Summary
توفر الأحماض الدهنية فوسفورية المعلومات حول بنية المجتمعات الميكروبية التربة. نحن نقدم طرق لاستخراج عينات من التربة مع الكلوروفورم الخليط على مرحلة واحدة، تجزئة الدهون المستخرجة باستخدام الأعمدة استخراج المرحلة الصلبة، وتحلل الميثانول لإنتاج استرات الميثيل الأحماض الدهنية، والتي يتم تحليلها من قبل اللوني للغاز الشعرية.
Abstract
الأحماض الدهنية فوسفورية (PLFAs) هي المكونات الرئيسية لأغشية الخلايا الميكروبية. تحليل PLFAs المستخرجة من التربة يمكن أن توفر معلومات عن الهيكل العام للالمجتمعات الميكروبية الأرضية. وقد استخدم PLFA التنميط على نطاق واسع في مجموعة من النظم الإيكولوجية باعتبارها المؤشر البيولوجي للجودة التربة الشاملة، وكمؤشر كمي للاستجابة التربة لإدارة والضغوطات البيئية الأخرى بالهبوط.
الطريقة القياسية المعروضة هنا يحدد أربع خطوات رئيسية: 1. استخراج الدهون من عينات التربة مع مرحلة واحدة الكلوروفورم خليط، 2. تجزئة باستخدام الأعمدة استخراج المرحلة الصلبة لعزل الدهون الفوسفاتية من الدهون المستخرجة أخرى، 3. تحلل الميثانول من الدهون الفوسفاتية لإنتاج الأحماض الدهنية استرات الميثيل (جوع)، و4. تحليل FAME بواسطة اللوني للغاز الشعرية باستخدام كاشف اللهب التأين (GC-ااا). اثنين من المعايير المستخدمة، بما في ذلك 1،2-dinonadecanoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (PC (19:0/19: 0)) لتقييم الانتعاش العام للطريقة استخراج، وديكانوات الميثيل (MeC10: 0) كمعيار داخلي (ISTD) لتحليل GC.
Introduction
الأحماض الدهنية فوسفورية (PLFAs) هي جزء من الأغشية الخلوية الجرثومية من البكتيريا المجالات وحقيقيات النوى. الكائنات الحية الدقيقة تنتج PLFAs من أطوال سلسلة مختلفة والتكوين كوسيلة للحفاظ على سلامة خلايا الغشاء وظيفة الخلوية في استجابة للظروف البيئية فورية لهم. ومن هنا يمكن القول أن المجتمعات الميكروبية التي يتم فصلها جغرافيا ولكن يتعرضون لظروف التربة مماثلة والتعبير عن PLFAs ما شابه ذلك. تعتبر PLFAs التربة مع طول سلسلة بين 14 و 20 ذرة C عادة ما تكون في الغالب بكتيريا والفطريات أصل 1. في ثقافات متباينة، لا يمكن أن تستخدم تحليل PLFA لتحديد الأنواع الميكروبية الفردية، ولكنها يمكن أن توفر بصمة الشاملة للمجتمعات الميكروبية الموجودة في التربة. وبالإضافة إلى ذلك، منذ PLFAs ويتحلل سريعا على موت الخلايا، فإنها يمكن أن تعتبر ممثلة للمجتمع الميكروبية التربة قابلة للحياة 2. هذا تكوقد استخدم على نطاق واسع hnique لتوصيف التركيب الهيكلي من المجتمعات الميكروبية وجدت في مجموعة واسعة من البيئات، بدءا من الغابات 3-4 إلى 5-6 البراري والحقول الزراعية 7. وقد تم تطبيقه بنجاح في وصف استجابة التربة على الأرض التغييرات الإدارية، بما في ذلك الغابات إزالة الأشجار 8، 9 التجيير واستصلاح 10-12، فضلا عن الاضطرابات مثل الحرائق 13، التلوث بالمعادن 14 والهيدروكربونات 15، وتفشي الحشرات 16 .
تطور المنهج التحليلي المعاصر PLFA خلال العقود الستة الماضية من خلال العديد من التطورات الرئيسية من قبل عدد من المجموعات البحثية. في عام 1958، نشأ تحسنا كبيرا من ضبط الكلوروفورم: الميثانول: نسبة الماء في الحل استخراج لتحويل خليط من الطور إلى نظام ثنائي الطور 17. هذا الاستخلاص الدهون الأمثل وعزل المنقحة المواليةtocol أصبح يعرف باسم طريقة بلي وداير. اعتمد البروتوكول من قبل العديد من المختبرات على مدى العقود القليلة المقبلة، وخلال هذا الوقت، ساهمت الأبيض وزملاؤه التقدم الكبير للطريقة. على سبيل المثال، فإنها تحسن الخطوة الاستخراج عن طريق تبادل عازلة الفوسفات للمياه، وأنها الأمثل التحليل اللوني للغاز (GC) من خلال تحديد الذروة تعزيز وتقدير. ولعل من أكثر ملاءمة لعلوم التربة، وهي التي تحدد في عام 1979 أن نسبة الدهون المستخرجة يمكن أن تستخدم بمثابة مؤشر للبنية الجراثيم عندما درست الكتلة الحيوية الميكروبية من الرواسب البحرية 18.
حدثت تطورات أخرى في 1980s وأصبحت الطريقة المستخدمة على نطاق واسع في علوم التربة، وتحديدا فيما يتعلق ريزوسفير 19. في ذلك الوقت، وشملت طريقة nonadecanoate الميثيل (MeC19: 0) كمعيار داخلي 19 واستخدام عمود حمض السلسيليك لدهن تجزئة 21 </ سوب>. وبعد عمله مع الأبيض 19،21، عاد Tunlid إلى السويد والتي البحوث التعاونية مع البعث وFrostegård. عن طريق فحص كفاءة مخازن استخلاص مختلفة لمجموعة من التربة متفاوتة في محتوى المادة العضوية، وأظهرت المجموعة التي المخزن المؤقت سترات زيادة كمية الفوسفات الدهون المستخرجة مقارنة عازلة الفوسفات 22. وعلاوة على ذلك، على نشر 1993 23 بشأن تأثير الجير على المجتمعات الميكروبية التربة ذهب الى ان تصبح الكلاسيكية الاقتباس في علم الأحياء التربة والكيمياء الحيوية 24. تستخدم الباحثون تحليل المكون الرئيسي في معالجة البيانات الخاصة بهم. تحليل PLFA، كما تسمى الطريقة الآن، يولد مجموعات البيانات الكبيرة وكان استخدام الإجراءات الإحصائية المتغيرات المتعددة لمعالجة هذه البيانات المبتكرة للوقت وملهمة للكثيرين. وبالتزامن مع العمل الذي يجري في السويد، يجري التحقيق التعديلات على إجراء PLFA فيألمانيا Zelles وزملاؤه 25-26. والنسخة الخاصة من إجراء بارزة لاستخدامها للعمود استخراج المرحلة الصلبة (SPE) بدلا من العمود حمض السيليكونى ولكن، عموما، كان أكثر مختبر مكثفة.
ورقة Frostegård البالغ عددهم 23، جنبا إلى جنب مع منهجية مفصلة الأبيض وRingelberg 27، قدم الأساس للانفجار في استخدام تقنية PLFA للتحقيق في المسائل الأساسية في علوم التربة. ومنذ ذلك الحين، وشملت التحسينات مزيد من الطريقة التي فايرستون وزملاؤه إضافة معيار GC الداخلي (C10: 0) وC19: 0 كمعيار بديل لتحسين الكمي 28، والاستعاضة عن استخدام separatory مداخل للقارورة أسفل جولة لتبسيط استخراج 29. وفي الآونة الأخيرة، تشودري وديك 30 التحقيق في خطوة مثيلة وذكرت أن إجراءات مثيلة اثنين المستخدمة في أدبيات العلوم التربة KOH / MeOH طريقة الرمزified مجموعة أكبر من الأحماض الدهنية.
وتستند هذه الطريقة قدمت إلى حد كبير على طريقة الأصلي الذي وضعه بليغ وداير، ويتضمن التعديلات المذكورة أعلاه، مثل استخدام بالميثانول KOH للخطوة مثيلة. وتستخدم معيارين لكل عينة: معيار مركب 1،2-dinonadecanoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (PC (19: 0/19: 0))، والذي يضاف إلى عينة التربة قبل استخراج الأول لتقييم الكفاءة واسترداد البروتوكول بكامله، ومعيار صك ديكانوات الميثيل (MeC10: 0)، الذي يضاف قبل تحديد وتقدير من قبل القيادة العامة.
ونحن نعترف بأن طريقة PLFA يستخدم عادة من قبل العديد من المختبرات البيئة الميكروبية في جميع أنحاء العالم، ولقد تم توثيق عدة مرات، بما في ذلك من قبل المنظمة الدولية للتوحيد القياسي (2). الهدف من هذه الورقة هو تقديم وسيلة سهلة لمتابعة وقوية بروتوكول يمكن أن تكون مفيدة للتربةالعلماء الذين يحاولون معرفة تقنية PLFA.
Protocol
ملاحظة: تأكد دائما أن المناسبة معدات الوقاية الشخصية (PPE) يتم ارتداؤها في جميع أنحاء البروتوكول. لا ينبغي أن يكون لمست الأواني الزجاجية مع بأيديهم العارية. الدهون من الأصابع، والشعر، والشحوم والزيوت والمواد الهيدروكربونية كلها الملوثات المحتملة. دائما ارتداء قفازات النتريل قفازات وشطف مع 70٪ من الكحول عند التعامل مع الأواني الزجاجية النظيفة.
1. إعداد زجاجيات لتحليل
- الأواني الزجاجية يمكن التخلص منها (على سبيل المثال، أنابيب الطرد المركزي)
- التفاف في رقائق الألومنيوم والحرارة في الفرن دثر لمدة أربع ساعات ونصف في 450 درجة مئوية.
- تترافلوروإيثيلين (PTFE) -lined قبعات
- نقع مباراة دولية مع منتخب ساعة واحدة في المنظفات الفوسفات، ثم يغسل مع فرشاة فرك في الماء الساخن والمنظفات الفوسفات. شطف الصابون مع مياه الحنفية.
- مكان في حمام الحمضية (5٪ حمض الهيدروكلوريك) لمدة ساعة واحدة فقط (لا تترك لفترة أطول والمتشددين قد تسقط من القبعات إذا كانت غارقة لفترة طويلة جدا. شطف ثلاث مراتتوجد فى ماء الصنبور. شطف ثلاث مرات في الماء المقطر. الجاف في الفرن على حرارة 40 درجة مئوية.
- الأواني الزجاجية قابلة لإعادة الاستخدام (على سبيل المثال، 10 مل، 15 مل، 45 مل قارورة / الجرار)
- يغسل مع فرشاة فرك في الماء الساخن والمنظفات الفوسفات. شطف الصابون مع الاستفادة من المياه وتوضع في حمام الحمضية (5٪ حمض الهيدروكلوريك) بين عشية وضحاها. شطف ثلاث مرات في ماء الصنبور، ثم شطف ثلاث مرات في الماء المقطر، وجاف ثم في الفرن على حرارة 40 درجة مئوية.
- التفاف في رقائق الألومنيوم نظيفة (هي ملفوفة 50 مل الجرار على حدة ويتم لف الأواني الزجاجية آخرين على دفعات عينة، على سبيل المثال، 20) والحرارة في الفرن دثر لمدة أربع ساعات ونصف في 450 درجة مئوية.
- الأواني الزجاجية الحجمي (على سبيل المثال، الحجمي قارورة)
- يغسل مع فرشاة فرك في الماء الساخن والمنظفات الفوسفات. شطف الصابون مع الاستفادة من المياه وتوضع في حمام الحمضية (5٪ حمض الهيدروكلوريك) بين عشية وضحاها. شطف ثلاث مرات في ماء الصنبور، وشطف ثلاث مرات في الماء المقطر، وجاف ثم في الفرن على حرارة 40 &# 186؛ ج.
- قبل استخدام شطف 3 مرات مع كمية صغيرة من المذيبات (على سبيل المثال، والميثانول) - لا تترك الأواني الزجاجية الحجمي في الفرن دثر.
2. جمع وتجهيز عينات التربة قبل تحليل PLFA
- جمع عينات من التربة في أكياس معقمة، وإذا لم يمكن تحليل هذه فورا، تجميدها في أقرب وقت ممكن. تخزين العينات في الفريزر (-80 درجة مئوية) حتى على استعداد للمضي قدما مع التجفيف تجميد العينات. تجميد دفعات الجافة العينات التالية تعليمات مجفف التجميد.
- نقل كل عينة تجميد المجفف إلى حقيبة جديدة معقمة المسمى. تزن خارج عينة من المواد المجففة بالتجميد في كيس في أنبوب الطرد المركزي مكتوما قبل المسمى لاستخراج PLFA.
ملاحظة: توجيهي عام هو استخدام 0.5 غرام من المواد العضوية (الكربون المحتوى> 17٪ بالوزن) وتصل إلى 3.0 غرام للعينات التربة المعدنية. سجل عينة الوزن لكل عينة. - لكل 10 العينات، كما تزن خارجامكررة إضافية للتحليل، ولكل 20 عينة تشمل فارغة (أي أنبوب الطرد المركزي التي ليس لديها أي عينة في ذلك - تستخدم كوسيلة لمراقبة لتحديد أي تلوث محتمل أثناء عملية الاستخراج PLFA). دفعات عملية أنابيب العينات في نفس الوقت.
ملاحظة: هناك مجموعة من 20 عينة تتوافق مع مجموعة من 23 أنابيب العينات (عينات 1-10، مكررة واحدة من العينة 10، وعينات 12-22، مكررة واحدة من العينة 22، واحدة فارغة = دفعة من 23 أنابيب العينات).
ملاحظة: إجراء الاستخراج، ثم الانفصال، ثم مثيلة في دفعات من عينات قبل إعدادهم لتحليل GC وتشغيلها جميعا. وهذا يساعد على تحديد أين حدثت الأخطاء إذا كان أي شيء يذهب على نحو خاطئ، وربما يساعد في خفض عدد عمليات الاستخراج تكرار اللازمة.
3. PLFA تقنية (الخطوات لعينة الفردية ولكن كاملة دفعة واحدة كلها في وقت واحد)
ملاحظة: جميع الخطوات للتقنية PLFA هو موضح في خطوات1-3 أدناه ينبغي أن تجري في غطاء الدخان باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة وفقا للمبادئ التوجيهية السلامة المخبرية.
- استخراج (الخطوة 1):
- تحضير 5.0 M KOH عن طريق إذابة 14 جم من KOH في 50 مل المقطر والماء منزوع الأيونات (درهم 2 O).
- إعداد عازلة 0.15 M سترات عن طريق إذابة 31.52 غرام حامض الستريك مونوهيدرات في 400 مل من درهم 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 4.00 ± 0.02 بإضافة 5.0 M KOH. تقريبا سوف تكون هناك حاجة 45-50 مل من 5.0 M KOH لضبط درجة الحموضة إلى 4.00. عندما يتم ضبط درجة الحموضة، وتمييع عازلة سيترات إلى 1000 مل باستخدام قارورة حجمية. تخزين عازلة سيترات في الثلاجة عندما لا تكون قيد الاستعمال (لشهر واحد).
- إعداد يوميا الكمبيوتر (19: 0/19: 0) معيار بديل nonadecanoate عن طريق تمييع 250 ميكرولتر من محلول المخزون (10 ملغ / مل) في 25 مل الكلوروفورم (وهذا يوفر معيار بديل ما يكفي لصنع 23 عينة). إضافة 0.5 مل من الكمبيوتر (19: 0/19: 0) حل معيار بديل للأنبوب عينة الطرد المركزي.
- ادد من مستخلصة بليغ وداير على عينة التربة في الترتيب التالي: أ) 2.0 مل العازلة سيترات، والثاني) 2.5 مل الكلوروفورم، والثالث) 5.0 مل الميثانول. عينة كاب مع قبعة مبطنة PTFE ودوامة لمدة 30 ثانية؛ ضع في شاكر نهاية الإفراط في نهاية لمدة 2 ساعة.
- أجهزة الطرد المركزي في 226 x ج لمدة 15 دقيقة مع سقف. رسم طاف قبالة مع ماصة باستور ونقل إلى المسمى قارورة زجاجية 45 مل.
- إضافة الجولة الثانية من بليغ وداير مستخلصة لكل عينة، وكرر الخطوتين 4 و 5 أعلاه. رسم طاف قبالة مع ماصة باستور ونقل إلى نفس المسمى 45 قارورة مل الزجاج.
- إضافة إلى تسمية 45 مل زجاج القارورة التي تحتوي على طاف: أ) 5.0 مل الكلوروفورم، والثاني) عازلة 5.0 مل سترات. كاب مع الأبيض مبطنة PTFE سقف ودوامة زجاج قارورة لمدة 30 ثانية. السماح لها الجلوس بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في الظلام (لتجنب الأكسدة).
- فراغ بعناية قبالة المرحلة المائية العليا من قارورة 45 مل (إذا لم يكن فراغ متاح، ينبغي تخفيض ماصة من خلال aqueالمرحلة الأوس بعناية فائقة حتى لا يجمع أي في ماصة عندما pipetting لمرحلة العضوية). ماصة المرحلة العضوية أقل إلى صفت 15 مل قارورة.
- مكان دفعة من 15 مل قارورة تحت مضغوط N 2 (لتجنب الأكسدة) في درجة حرارة الغرفة. تتبخر الكلوروفورم قبالة ببطء، وتحديد تدفق N 2 إلى كشكش سطح السائل في قارورة ولكن ليس تسلق الجانبين من القارورة.
- المسمار على الغطاء وتخزين العينات مبطنة PTFE في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية ملفوفة في رقائق الألومنيوم (التفاف على دفعات وليس بشكل فردي) لتصبح جاهزة للشروع في الخطوة 2.
- الدهون التجزئة (الخطوة 2)
- وضع SPE صاحب عمود مع صنابير على الصهريج الزجاج. إدراج أعمدة SPE الجديدة (السيليكا، 500 ملغ، 6 مل) في صنابير. أعمدة التسمية عند الضرورة (مستحسن لتجنب الخلط بين العينات).
- شرط كل عمود بإضافة 5 مل من الأسيتون والسماح لها استنزاف من خلال، ثم قم بإضافة اثنين من الإضافات من 5 مل الكلوروفورم (الحجم الكلي = 10 مل). تسمح الثاني غسل الكلوروفورم لتتدفق حتى ~ 1 مم فوق فريت ثم إغلاق حنفية.
- إعادة حل العينة (المخزنة في 15 مل قارورة في نهاية الخطوة 1) وذلك بإضافة 0.5 مل كلوروفورم قارورة ودوامة بلطف. نقل العينة إلى العمود SPE باستخدام ماصة باستور إعادة حله؛ تكرار لما مجموعه 2 النقل (إجمالي حجم نقل 1 مل كلوروفورم لكل عينة).
- وضع عينة الدهون مباشرة إلى مركز العمود والسماح مذيب لاستنزاف تماما في الخزان.
- أزل الدهون محايدة بإضافة 5 مل من الكلوروفورم إلى كل عمود. السماح للمذيب لاستنزاف تماما في الخزان.
- أزل السكرية بإضافة 5 مل من الأسيتون إلى كل عمود. السماح للمذيب لاستنزاف تماما في خزان التجميع.
- إزالة العمود يقف من دبابات واستنزاف الخزان مع جهاز فراغ. إدراج رف مع أنابيب الطرد المركزي نظيفة وصفت في خزان. استبدال العمود الوقوف على دبابة. العمود المسمى أعلاه ينبغي أن يصطف مع الطرد المركزي المسمىأنبوب ifuge أدناه.
- أزل الفوسفورية في أنابيب الطرد المركزي بإضافة 5 مل من الميثانول إلى كل عمود. انتظر الأعمدة SPE لتجف في غطاء الدخان قبل التخلص منها. كسور فوسفورية أسفل الجافة في درجة حرارة الغرفة تحت N مضغوط 2.
- أنابيب تطهير مع N 2. المسمار على الغطاء وتخزين العينات مبطنة PTFE في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية ملفوفة في رقائق الألومنيوم (التفاف على دفعات وليس بشكل فردي) لتصبح جاهزة للشروع في الخطوة 3.
- مثيلة الدهون (الخطوة 3).
- بدوره على حمام ماء ساخن لتعيين 37 درجة مئوية. إعداد 1M حمض الخليك (إن لم يكن بالفعل) عن طريق إذابة 57.1 مل حامض الخليك الجليدي في 1000 مل درهم 2 O باستخدام 1000 مل قارورة حجمية. يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. .
- إعداد مجموعة من KOH الميثيلي. إعداد 0.2 حل M KOH عن طريق إذابة 0.45 ز KOH في 40 مل الميثانول. ضبط حجم KOH والميثانول وفقا لnticipated حجم الدفعة في الخطوة 3. إعداد هذا الحل يوميا؛ لا تخزن لفترات أطول.
- إزالة عينات (في أنابيب الطرد المركزي المخزنة بعد الخطوة 2) من الفريزر والسماح عينات أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 0.5 مل الكلوروفورم والميثانول 0.5 مل لكل عينة، تليها 1.0 مل بالميثانول KOH. أنابيب الغطاء بإحكام مع غطاء مبطنة PTFE. دوامة لخلط.
- وضع العينات مختومة في 37 حمام درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تأكد من أن مستوى المياه هو الحد الأدنى من 1-2 مم فوق مستوى السائل العينة. إزالة والسماح للعينات لتبرد. بينما العينات في حمام مائي، تسمية قارورة زجاجية صغيرة مع معرفات العينة (10 مل زجاج قنينة مع غطاء مبطنة PTFE).
- إضافة 2.0 مل الهكسان لكل عينة ودوامة. ثم يضاف 0.2 مل من حمض الخليك 1.0 M لكل عينة ودوامة لخلط مرة أخرى؛ وينبغي أن تصبح فصل المرحلة مرئية.
- إضافة 2.0 مل من O 2 درهم لكل عينة لكسر المرحلة. عينات دوامة لمدة 30 ثانية. ثم عينات الطرد المركزي في 226 x ج لمدة 2 دقيقة.
- عن طريققصيرة ماصة باستير، ونقل المرحلة العليا لتنظيف وصفت 10 مل قارورة. يجب الحرص على عدم نقل أي من المرحلة الدنيا (المائية).
- إضافة 2.0 مل الهكسان لكل أنبوب عينة الطرد المركزي ودوامة. عينات دوامة لمدة 30 ثانية. ثم عينات الطرد المركزي في 226 x ج لمدة 2 دقيقة.
- باستخدام قصيرة ماصة باستور، مرة أخرى إضافة للمرحلة الاولى لتسمية قارورة زجاجية 10 مل.
- تتبخر المذيبات في المسمى 10 مل قارورة زجاجية في درجة حرارة الغرفة تحت N 2. المسمار على الغطاء وتخزين العينات مبطنة PTFE في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية ملفوفة في رقائق الألومنيوم (التفاف على دفعات وليس بشكل فردي) لتصبح جاهزة للشروع في تحليل GC. تأكد من تسمية جميع العينات.
- الغاز اللوني (GC) تحليل
ويتم إنجاز تحديد وتقدير من PLFAs فرد باستخدام GC متصلة إما لااا أو للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد: ملاحظة. في حين أن التعليمات أدناه هي لGC-ااا، فإن إعداد العينات صالحة للGC-MS كما ثالذراع. ومن الأمثلة على انشاء لنظام GC-ااا تشمل 25 م × 0.2 مم × 0.33 ميكرومتر (5٪ -phenyl) عمود -methylpolysiloxane مع بروتوكول درجات الحرارة التالية: درجة الحرارة الأولية 190 درجة مئوية، المنحدر 10 درجة مئوية / دقيقة إلى 285 درجة مئوية ، عقد 9.5 دقيقة، منحدر 60 درجة مئوية / دقيقة إلى 310 درجة مئوية، وعقد 0.42 دقيقة 31.- إعداد معيار الداخلية GC (ISTD) وذلك بإضافة قطرة واحدة من MeC10: 0 (ديكانوات الميثيل) إلى 100 مل الهكسان (رقم قياسي يضاف الوزن إلى 0.1 ملغ). تشغيل الغازات GC ثم تشغيل GC. تأكد من أن H 2، N 2 واسطوانات الهواء مفتوحة وأنه لا يوجد ما يكفي من الغاز لتشغيل تحليل (H 2 لا ينبغي أبدا أن تحصل على أقل من 500 رطل لكل بوصة مربعة).
- تحقق من استيفاء شروط المعايرة جيدة عن طريق تشغيل معايير المعايرة التي تحتوي على مزيج من الأحماض الدهنية، تليها فارغة الهكسان. هوية الأحماض الدهنية الفردية يمكن يدويا المحال على أساس المقارنات مع الاحتفاظ مرات الحصول على المعايير، أو يمكن أن يكون هذا AUTOMATICAتعيين LLY باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا 31. في جميع الحالات، وتحديد لا لبس فيه يمكن تحقيقه باستخدام جهاز للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد 2.
ملاحظة: علامات إضافية لمعايرة جيدة تشمل خط الأساس شقة وعدم وجود تلوث في شطف الهكسان. - حل كل PLFA عينة بقايا (الواردة في 10 مل قارورة زجاجية من الدهون مثيلة الخطوة 3) في 150 ميكرولتر من الحل ISTD ونقل إلى قارورة GC (بدلا من استخدام 50-75 ميكرولتر إذا كان من المتوقع استجابة العينة إلى أن تكون ضعيفة، مثل جدا التربة الرملية).
- تعيين حجم حقن عينة إلى 2 ميكرولتر. ضبط درجة الحرارة ااا إلى 300 درجة مئوية. تشغيل العينات باستخدام درجة حرارة مدخل من 250 درجة مئوية، مع H 2 كما الغاز الناقل (معدل تدفق 1.3 مل / دقيقة) ونسبة الانقسام من 30: 1.
Representative Results
تصنف الأحماض الدهنية كما X: YωZ، حيث يمثل X عدد ذرات الكربون، Y يمثل عدد من الروابط الثنائية، وZ يشير إلى موقف الأول الرابطة المزدوجة من نهاية الأليفاتية (ω) للجزيء. لاحقات 'ج' و 'ر' تشير إلى رابطة الدول المستقلة وايزومرات هندسية العابرة. البادئات واللاحقات 'ا' و 'أنا' تشير إلى anteiso وايزو البيانات المتفرعة ووOH تحديد مجموعات الميثيل ومجموعات الهيدروكسيل، على التوالي.
المدى بعد القيادة العامة، والتحقق من أن عينات تلقت ISTD كاف من خلال النظر في 10: ذروة 0. تحقق أيضا استجابة للمعايير GC، أي قارورة تحتوي الهكسان مع حل ISTD المضافة؛ ينبغي أن يكون هؤلاء لم قمم أخرى. وينبغي أن تكون استجابة معيار الداخلية مماثل في جميع أشواط.
ويعرض الشكل 1 الممثلين،عينة المدى TIVE. يظهر الهكسان ذروة المذيبات كبيرة مميز في وقت الاستبقاء (RT) حوالي 1.8 دقيقة. ذروة ISTD القياسية (C10: 0) يظهر في RT 3.4 دقيقة، في حين C19: 0 لديه RT 16.2 دقيقة. تحليل GC يفصل PLFAs بناء على طول السلسلة، ومع سلاسل أطول يبلغ حجمه أكثر ببطء. على سبيل المثال، C18: 0 elutes في 14.4 دقيقة في حين C16: 0 elutes في 10.8 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن هذا البروتوكول التحليلي فصل PLFAs بناء على درجة من التشبع وموقف علاقاتهم مزدوج. على سبيل المثال، C18: 0 elutes في 14.4 دقيقة، في حين C18: 1 9C، وC18: 1 7C أزل في 14.0 و 14.1 دقيقة، على التوالي (الشكل 1). وأخيرا، PLFAs من طول مماثل سلسلة والتشبع ولكن التكوين المتفرعة مختلفة (anteiso مقابل ايزو) يمكن فصلها. على سبيل المثال، C15: 0I وC15: 0A أزل في 8.6 و 8.7 دقيقة، على التوالي (الشكل 1).
مجالات القمم GC مختلفة يمكن أن يكون ايماستدار إلى جدول لمواصلة معالجة المعلومات اللوني الغاز. وكميا كل PLFA المحددة (نانومول ز -1 من التربة الجافة) باستخدام المعادلة التالية:
حيث F هو عامل تعديل يأخذ بعين الاعتبار الانتقائية ااا والخلافات المولية بين الأحماض الدهنية 32، areaPLFA هي منطقة ذروة لكل حددت PLFA، areaC10: 0 هو منطقة ذروة لISTD (MeC10: 0)، C10: 0 ونسبة الأمراض المنقولة جنسيا وأضاف هو مقدار ISTD (نانومول) يضاف إلى كل عينة قبل تشغيل GC (C19: وأضاف 0 الأمراض المنقولة جنسيا / C19: 0 العينة) يتوافق مع انتعاش الكمبيوتر (C19: 0 / C19: O) معيار بديل، ووزن العينة كمية المجفف فرن التربة (ز) إضافة إلى أنبوب عينة الطرد المركزي الأصلي وتستخدم لاستخراج PLFAs.
ملاحظة: المناطق الخاضعة لاح يتم التعبير عن قمم الإقليم الشمالي كمناطق الذروة، استجابة أو رد فعل٪ اعتمادا على نظام GC. ضمن مجموعة ذات الصلة التربة PLFA توصيف والمناطق يمكن أن يفترض أن يكون خطيا متناسبة مع الأوزان من الأحماض الدهنية. بدلا من ذلك، يمكن تطبيق عوامل التصحيح صغيرة لحساب ااا الانتقائية 32. وبالإضافة إلى ذلك، لأن النتائج التي أعربت في البداية على أساس الوزن في المئة، وأنها تحتاج إلى تطبيع لانتاج كميات المولي. ضبط ليتحقق من خلال مراعاة الأوزان الجزيئية من الأحماض الدهنية الفردية الخلافات المولية. الجداول المنشورة 32 و البرمجيات التجارية 31 متوفرة للمساعدة عندما تطبيع للالمولية أيضا.
كمية ISTD (نانومول) يضاف إلى كل عينة يمكن زيادة تحسب على النحو التالي:
(وأضاف STD) 0std أضاف = [ISTD] × V: C10
ithin الصفحات = "1"> حيث [ISTD] هو تركيز (نانومول -1 لتر) من MeC10: 0 (ديكانوات الميثيل) الذائب في الهكسان (انظر الخطوة 3.4.1)، والخامس (المضافة STD) هو حجم (L) من حل ISTD استعداد يضاف إلى كل عينة قبل تشغيل GC (أي 150 ميكرولتر وفقا لالخطوة 3.4.4).
كمية C19: 0 (نانومول) موجودة في كل عينة خلال تحليل GC يتوافق مع:
حيث areaC19: 0 هو منطقة ذروة C19: O، في حين أن المبلغ المقابل من C19: 0 (نانومول) يضاف إلى كل عينة في بداية طريقة استخراج PLFA (راجع الخطوة 3.1.3) هو:
حيث [19: 0] الأمراض المنقولة جنسيا (ملغم لتر -1 (19: 0 وأضاف الأمراض المنقولة جنسيا) وحجم معيار بديل استعداد إضافة إلى كل عينة في بداية استخراج PLFA طريقة (راجع الخطوة 3.1.3)، M 19: 0 هو الوزن الجزيئي لل1،2-dinonadecanoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (PC (19: 0/19: 0)).
ملاحظة: الخلد واحدة من C19: 0 nonadecanoate العوائد القياسية البديلة اثنين من مولات C19: 0 بعد خطوة مثيلة، في حين أن C10: يضاف 0 القياسية بعد مثيلة.
وعادة ما يتم استبعاد PLFAs التالية من تحليل المجتمعات الميكروبية التربة: ط) PLFAs التي هي <14 C و> 20 درجة مئوية في الطول، والثاني) PLFAs مع أقل من 0.5٪ من المجموع في منطقة الذروة. مرة واحدة وقد تم استبعاد هذه PLFAs، ردود من جميع PLFAs المتبقية يمكن تلخيص للحصول على مجموع ثنائية PLFAomass (نانومول ز -1 من التربة الجافة). تحليل أحادي المتغير من البيانات PLFA (على سبيل المثال، أنوفا، بعد تحول البيانات المناسبة لتلبية الافتراضات الاختبار التي يتم تنفيذها) يمكن استخدامها للمقارنة بين إجمالي الكتلة الحيوية PLFA و / أو PLFA الكتلة الحيوية لمجموعات مختارة من بين مجموعة عينة / العلاج. على سبيل المثال، الشكل 2 يعرض نتائج التوزيع النسبي للجماعات PLFA مختلفة، مثل PLFAs مباشرة المتسلسلة المشبعة، PLFAs مشبعة إما منتصف سلسلة (10-الميثيل) أو المتفرعة المحطة، وأحادية أو PLFAs المتعددة غير المشبعة، وكذلك مجموع إجمالي PLFAs (نانومول ز -1 من التربة الجافة). في هذا المثال بالذات، عمر الأشجار (مما يقلل من الموقع 1 إلى الموقع 3) وينظر إلى تأثير كل من مجموعه PLFAs والتوزيع النسبي للجماعات PLFA مختلفة.
لتقييم أنماط الشاملة في تكوين PLFA بين العينات، التحليل متعدد المتغيرات من كل PLFAs يمكن أن يكون conduالمديرية 33. تحتاج البيانات PLFA أن تتحول عند الضرورة قبل التحليل متعدد المتغيرات المختارة على أنها تفي افتراضات الاختبار الإحصائي ومسألة البحوث التي تناولت، على سبيل المثال، غالبا ما يستخدم هذا التحول هيلفينغير إلى نسبية البيانات. ويبين الشكل 3 نتائج من غير -metric التوسع متعدد الأبعاد (المأخوذة على صعيدي) التنسيق من نفس البيانات التي تم استخدامها في الشكل 2. المأخوذة على صعيدي هو غير حدودي، تقنية المتغيرات المتعددة التي تنتج المواقع 2- أو 3 الابعاد من نقاط البيانات على أساس تشابه مرتبة العشرات بين العينات.
الشكل 1. الممثل GC-ااا اللوني. عينة تم الحصول عليها من التربة براون Chernozemic المزروعة واستخدم لهذا التحليل. مرات الاحتفاظ وPLFAs المقابلة (بين قوسين) وذروتها منطقة ل(PA)إعادة مبين في الشكل لقمم التمثيلية. من أجل الوضوح، مبينة ليس كل القمم على الشكل، على الرغم من أن هذه العينة معينة أسفرت عن 33 PLFAs التي تم تحديدها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الوفرة النسبية من ست فئات مختلفة من PLFAs (٪ من إجمالي PLFAs)، ومجموع الكتلة الحيوية PLFA (نانومول ز -1 من التربة الجافة). عينات من التربة Luvisolic الغابات استخدمت لهذا التحليل. وتشير نتائج أكبر مجموعه PLFAs للتربة في الموقع 1، الذي يقع تحت الأشجار القديمة (> 50 سنة)، تليها (25 عاما) المتوسطة الذين تتراوح أعمارهم بين الأشجار (موقع 2)، وأخيرا أصغر (10 عاما) أشجار ( موقع 3). نسبيا PLFAs أكثر المشبعة موجودة في أصغرالموقع، بينما هي موجودة في أقدم موقع أكثر PLFAs غير المشبعة. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. عدم متري التوسع متعدد الأبعاد (المأخوذة على صعيدي) رسامة PLFAs (باستخدام٪ من مجموع بيانات PLFAs) لمحاور 2 و 3 من محلول 3-الأبعاد. وقد تم حساب هذا التنسيق باستخدام نفس البيانات عن تلك المستخدمة في الشكل 2، و أصغر الموقع (موقع 3) يفصل بشكل واضح جدا من الموقعين القديمة (مواقع 2 و 3)، والتي تظهر تداخل في PLFA الميكروبي تكوين مجتمعهم. كمية من التباين في البيانات المجتمع PLFA يفسره كل محور يتم تضمينها في أقواس. وأوضح 72.5٪ من التباين من قبل هذين المحورين عن dimen 3ظائف الفئة حل المأخوذة على صعيدي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
لتقليل وتجنب سوء تفسير البيانات PLFA، ويجب أن يتم فحص البيانات الحذر لأن بعض PLFAs التي توجد في المجتمع الميكروبي للتربة موجودة أيضا في الكائنات حقيقية النواة واحدة ومتعددة الخلايا، مثل جذور النباتات والطحالب، والحيوانات التربة. وبالإضافة إلى ذلك، العتائق لا تحتوي على PLFAs. بدلا من ذلك، وتتكون الأغشية archaeal من الدهون الأثير فوسفورية (PLELs). وبالتالي، فإن بروتوكول PLFA لا يمكن أن تستخدم لوصف المجتمعات archaeal في التربة.
ربط PLFAs فرد إلى مجموعة ميكروبات معينة يجب أن تمارس بحذر (انظر النشر 2011 من قبل Frostegård وزملاؤه 34 لمناقشة ممتازة من بعض القيود المفروضة على طريقة PLFA). بدلا من ذلك، قد يكون من الأنسب، كما حدث في الشكل 2، لPLFAs مجموعة على أساس التركيب الكيميائي لها، على سبيل المثال، ط) بالسلاسل مستقيم PLFAs المشبعة، والثاني) PLFAs مشبعة منتصف تشاين (10-الميثيل) المتفرعة، ج) متفرعة من شفائهم الأحماض الدهنية المشبعة، والرابع) PLFAs غير المشبعة الاحادية، والخامس) PLFAs المتعددة غير المشبعة، والسادس) الأحماض الدهنية هيدروكسي.
قد تحتاج إلى تعديل بناء على كمية من PLFAs للاستخراج الواردة في عينة تربة معينة وزن العينة. من خلال عدم ضبط كمية من التربة المستخرجة في أقل بالميكروبات التربة النشطة، مستخدمين معرضون لخطر عدم الحصول على عدد كاف من الردود PLFA (قمم) لتمثيل بدقة المجتمع الميكروبي بشكل عام. في التربة عالية النشطة بالميكروبات مع تركيزات عالية من PLFAs، المستخدمين معرضون لخطر الحمل الزائد العمود GC، وبالتالي منع التقدير الدقيق PLFAs. في كلتا الحالتين، وعينات من التربة ويجب إعادة تحليل لPLFAs. وهناك نقطة انطلاق جيدة لإضافة 0.5 غرام لعينات التربة العضوية (مثل الأرضيات الغابات)، وحوالي 3 جم للعينات التربة المعدنية. منذ كمية PLFAs للاستخراج عادة المترابطة لكمية الكربون العضوي الواردة في التربة، عينة نحنآيت يمكن تعديلها بناء على محتوى الكربون في التربة، على سبيل المثال، 1 غرام من عينة التربة المعدنية قد تكون كافية للحصول على القياس الكمي PLFA جيد عندما محتوى الكربون هو 10-15٪، في حين> 5 ز قد يكون ضروريا إذا كان محتوى الكربون ≤ 0.5 ٪. هو دائما فكرة جيدة للقيام التشغيل التجريبي مع بعض العينات لتحسين وزن العينة قبل تشغيل المجموعة بالكامل.
استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها مشتركة لبروتوكول PLFA وتحليل GC هي على النحو التالي. إذا كان خط الأساس GC اللوني مرتفع جدا، يجب تغيير اسطوانة غاز H 2. إذا القمم المذيبات أو ISTD مفقودة من اللوني، قد يكون هناك مشكلة مع حقن عينة (على سبيل المثال، توصيل حقنة، مشكل مع الاوتوماتيكى، قارورة فارغة أو في عداد المفقودين، خطأ مع المواقع قارورة). إذا تم الكشف عن أكثر من ثلاث قمم الفراغ طريقة / عينة، هناك تلوث فارغة، وهناك احتمال كبير أن نفس المادة الملوثة (ق) وسوف تكون موجودة في عينة GC جhromatograms. العثور على مصدر للتلوث (وسائل الإعلام عادة مائي)، أو على أقل تقدير، وضمان أن تتم إزالة قمم المقابلة لالملوث من الاستشرابية العينة والتي لا يتم تضمين هذه القمم في أي تحليل إحصائي للبيانات PLFA. أيضا، انها فكرة جيدة لتشغيل الهكسان يشطف بين العينات عند الاشتباه المرحل. سوف قمم إضافية في شطف الهكسان تشير المرحل (أي المكونات الأثقل يبلغ حجمه من تشغيل سابق).
الدهون هي عرضة بشكل خاص للأكسدة، وتحتاج إلى عناية خاصة لأن تمارس في جميع أنحاء بروتوكول لحماية عينات من التعرض للهواء والضوء، مثل تخزينها في الظلام وابقائها تحت النيتروجين. جميع العينات والفراغات يجب أن يكون C19 كاف: 0 معيار بديل. وC19 مفقود: 0 الذروة، في أي عينات أو الفراغات، ويشير إلى انتعاش الفقراء أو خسارة كاملة من التحاليل. رد من C19: 0 في العينات التي هي أقل بكثير من مالفراغات ethod / عينة تشير إلى فقدان التحاليل في مرحلة ما في منهجية PLFA. عندما تواجه مع الفقراء C19: 0 الانتعاش، وجميع جوانب الإجراء يجب أن تكون مدروسة بعناية وفحصت بما في ذلك استخراج الأولي، جميع مراحل نقل العينات وSPE، الأحماض الدهنية مثيلة، والتجفيف والتخزين والتلاعب عينة من أجل عزل مرحلة أو مراحل حيث خسر التحاليل. من ناحية أخرى، قد يكون من أن استخراج بعض عينات من التربة قد تسفر C19: 0، التي قد تكون المبالغة الانتعاش حالة معيار بديل. أثناء استخدام معيارين ((PC (19: 0/19: 0) وMeC10: 0) ليس شرطا مطلقا، وجدنا أن تكون مفيدة جدا عند الحاجة إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها طالما أن MeC10: 0 استجابة كافية ، يمكن استكشاف الأخطاء وإصلاحها التركيز على الخطوات السابقة لتحليل GC.
كما ذكر سابقا، يجب توخي الحذر عند تفسير البيئية أهمية والنظام البيئي علاقات تستند فقط على المؤشرات الحيوية تنبعد من البيانات PLFA، لأن الدراسات ثقافة نقية تكشف عن أن سلالات بكتيرية معزولة سيحتوي فئات مختلفة من PLFAs. بدلا من ذلك، ينبغي أن ينظر PLFAs العلامات البيولوجية باعتباره إضافة مفيدة في مجموعة من الأدلة عند اتخاذ الاستدلالات البيئية الأوسع. في الأدب، وقد اقترحت PLFAs الفرد والاستفادة منها المؤشرات الحيوية للمجموعات الميكروبات المختلفة. وتستخدم PLFAs المشبعة عادة لتمثيل البكتيريا إيجابية الجرام وغير المشبعة الاحادية PLFA تستخدم لالبكتيريا سالبة الجرام. وتشمل المؤشرات الحيوية المعترف بها للبكتيريا سالبة الجرام غير المشبعة الاحادية الأحماض الدهنية مع التشبع في ω5 أو موقف ω7، مثل C16: 1ω7، C18: 1ω7، وC18: 1ω5. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون الأحماض الدهنية cyclopropyl أيضا ممثل من البكتيريا سالبة الجرام 35. وبالتالي، يمكن حساب PLFAs من البكتيريا سالبة الجرام كما يساوي مجموع A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. المؤشرات الحيوية المعترف بها للبكتيريا إيجابية الغرام وتشعبت عضال ساالأحماض الدهنية turated، مثل C15-تشعبت ايزو: 0I، C16: 0I، C17: 0I. أو anteiso-تشعبت، مثل C15: 0A وC17: 0A. المشبعة PLFAs مع منتصف سلسلة (10-الميثيل) المتفرعة، مثل 10Me16: 0 و10Me18: 0 موجودة مميز في الشعاعية 36. وهكذا، PLFAs من البكتيريا إيجابية الجرام يمكن أن تحسب على قدم المساواة لمجموع A: 0 (ISO، ANTEISO، 10-الميثيل).
في كثير من الأحيان غير مشبع العديد من المؤشرات الحيوية المرتبطة الفطرية PLFA، ولكنها غير المشبعة الاحادية بعض المؤشرات الحيوية الفطرية. على سبيل المثال، من حيث المؤشرات الحيوية غير المشبعة الاحادية الفطرية، C16: تم التعرف 1ω5 كمؤشر على الفطريات كببياوات (AMF) 37، C18: 1ω9 هو شائع في الفطريات بالارتمام، وectomycorrhizae تحتوي عادة على C16: 1ω9. وجود دى غير المشبعة C18: 2ω6،9 غالبا ما يحدث بالتزامن مع C18: 1ω9 وأيضا يرتبط بشكل جيد مع إرغوستيرول ستيرول الفطرية، مما يدل على أن C18: 2ω6،9 يمكن أن تمثل على نحو كاف ectomycorrhizae والفطريات بالارتمام 38. والثلاثية غير المشبعة C18: 3ω 6،9،12 كما تم استخدام العلامات البيولوجية للفطريات 10؛ ومع ذلك، C18: 3ω6c يمكن العثور عليها في الكائنات الحية حقيقية النواة الأخرى بما في ذلك النباتات والطحالب، وعلى الرغم من أنه عادة لا توجد في البكتيريا. في فترة الأولانيات التربة، C20: لقد تم الاعتراف 4ω6c والعلامات البيولوجية أولاني 39، على الرغم من أعمال أخرى فشلت في كشف C20: 4ω6c حتى عندما تأكدت السكان أولاني قابلة للحياة بصريا باستخدام المجهر الضوئي 40.
وتتناول العديد من الدراسات البيئية الأسئلة المتعلقة المجتمع الميكروبي للتربة العام من خلال الاستفادة من تقنيات التنسيق متعدد المتغيرات كأداة تحليل البيانات PLFA. عند استخدام هذا النهج، وقد اختار بعض الكتاب لاستبعاد PLFAs نادرة من مجموعة البيانات عن طريق إزالة PLFAs التي تكون موجودة في أقل من 5٪ من العينات 4. والتشبع العادية C16: 0 و C18: 0 وفيرة في جميع الكائنات المجهرية في التربة، بما في ذلك بدائيات النوى وeukaryotes. وبالتالي، واختيار بعض الباحثين لإزالة هذه PLFAs قبل التحليل الإحصائي على أساس أنها قد لا تكون مؤشرات حساسة من تكوين المجتمع الميكروبي للتربة - على الرغم من C16: 0 و C18: 0 لا تزال ليتم تضمينها عند تلخيص كل PLFAs ل مؤشر الكتلة الحيوية الميكروبية. في المدى التحليلات الإحصائية، واختيار العديد من الباحثين لإجراء غير متري التوسع متعدد الأبعاد (المأخوذة على صعيدي) التنسيق لأن هذا الأسلوب هو مناسبة تماما للبيانات التي قد لا تكون موزعة بشكل عادي 33. ويمكن أن تشمل تحليلات إضافية تتعلق المتغيرات الفئوية تحليل أنواع المؤشرات، التي يمكن أن تتصل وقوع PLFAs الخاصة التجمعات الفئوية وإجراءات الاستجابة التقليب متعددة (MRPP)، والتي يمكن أن تساعد في تحديد أوجه التشابه أو الاختلاف بين المجتمعات الميكروبية المخصصة للمجموعات الفئوية. بالإضافة إلى ذلك، وأشجار الانحدار متعدد المتغيرات (MRT) يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص عندما يكون تأثير المتغيرات التجريبية متعددة أوالعلاج يجب تقييم كمتغيرات تفسيرية محتملة 5 (على سبيل المثال، قوام التربة والرطوبة، عمر استصلاح).
بمجرد إنشائه، وبروتوكول PLFA هي طريقة تحليلية بسيطة نسبيا والتي يمكن أن تكون مفيدة جدا عند قياس استجابة ميكروبات التربة للتغيرات البيئية واضطراب البشري. في حين التقنيات الجزيئية مثل البصمة الوراثية هي أكثر ملاءمة لتوصيف مفصل من المجتمعات الميكروبية، ويعرض طريقة PLFA ميزة توفير معلومات كمية عن إجمالي الكتلة الحيوية الميكروبية 34. في مختبر أبحاث لدينا، شخص واحد يمكن تجهيز مريح مجموعة من 20 عينات على مدى 4 أيام، وقد وجدنا بروتوكول المقدمة هنا أن تكون تقنية قوية وقابلة للتكرار لتقييم الجودة البيولوجية للتربة.
قوة طريقة PLFA يمكن تمديدها إلى حد كبير من قبل اقتران ذلك إلى تحليل النظائر المستقرة 41، 42. وعلى وجه التحديد، بالإضافة سو 13 ركائز المسمى C إلى التربة تسمح لتقدير التأسيس الركيزة في الكائنات المجهرية في التربة على الرغم من تحليل النظائر من PLFAs فرد 41. وبالإضافة إلى ذلك، يبدو أن هذا الأسلوب ليكون أداة واعدة جدا لتوضيح الروابط الغذائية في التربة شبكات الأغذية 42.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter - Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µl gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection - 2 bags required per sample collected |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
- ISO/TS 29843-1: 2010-Soil quality-determination of soil microbial diversity. , ISO/TC. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.iso.org/iso/home.htm (2010).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
- McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
- Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
- McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
- Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
- Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
- Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
- Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
- Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
- Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
- Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
- Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
- Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
- Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
- White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
- Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
- Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
- Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
- Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
- Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
- Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
- White, D. C., Ringelberg, D. B. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. , Oxford University Press. New York. 255-272 (1998).
- Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
- Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
- Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , Woodhead Publishing Ltd. Cambridge, UK. 159-180 (2010).
- McCune, B., Grace, J. B. Analysis of ecological communities. , MjM Software Design. Oregon. 300 (2002).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
- Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
- Brennan, P. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. Ratledge, C., Wilkinson, S. , Academic Press. London. 203-298 (1988).
- Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
- Frostegård, Å, Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
- Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
- Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).
