaté pour libérer les chromosomes. Si les cellules ont été incubées pendant une courte période dans une solution hypotonique, étalements de chromosomes se sont étroitement noués et les chromosomes individuels étaient difficiles à visualiser (figure 3B-i). D'autre part, plus l' incubation dans une solution hypotonique a donné lieu à une rupture des noyaux, la dispersion des chromosomes et / ou une perte de chromosomes (figure 3B-ii). Les incubations plus longues dans le colcémide a augmenté le nombre de cellules en métaphase, mais conduisent à la condensation des chromosomes (figure 3B-iii). En tant que tel, une bonne répartition des chromosomes de qualité nécessite des périodes d'incubation optimales dans les deux colcémide et une solution hypotonique de KCl. Dans nos mains, une incubation de 90 min dans colcémide, 20 en solution hypotonique à 37° C et l'utilisation d'une vapeur chaude pour faire éclater les cellules se sont révélées être des conditions optimales pour la production des écarts de qualité élevée (figure 3B-iv).
Spreads chromosomiques ont été colorées pour L1 retrotransposition utilisant des sondes qui ciblent Sneo. La sonde a été marquée à la fois avec FITC et CY3 pour montrer que dans les deux cas L1 retrotransposition est perçue uniquement dans les cellules exprimant de type sauvage L1 (Figure 4). Aucune coloration n'a été observée dans les cellules exprimant le squelette du vecteur seul (Figure 4; comparer panneaux supérieur et inférieur pour chaque fluorophore). Dans nos mains, le signal de la sonde a été détectée dans 80-90% des noyaux, avec la majorité écrasante du signal représentant les événements rétrotransposition simples. Nous ne retrotransposition marqué dans les noyaux avec plus d'une insertion et la qualité de la propagation était toujours examiné avant FISH.
Figure 1. Représentation schématique du vecteur retrotransposition L1. Diagramme illustre le processus de cible de choix transcription inverse conduisant à des insertions de L1 complète ou tronquée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Étiqueté Sneo et sondes néomycine non marquées. La sonde marquée présente moins de fluorescence et est plus grand en taille par rapport à la sonde non marquée. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. contraste de phase (Bright Champ) et Hoechst tache chromosomiques spreads. A) Affiche la dilution des spreads pour obtenir des préparations bien espacées. La barre d'échelle est de 50 um. B) Hoechst tache chromosome montrant l'influence de colcémide, solution hypotonique, solution Carnoy fixateur et l'éclatement de la qualité de diffusion. La barre d'échelle est de 10 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Analyse FISH de L1 retrotransposition. Coloration de Sneo est absent dans les cellules témoins, mais présent dans les cellules exprimant vecteur de type sauvage L1. La barre d'échelle est de 10 um.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Des méthodologies telles que le séquençage du génome entier, PCR inverse et dans le sud - blot ont été utilisées pour étudier L1 retrotransposition. Bien que ces méthodes sont extrêmement utiles pour localiser où insertions L1 se produisent dans les génomes, un défi de confusion pour chacun d'eux est la nécessité pour la programmation in-silico pour réassembler des séquences. La méthodologie FISH décrite ici est conçue pour compléter ces méthodes, en particulier dans le cas des études nécessitant des analyses des ectopique retrotransposition L1 dans les cellules cultivées. L'approche peut être utilisée à la fois pour l'évaluation quantitative et qualitative des événements rétrotransposition et appliquée à des noyaux interphasiques. Cette méthodologie vante la précision des méthodes suivantes d'alignement de séquences in silico employées pour déterminer ectopiques sites d'insertion L1 16. L'alignement des séquences répétitives peut être ambiguë en raison de la formation d'homopolymères, tandis que séquen répétitifbureaux peuvent être perdus lors de l'amplification primaire du modèle résultant en sous-représentation des séquences répétitives. Méthodologie FISH peut surmonter ces problèmes parce que les sondes FISH peuvent recuire à des homopolymères et sont peu susceptibles d'être biaisés contre des séquences répétées intactes 16. En outre, par rapport aux essais de rétrotransposition à base de culture cellulaire, FISH peut déterminer les taux de rétrotransposition au niveau du noyau unique. En tant que tel, cette approche empêche à la fois sur et sous estimation des taux de rétrotransposition que de multiples insertions peuvent se produire dans les noyaux simples 16. Des données récentes obtenues à partir de NGS ont confirmé que la culture cellulaire des méthodologies basées sous - estiment les fréquences rétrotransposition 25.
On ne sait pas où les jeunes préfèrent CN1 à insérer et si un mécanisme de ciblage existe pour diriger ces insertions dans le génome. En utilisant la méthodologie ci - dessus , nous avons montré que L1 insère de préférence dans le gène pauvre regions du génome 16. D' autres ont montré que l'abondance des séquences L1 est augmentation des chromosomes avec une densité moindre gène 17,18. Ensemble, ces résultats suggèrent un mode régulé d'insertion où les menaces à la cellule sont minimisés par insertion de L1 dans des régions «moins actifs» du génome. Le modèle de mouvement de l'élément transposable dans les organismes inférieurs a apporté son soutien à cette interprétation. Par exemple, la levure de fission rétrotransposon, Tf1, intègre 95% du temps en amont de promoteurs de gènes et la majorité de ces gènes sont impliqués dans la régulation du stress 19,20. Dans les cellules de levure qui n'a pas accès à l' azote, TY5 intègre dans ORFs au lieu des régions d'hétérochromatine 21. Les expériences dans le maïs ont montré que l' intégration du transposon conduisent à l' ADN panaché phénotypes et l' intégration de l' ADN RRM Hatvine1-transposon dans la région de promoteur du gène VvTFL1A couleur de maïs a été montré influenzaeÇe le motif de ramification et la taille du fruit de la vigne 22,23.
Les étapes essentielles à la réussite de la méthodologie FISH détaillés ici sont la génération de bons étalements de chromosomes et l'étiquetage approprié, la purification et l'hybridation des sondes. Si les sondes ne sont pas nettoyés correctement, le signal de fond élevé résultant, il sera difficile de résoudre la sonde de liaison aux chromosomes. De préférence, les sondes doivent être purifiés sur gel pour éliminer la fluorescence résiduelle de dNTP. En outre, la durée pendant laquelle les pâtes à tartiner sont incubées dans une solution de Carnoy fixatif est important de préparer de bonnes étalements de chromosomes. Si elle est trop longue, la membrane cellulaire peut éclater prématurément et provoquer une perte de chromosomes. Si elle est trop courte, il peut être difficile d'obtenir des écarts appropriés en raison de la rupture des membranes déficiente. La quantité / concentration de formamide détermine la concentration des chromatides et il est donc important d'optimiser de manière empirique pour obtenir les meilleurs résultats. Tous les lavages doivent être approfondie pour ensure que toutes les sondes non liées et les anticorps secondaires sont lavés.
En conclusion, la méthodologie décrite ci - FISH peut être utilisée pour détecter à la fois pleine longueur et ectopiques événements rétrotransposition L1 tronquée et peut être appliquée à d' autres vecteurs de rétrotransposition en utilisant la protéine de fluorescence verte (GFP) en tant que cassette d'indicateur de rétrotransposition. Bien que des insertions L1 pleine longueur peut être déterminée à l' aide de cette méthode, il ne sera pas discerner les nouvelles insertions tronquées endogènes en raison du nombre de L1 tronquée de l' intérieur du génome. L'accessibilité de la sonde peut aussi être limitée par la formation augmentation de hétérochromatine 16,24. Cependant, l'inclusion de LNA dans les sondes FISH peut être utilisé pour améliorer la sonde recuit. La détection de Sneo est subordonnée à un cycle complet de retrotransposition et des insertions plus petites que la sonde / suppression peut être manquée.
Pour une description détaillée des expériences en which l'utilisation de ces vecteurs et l'expression des protéines L1 et retrotransposition se caractérisent, s'il vous plaît se référer à œuvres publiées 12,16.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêts potentiels.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
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