Summary
Flexorpezen in de hand worden vaak gewond, wat leidt tot een verminderde handfunctie. Echter, het littekenweefsel genezende reactie niet goed gekarakteriseerd. Een muizenmodel van flexorpees genezing is hier gedemonstreerd. Dit model kan algemeen begrip van het genezingsproces te verbeteren en therapeutische benaderingen om de genezing te verbeteren beoordelen.
Abstract
Pees verbindt het skelet spieren en botten, het vergemakkelijken van de beweging van bijna het hele lichaam. In de hand, flexorpezen (FTS) maken buiging van de vingers en de algemene handfunctie. Verwondingen aan de FTS komen vaak voor, en bevredigende genezing wordt vaak aangetast als gevolg van teveel littekenweefsel en verklevingen tussen de pees en het omringende weefsel. Er is echter weinig bekend over de moleculaire en cellulaire componenten van FT reparatie. Daartoe een muizenmodel van FT reparatie die vele aspecten van genezing bij de mens, waaronder verminderde beweeglijkheid recapituleert en verminderde mechanische eigenschappen, ontwikkeld en eerder beschreven. Hier een diepgaande demonstratie van deze chirurgische procedure verschaft, waarbij doorsnijding en daaropvolgende reparatie van de flexor digitorum longus (FDL) pees in de achterpoot van muizen. Deze techniek kan worden gebruikt om lineage analyse van verschillende celtypen te voeren, de effecten van gen winst of verlies-van-functie getest, en de effi testenciëntie van farmacologische interventies in het genezingsproces. Er zijn echter twee belangrijke beperkingen aan dit model: i) het FDL pees in het middengedeelte van het muizen achterpoot, waarbij de doorsnijding en reparatie optreden, wordt niet omgeven door een synoviale schede. Derhalve Dit model houdt geen rekening met de mogelijke bijdrage van de mantel om de littekenvorming proces. ii) Om de integriteit van de reparatieplaats beschermen, is de FT vrijgegeven op het myotendinous knooppunt, het verminderen van de mechanische krachten van de pees, waarschijnlijk bijdragen aan de grotere littekenvorming. Isolatie van voldoende cellen van het granulatieweefsel van de FT tijdens het genezingsproces voor flowcytometrische analyse moeilijk gebleken; cytologie centrifugatie aan deze cellen concentraat is een alternatieve methode, en zorgt voor het genereren van celpreparaten, waarop immunofluorescentie labeling kan worden uitgevoerd. Met deze methode kwantificering van cellen of eiwitten van belang tijdens FT genezing mogelijk.
Introduction
Flexor pezen in de hand werken samen met de flexor spieren van de onderarm en digitale omhulsels flexie van de cijfers en grijpfunctie van de hand mogelijk. Flexorpezen lopen langs de palmaire aspect van de hand; deze relatief oppervlakkige locatie resulteert vaak in verwondingen aan de flexorpezen tijdens trauma aan de kant. Pezen genezen door middel van een littekenweefsel respons in plaats van regeneratie van normaal peesweefsel 1. Hoewel dit littekenweefsel biedt continuïteit van de pees, wordt de functie drastisch afgenomen ten opzichte van een gezonde pees. Pees-littekenweefsel composieten worden gekenmerkt door een verminderde mechanische eigenschappen 1, waardoor het gerepareerde pezen meer kans op scheuren. Bovendien littekenweefsel mist de organisatie van het natieve collageen pees vezelstructuur, resulterend in een toename van de pees grootte en massa. Gezien de anatomische beperkingen van de pees-hulseenheid zelfs bescheiden toename pees grootte kunnen drastisch rodeUCE de glijdende functie van de pees, en dus digit bereik van de beweging en handfunctie.
Voorafgaand aan de verwondingen 1960 om de pezen, met name in zone II van de hand, niet routinematig gerepareerd vanwege de ernstige complicaties bij de genezing die zich tijdens deze reparatie 2. Dit gebied van de hand werd aangeduid als 'niemandsland' 3. Echter, zijn verbeteringen in chirurgische technieken, hechtdraad patronen en fysiotherapie revalidatie protocollen sterk verbeterde resultaten van flexorpees reparaties 2. Ondanks deze vooruitgang, tot 40% van reparaties leiden tot voldoende adhesie formatie handfunctie 4 belemmeren. Daarom is een biologische benadering bij genezing verbeteren. Helaas, zeer weinig bekend over de pees genezingsproces op cellulair en moleculair niveau. Derhalve was het doel een murine model dat kan worden gebruikt om de fundamentele understandin ontwikkelen ter verbeteringg de cellulaire en moleculaire componenten van buigpees genezing en littekenvorming respons, als middel om nieuwe therapeutische targets te identificeren om genezing te verbeteren.
Grotere diermodellen zijn instrumenteel in het bevorderen van begrip van de flexorpees genezingsproces geweest. Honden en konijnen studies hebben aangetoond dat zowel de intrinsieke als extrinsieke herstellend vermogen van pezen 5,6, het belang van vroegtijdige gecontroleerde passieve beweging minimaliseren adhesies opzichte van immobilisatie 7, evenals de effecten van verschillende patronen op de hechtdraad genezingsproces 8 , 9. Bovendien heeft het hondenmodel bruikbaar bij testen translationele weefselmanipulatie benaderingen genezing 10 verbeteren. Er zijn echter een aantal belangrijke voordelen in het gebruik van een muizenmodel opzichte van een groot diermodel, zoals de relatieve kosten, beschikbaarheid van muis specifieke reagentia en het gemak van generating globaal Knock-outs of weefsel-specifieke schrapping / overexpressie constructen. Bovendien is de functionele overeenkomst tussen menselijk en muizen ten opzichte flexorpezen 11 geven de potentiële bruikbaarheid bij de ontwikkeling van een muismodel.
Ontwikkeling van een muizenmodel van flexorpees doorsnijding en reparatie bootst vele aspecten van klinische genezing, met inbegrip van de vorming van overvloedige littekenweefsel en verminderde mechanische eigenschappen. De hier beschreven model is een echte herhaling van klinische praktijk door doorsnijden van de FDL de myotendinous knooppunt om de reparatieplaats beschermen. Bovendien heeft dit model geen rekening met de bijdrage van synoviale cellen huls wordt genezing, aangezien er geen synoviale schede die het middengedeelte van de pees waar de reparatie plaatsvindt. Ondanks deze beperkingen heeft dit model het voordeel van het genereren bereik van beweging te beperken adhesies, die nog moet worden aangetoond bij muizenmodellen die meer closely benaderen de klinische scenario. Dit model is gebruikt om knock-out muismodellen 12,13 beoordelen en om verschillende farmacologische benaderingen om de genezing 14-17 te verbeteren testen. Histologische analyses van dit model, middels immunohistochemie en in situ hybridisatie, kunnen belangrijke inzichten in de lokalisatie van belangrijke genen en eiwitten bieden tijdens de genezing. Echter, histologie geeft slechts een dwarsdoorsnede ruimtelijke analyse en maakt kwantificering niet mogelijk het gehele weefsel. Flowcytometrie is een meer kwantitatieve benadering, maar slechts een zeer beperkt aantal cellen kunnen worden geïsoleerd uit de genezing peesweefsel in het muismodel, en dit aantal verder af tijdens fixatie, permeabilisatie en wasstappen. Neemt dit in rekening flowcytometrie wordt een benadering onhaalbaar als gevolg van het aantal dieren dat nodig zou zijn. Een alternatieve methode moet de meerderheid van dit kleine celpopulatie behouden omverder karakteriseren genezing milieu. De methode die wordt gebruikt om dit te bereiken, hier afgebeeld, houdt de concentratie van de geïsoleerde cellen via cytologie centrifugeren op een glasplaatje, gevolgd door immunocytochemie. In de onderhavige studie EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine een thymidine analoog) incorporatie en naderhand coderen werd gebruikt om de relatieve proliferatieve toestand van cellen te bepalen op de genezing plaats. Deze benadering kan worden toegepast om de effectiviteit van farmacologische behandelingen testen celproliferatie, gen knock-out of overexpressie, of verschillende celpopulaties identificeren en te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Universitaire Commissie Animal Research aan de Universiteit van Rochester keurden alle dierproeven. Ten-12 weken oude vrouwelijke C57BL / 6J muizen werden gebruikt.
1. Voorbereiding van de dieren voor flexorpees Surgery (~ 15 min)
- Autoclaaf chirurgische instrumenten te steriliseren, draag steriele handschoenen in, en handhaven van een steriele operatiekamer veld.
- Verdoven de muis via intraperitoneale injectie (ip) met een volume van ketamine (80 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) gevonden volgens lichaamsgewicht. Bevestig diepte van sedatie via afwezigheid van teen-snuifje reflex.
- Dien pre-emptieve analgesie (buprenorfine, 0,05-0,1 mg / kg) via subcutane injectie. Solliciteer oogzalf voor de ogen niet uitdrogen.
- Bereid de chirurgische plaats door het knippen van de vacht op de gehele achterste ledematen. Steriliseren de huid door schrobben achtereenvolgens met povidonjood, gevolgd door 70% ethanol, en opnieuw met povidonjood.
- Vind de flexor digitorum longus (FDL) pees, oppervlakkig gezien op de mediale zijde van het kalf. Met behulp van een scalpel een kleine 0,5-1 cm incisie in de huid met micro-schaar om de pees bloot.
- Gebruik een tang om de FDL pees te scheiden van het omliggende weefsel en sporenelementen het aan de myotendinous kruising. Snijd de pees aan deze kruising met veer schaar om het vrij te geven, zorg ervoor dat de posterior tibialis voorkomen.
- Sluit de huid met 5-0 nylon hechtingen.
Opmerking: De FDL transsectie en reparatie (stap 2,4) worden uitgevoerd met behulp van een stereomicroscoop. - Maak een 3 mm incisie over de posterolaterale aspect van de achterpoot met behulp van de lente micro-schaar. Zachtjes trekken de omliggende zachte weefsel en spier met een pincet, en zorg ervoor dat weefselschade te minimaliseren, en identificeren van de FDL pees.
- Voorzichtig verhogen van de FDL pees en volledig doorsnijden met behulp van micro-schaar. Hecht de einden van de pees FDL samen in een gemodificeerde Kessler patroon met 8-0 hechtingen, vermijden drogen van de pees door periodiek bevochtigen met zoutoplossing.
- Vervang zacht weefsel en spieren over de pees, sluit de incisie met 5-0 nylon hechtingen.
- Plaats muizen op een dia warmer set tot 37 ° C, om de lichaamstemperatuur te handhaven totdat uit narcose hersteld.
- Monitor muizen post-operatief op tekenen van stoornissen of infectie, waaronder een verhoogde vocalizing en gegolfde vacht. Injecteer buprenorfine (50 ul / muis) als analgeticum elke 12 uur tot muizen tekenen van pijn of angst niet meer weergegeven.
- Laten genezen muizen gedurende 10 dagen na de operatie over te gaan naar de volgende stappen.
Opmerking: Cellen kunnen op elk tijdpunt postoperatieve worden geoogst. Hier worden 10 dagen gekozen deze representatieve experimenten gezien de relatief hoge cellulariteit van het weefsel op dit moment.
3. Labellng delende cellen (~ 10 min)
- Bereid EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine) oplossing (10 mg / ml in steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS] + 1% dimethylsulfoxide [DMSO] om de oplosbaarheid te verhogen).
- Injecteer muizen met 100 gl edu (50 mg / kg) via ip injectie 24 uur voorafgaand aan offeren.
4. Harvest Cellen voor Cytologie centrifugeren (2,5 uur, ~ 30 min Hands-on Time)
- Bereid 3 mg / ml collagenase I in PBS.
- Euthanaseren muis via kooldioxide stikken met een debiet van niet meer dan 3 l / min, en voeren cervicale dislocatie als secundaire maatregel.
- Zoek de gerepareerde pees behulp stap 2.4 en isoleren peesweefsel door snijden ongeveer 2 mm aan weerszijden van de verwonding met micro-schaar.
- Gehakt weefsel met scalpel in een petrischaal met 1 ml 3 mg / ml collagenase, vervolgens doorgeven mengsel door een 18 G naald meerdere malen te breken van het weefsel. Verzamel mengsel in een 1,5 ml centrifugebuis. Digest peesweefsel gedurende 1 uur bij 37 ° C onder schudden.
- Spin weefsel beneden (300 xg gedurende 5 minuten), aspireren collagenase, dan resuspendeer cellen / weefsels met 500 pi 3% bovine serum albumine (BSA) in PBS en neer te pipetteren meerdere malen.
- Filter celsuspensie door een 70 um cel zeef om puin en grote stukken van de pees en opzij gezet in een 37 ° C incubator te verwijderen.
- Plaats peesweefsel in een andere 1,5 ml centrifugebuis en verfrissen met 1 ml collagenase oplossing pipetteren en om te mengen.
- Incubeer weefsel nog een uur bij 37 ° C onder schudden.
- Spin down gedigereerd peesweefsel (300 g gedurende 5 min), vervolgens resuspenderen in 500 pi 3% BSA in PBS en neer te pipetteren meerdere malen.
- Filter celsuspensie door een 70 um cel zeef, te combineren met ophanging geïsoleerd in 4.3.3, tel dan cellen met een hemocytometer.
- Was de cellen eenmaal met 3% BSA in PBS, vervolgens resuspenderen tot 3-610 x 4/100 ul.
- Bevestig een cytologie trechter om een positief geladen glijbaan en vergrendelen in de slide carrier. Steek de gehele inrichting in een cytologie centrifuge en voeg 100 ul celsuspensie aan de trechter. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten om de cellen te dispergeren op de dia.
5. Immunocytochemie te detecteren Edu (2 uur, ~ 45 min Hands-on Time)
Opmerking: Alle incubatie stappen moeten in het donker worden uitgevoerd om fotobleken van fluoroforen te beperken.
- cellen cirkel met een hydrofobe barrière pen oplossing nodig voor volgende stappen minimaliseren, dan onmiddellijk vast met 150 pi 3% paraformaldehyde in PBS 15 min bij kamertemperatuur (RT).
- Was tweemaal gedurende 5 minuten met 150 ul 3% BSA in PBS.
- Doorlaatbaar cellen met 0,5% Triton X-100 in PBS 20 min bij kamertemperatuur.
- Herhaal wasstap zoals in 5.1.1.
- Bereid EDU reactie cocktail volgens de kit instructies niet meer dan 30 minuten voor gebruik.
- Voeg 150 ul cocktail elke dia, incubeer 30 min bij kamertemperatuur.
- Herhaal wasstap zoals in 5.1.1.
- Incuberen met 150 ui nucleaire tegenkleuring Hoechst33342 verdund 1: 2000 in PBS 30 min bij kamertemperatuur.
- Was tweemaal gedurende 5 minuten met 150 pl 1x PBS.
- Voeg 1-2 druppels anti-fade montage medium om cellen, dan langzaam lager dekglaasje om luchtbellen te voorkomen.
- Sta fixeermiddel een nacht uitharden in het donker bij kamertemperatuur.
- Gebruik duidelijke nagellak aan de dekglaasje aan de dia af te dichten.
- Opname schuift 40x vergroting met behulp van een fluorescentiemicroscoop met excitatie / emissie filters kunnen detecteren DAPI (Hoeschst33342) en Texas Red (Alexa Fluor 594).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flexor digitorum longus (FDL) spieren in de kuit, werkt om de cijfers van de muis achterpoot buigen via de flexorpees (blauwe omtrek in figuur 1A en histologisch figuur 2A), die proximaal loopt van de myotendinous knooppunt en eindigt in de distale vingerkootjes. In dit model van flexorpees genezing, is de FDL pees doorgesneden en gerepareerd in het midden van de voet, proximaal van de vertakking in de cijfers van de achterpoot (rode pijlen, Figuur 1A). Om breuk van de reparatie, die experimentele analyse uitsluit voorkomen, wordt de pees (en aangrenzende spier) gesneden, of vrijgegeven op myotendinous knooppunt (gele pijl in figuur 1B, afgifte figuur 1C). Hoewel deze stap is niet representatief voor de klinische scenario, is het essentieel om de reparatie te beschermen door het verminderen van druk op de verwonding. Figuur 2Deen histologische voorbeeld van een gescheurde flexorpeesherstel tegenover een succesvolle reparatie figuur 2C. In het tweede geval het granulatieweefsel displays sterk toegenomen cellulariteit in vergelijking met de niet-beschadigde pees (figuur 2B), en deze celpopulatie kan daarna verder worden geanalyseerd via cytologie centrifugatie op een glaasje gevolgd door immunocytochemie. Figuur 3 beschrijft de experimentele procedure die wordt gebruikt om te evalueren de proliferatieve toestand van de verzameld van helende pezen 10 dagen na de reparatie via edu incorporatie in nieuw gesynthetiseerde DNA-cellen. Edu etikettering toont derhalve alleen die cellen die actief verspreid tijdens de 24 uur periode na de EDU puls in levende muizen, zoals in figuur 4. Een kwantitatieve beoordeling van proliferatie op het granulatieweefsel van de genezing pees kan dan worden bepaald punt tellen van de gehele celpreparaat. Zo een basislijn van proliferantsoen kan worden vastgesteld op elk tijdstip, en eventuele veranderingen als gevolg van genetische of farmacologische interventies kunnen worden beoordeeld.
Figuur 1 :. muizen Hind Paw Anatomie en identificatie van de Flexor digitorum Longus pees. De flexor digitorum longus (FDL) buigt de cijfers in de muis achterpoot en loopt langs de palmaire aspect van de achterpoot (FDL geschetst in blauw) waar het splitst in de cijfers (rode pijlen) (Figuur 1A). Proximaal, de FDL pees loopt door de tarsale tunnel (zwarte pijl), in de kuit, eindigend bij de myotendinous kruispunt (gele pijl) (Figuur 1B). De release van de pees aan het myotendinous afslag naar breuk te voorkomen is weergegeven in figuur 1C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Vertegenwoordiger histologische afbeeldingen van Un-gewonden, Normaal Healing en Verbroken flexorpees Reparaties De anatomie van de FDL pees in de muizen achterpoot is weergegeven in figuur 2A. Schaal bar vertegenwoordigt 1 mm. In figuren 2B-D, is de pees vergroot bij 8X om uninjured peesweefsel (figuur 2B) vergelijken met een intact en gescheurde reparatie (Figuren 2C en 2D respectievelijk). Hele achterpoot monsters werden gefixeerd in neutraal gebufferde formaline, ingebed in paraffine, gesneden tot 3 um secties en gekleurd met Alcian Blue / hematoxyline / Orange G zoals hiervoor beschreven 13. Inheemse pees wordt geschetst in blauw, is pees / granulatieweefsel samengestelde geschetst in het groen, en zwarte pijlen geven hechtingen. Schaalbalken vertegenwoordigen 200 urn. Please klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Experimentele procedure om te presteren Edu Klik-it chemie Cel Voorbereidingen Op dag 10 na de operatie genezende FDL pezen werden ontleed uit muizen achterpoten.. De pezen werden vervolgens gehakt gedigereerd gedurende twee uur collagenase I bij de cellen dissociëren. De celsuspensie werd gezeefd om vuil te verwijderen en ~ 6 x 10 4 cellen in een monolaag op positief geladen glasplaatjes met een cytologie centrifuge gecentrifugeerd. De cellen werden omcirkeld met een hydrofobe barrière pen en direct daarna gefixeerd met paraformaldehyde. Na permeabilisatie met Triton X-100, werden de cellen behandeld met een edu detectie cocktail, en een klik chemie reactie gebonden Alexa Fluor 594 tot opgenomen Edu. Hoechst 33342 werd gebruikt als een nucleaire vlek en de cellen wer e bij 10-40X geanalyseerd met een fluorescentiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Immunocytochemie Analyse van Cycling EDU-gelabelde cellen tijdens flexorpees Healing Healing FDL pezen werden geoogst uit de achterpoten van muizen die 10 dagen na de operatie en verteerd met collagenase naar een cel suspensie te verkrijgen. Centrifugeren werd gebruikt om deze cellen te verspreiden in een monolaag op dia's, gevolgd door immunocytochemie om de afbeelding Edu oprichting. Figuur 4A en figuur 4B zijn beelden die bij 10x en 40x respectievelijk van de cellen na immunocytochemische analyse. Nucleaire vlek Hoechst 33342 is blauw, en cellen die Edu hebben opgenomen zijn bezaaid met rood. Schaalbalken vertegenwoordigen 50 urn.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De chirurgische procedure voor een muizenmodel van volledige doorsnijding en reparatie van de flexor digitorum longus pees wordt in deze studie. Daarnaast een nieuwe toepassing van concentratie kleine celpopulaties met cytologie centrifuge blijkt, waardoor kwantitatieve immunocytochemische analyse van de cellulaire omgeving tijdens flexorpees genezing. Dit model van flexorpeesherstel toont een reproduceerbare genezende reactie, die kan worden gebruikt om wijzigingen in het genezingsproces behulp knockout modellen of farmacologische actie bepaald. Na de operatie, een ontstekingsreactie begint binnen 24 uur, waarin cellen worden gerekruteerd voor de verwonding en callus van vezelig weefsel begint te vormen. Een proliferatieve fase volgt rond de vierde dag, met sterk toegenomen cellulariteit en overvloedige afzetting van extracellulaire matrix gedesorganiseerde de reparatieplaats, wat leidt tot de vorming van verklevingen tussen 14-21 dagen. Weefselremodellering continues tot dag 35, waarna continuïteit en ordening van de flexor pees wordt hersteld en cellulariteit verminderd 18.
Momenteel zijn er verschillende muismodellen van flexorpeesherstel naast de hier gepresenteerd. Tsubone et al., Beschreven een in vitro model van flexorpees genezing 19. Hoewel dit model veranderingen in genexpressie in de tijd kan bepalen, kan geen verklaring voor de rekrutering van extrinsieke cellen of veranderingen in het ontstekingsproces / cytokine milieu dat voorkomt in vivo. In vivo, werden twee modellen van gedeeltelijke doorsnijding ontwikkeld met behulp van incisie of excisie gebreken 20,21. Meer recent, Wong et al., Met het kenmerk Zone II model flexorpeesletsel in een muizenmodel 22. Dit is een belangrijke ontwikkeling, aangezien het de bijdrage van synoviale omhulsel afgeleide cellen om het genezingsproces te definiëren. Echter geen kwantificeerbare veranderingen in glijden functie zijn beschreven met behulp van dit model. Elk model heeft zijn eigen voordelen en beperkingen die moeten worden overwogen, met inbegrip van technische gemak, klinische relevantie en anatomie. Een belangrijke beperking van de hier beschreven model is dat de genezing pees voorafgaand aan de evaluatie kunnen scheuren, waardoor deze onbruikbaar wordt voor verdere analyse. Het oogsten van voldoende cellen wordt haalbaar gemaakt onder deze omstandigheden, en eventuele histochemische analyse niet levensvatbaar is, als een gescheurde pees niet de standaard genezingsproces hierboven beschreven volgen. Het loslaten van de pees FDL proximaal verlagen druk op de genezende pees is derhalve een belangrijke stap voor de preventie, hoewel het niet klinisch relevant. Het uitvoeren van de operatie verlaagt eenzijdig ook de snelheid van de breuk. Een andere beperking is het onvermogen om de bijdrage van peri-tendineuze mantel cellen volgen, de synoviale bekleding niet het segment FDL pees die geblesseerd dit model omringen.
jove_content "> Een belangrijke functie van deze flexorpeesherstel model is dat het evalueren van de cellen op de genezing plaats. Immunofluorescentie / immunohistochemie (IHC) is een gemeenschappelijke biologische techniek die kan worden gebruikt om deze cellen te karakteriseren. Terwijl IHC op unieke wijze geschikt voor het bepalen van ruimtelijke informatie is grotendeels een kwalitatieve methode. Veranderingen in weefsels of cellen samenstelling, de diepte van het weefsel kan worden gemist, en kwantificering van populaties moeilijk. Flowcytometrie vertegenwoordigt een ideale benadering te definiëren, kwantificeren en eventueel isoleren cel populatie tijdens de genezing. echter, de isolatie en de spijsvertering van genezing peesweefsel van dit model levert een zeer laag aantal cellen voor flowcytometrische analyse (1-2 x 10 5 gemiddeld uit elke muis) en fixatie / permeabilisatie stappen voor de detectie van intracellulaire markers vermindert dit aantal verder. met cytologie centrifugeren om de geïsoleerde cellen geconcentreerd, gevolgd door immunocytocheMistry, biedt een manier om deze kleine cel populaties te karakteriseren. Een belangrijk voordeel van deze techniek is dat er geen noodzaak om pool monsters samen om voldoende cellen te verkrijgen; daarom elke muis vertegenwoordigt een individueel monster voor analyse. Een belangrijke overweging bij het genereren van deze celpreparaten handhaaft de samenhang in het weefsel geoogst voor analyse. Omringende spieren en fascia kan houden aan de granulatieweefsel en moet voorzichtig verwijderd worden ontleed. Aangezien deze werkwijze omvat minimale verwerking van de cellen voorafgaand aan fixatie op objectglaasjes, behoudt de meeste geïsoleerde cellen voor verdere analyse. Hierdoor kan vrijwel de gehele populatie van cellen die het weefsel op de hechting reparatieplaats een kwantitatieve via immunocytochemie. In deze studie wordt edu opname door prolifererende cellen gebruikt om de toepassing van deze cytologische techniek tonen, maar het kan ook gebruikt worden voor meer complexe en diepgaande karakterisering of de heterogene celpopulaties betrokken bij flexorpees genezing. Toekomstige toepassingen van deze techniek kan leiden tot meer gedetailleerde karakterisatie van de celpopulaties betrokken bij genezing pees, omdat het zorgt voor de bepaling co-lokalisatie van cellulaire merkers in de cellen verbonden aan de granulatieweefsel bij genezing pees.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Amerikaanse Vereniging voor Heelkunde van het Hand Pilot Award en NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (naar AEL) en NIAMS / NIH P30AR061307.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
